Çoklu Floresan Boyama ve Doku Temizleme Yaklaşımları Kullanarak Tüylü ve Glabrous Cilt İnnervasyonunu 3D Desende Göstermek

Özet

Doku kesitlerinin kalınlığı deri innervasyonunun morfolojik çalışmasını sınırladı. Mevcut protokol, konfokal mikroskopi altında kalın 300 μm doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için benzersiz bir doku temizleme tekniğini tanımlamaktadır.

Özet

Deri innervasyonu periferik sinir sisteminin önemli bir parçasıdır. Kutanöz sinir liflerinin incelenmesi hızla ilerlemiş olsa da, dağılım ve kimyasal özelliklerinin anlaşılmasının çoğu, ince doku kesitlerinde geleneksel histokimyasal ve immünohistokimyasal boyamadan kaynaklanmaktadır. Doku temizleme tekniğinin gelişmesiyle birlikte daha kalın doku kesitlerinde kutanöz sinir liflerinin görüntülenmesi mümkün hale gelmiştir. Mevcut protokol, iki tipik kıllı ve göz kamaştırıcı cilt bölgesi olan sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisinden 300 μm kalınlığında doku kesitlerinde çoklu floresan boyamasını tanımlamaktadır. Burada, kalsitonin geni ile ilişkili peptid duyusal sinir liflerini etiketlerken, faloidin ve lenfatik damar endotelyal hyaluronan reseptörü 1 sırasıyla kan ve lenfatik damarları etiketler. Konfokal mikroskop altında, etiketli duyusal sinir lifleri tamamen daha uzun bir mesafeden takip edildi, derin kutanöz tabakada demetler halinde ve yüzeysel tabakada serbest stilde çalıştı. Bu sinir lifleri kan damarlarına paralel olarak koştu veya onları çevreledi ve lenfatik damarlar tüylü ve göz kamaştırıcı ciltte üç boyutlu (3D) bir ağ oluşturdu. Mevcut protokol, cilt innervasyonunu incelemek için metodoloji perspektifinden mevcut geleneksel yöntemlerden daha etkili bir yaklaşım sunmaktadır.

Giriş

Vücudun en büyük organı olan ve çevreye anahtar bir arayüz görevi gören deri, birçok sinir lifi tarafından yoğun bir şekilde innerve edilir ^1,2,3. Deri innervasyonu daha önce tüm deri ve doku kesitlerinde boyama gibi çeşitli histolojik yöntemlerle yaygın olarak çalışılmasına rağmen, ^4,5,6, kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı etkili gösterimi hala bir zorluktur ^7,8. Bu göz önüne alındığında, mevcut protokol, kalın doku bölümünde kutanöz sinir liflerini daha net sergilemek için benzersiz bir teknik geliştirmiştir.

Kesitlerin kalınlığına göre sınır nedeniyle, innerve deri sinir liflerinin gözlemlenmesi, elde edilen görüntü bilgisinden kalsitonin gen ile ilişkili peptid (CGRP) sinir lifleri ile lokal doku ve organlar arasındaki ilişkiyi doğru bir şekilde tasvir edecek kadar kesin değildir. 3D doku temizleme teknolojisinin ortaya çıkışı bu sorunu çözmek için uygulanabilir bir yöntem sağlar ^9,10. Doku temizleme yaklaşımlarının hızla gelişmesi, son zamanlarda doku yapılarını, tüm organları, nöronal projeksiyonları ve bütün hayvanları incelemek için birçok araç sunmuştur¹¹. Şeffaf cilt dokusu, kutanöz sinir liflerini görselleştirmek için veri elde etmek için konfokal mikroskopi ile çok daha kalın bir bölümde görüntülenebilir.

Bu çalışmada, bir sıçan arka ayağının plantar ve dorsal derisi, tüylü ve göz kamaştırıcı cildin iki hedef bölgesi olarak seçilmiştir ^3,4,7. Kutanöz sinir liflerini daha uzun bir mesafede izlemek için, cilt dokusu immünohistokimyasal ve histokimyasal boyama için 300 μm kalınlığında dilimlendi ve ardından doku temizleme tedavisi uygulandı. CGRP, duyusal sinir liflerini^12,13 olarak etiketlemek için kullanıldı. Ek olarak, doku arka planındaki kutanöz sinir liflerini vurgulamak için, sırasıyla ^14,15 kan damarlarını ve lenfatik damarları etiketlemek için falloidin ve lenfatik damar endotelyal hyalurondan reseptör 1 (^LYVE1) daha fazla kullanılmıştır.

Bu yaklaşımlar, kutanöz sinir liflerinin yüksek çözünürlüklü bir görünümünü göstermek ve ayrıca derideki sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar arasındaki uzamsal korelasyonu görselleştirmek için uygulanabilecek basit bir yöntem sağladı; bu, normal cildin homeostazını ve patolojik koşullar altında kutanöz değişikliği anlamak için çok daha fazla bilgi sağlayabilir.

Protokol

Bu çalışma, Çin Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Akupunktur ve Moxibustion Enstitüsü Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (referans numarası D2018-04-13-1). Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) uyarınca gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada üç yetişkin erkek sıçan (Sprague-Dawley, ağırlık 230 ± 15 g) kullanılmıştır. Tüm hayvanlar, kontrollü sıcaklık ve nem ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde barındırıldı ve yiyecek ve suya serbest erişime izin verildi.

1. Perfüzyon ve numune hazırlama

1. Ötanazi indüklemek için sıçana intraperitoneal olarak 250 mg / kg tribromoetanol çözeltisi (bakınız Malzeme Tablosu) enjekte edin.
2. Solunum durduktan sonra, sıçanın göğüs boşluğunu açmak için paslanmaz çelik cerrahi makas kullanın. Sol kardiyak ventrikül¹³ üzerinden 3 mL/dak oranında perfüze etmek için 20 G iğne kullanın ve 100 mL% 0.9 normal salin ve ardından 0.1 M fosfat tamponunda (PB, pH 7.4) 250-300 mL% 4 paraformaldehit kullanın (Şekil 1A, B).
3. Perfüzyondan sonra, dorsum derisini ve tabanını arka pençeden çıkarmak için bir neşter kullanın.
   1. Dondurulmuş kesit gerektiren numuneler için, dokuları 2 saat boyunca 0.1 M PB'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin; daha sonra dokuları 0.1 M PB'de% 25 sakkarozda 4 ° C'de 24 saatten fazla bir süre kriyoprotect
   2. Doku temizliği gerektiren kalın kesitli numuneler için, dokuları 2 saat boyunca 1x fosfat tamponlu salin (1x PBS) içinde% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin; daha sonra dokuları 4 °C'de 1x PBS'de kriyoproteksiyon yapın (Şekil 1C-E).

2. CGRP, faloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama ve ardından doku temizleme tedavisi

NOT: CGRP, faloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama, doku temizleme tedavisini takiben 300 μm kalınlığındaki doku kesitlerinde tüylü ve göz kamaştırıcı derideki sinir liflerini, kan damarlarını ve lenfatik damarları ortaya çıkarmak için uygulandı.

1. Agaroz çözünene kadar bir mikro fırında 2 dakika ısıtılarak 1x PBS'de% 2 agaroz hazırlayın (bkz.
2. Yıkadıktan sonra, cilt dokularını 37 ° C'de% 2 agaroz içine gömün ve soğutma için buz kutusunun içine yerleştirin (Şekil 1F, G).
3. Titreşimli mikrotom üzerine monte edilmiş dokuyu buzlu suyla sabitleyin ve enine yönde 500 μm kalınlığında dilimleyin. Titreşim dilimleyiciyi ayarlamak ve dilimlemeyi bitirmek için aşağıdaki parametreleri kullanın: hız, 0,50 mm/sn ve genlik, 1,5 mm (Şekil 1H-K).
4. Dilimledikten sonra, agarozu bölümlerden çıkarın ve 1x PBS (pH 7.4) içeren altı delikli bir plakada saklayın (Şekil 1L).
5. Doku kesitlerini 4 °C'de gece boyunca 1x PBS'de (TriX-PB) %2 Triton X-100 çözeltisi içinde inkübe edin. Aşağıdaki yordam için Şekil 2'ye bakın.
6. Doku bölümlerini bloke edici tampona yerleştirin ve 4 ° C'de gece boyunca çalkalayıcı üzerinde 72 rpm'de döndürün.
   NOT: Bloke edici tampon bileşimi 1x PBS'de %10 normal eşek serumu, %1 Triton-X 100 ve %0,2 sodyum aziddir (bkz.
7. Doku kesitlerini, mikrosantrifüj tüpündeki seyreltme tamponunda fare monoklonal anti-CGRP (1:500) ve koyun poliklonal anti-LYVE1 antikorunun (1:500) birincil antikorlarını içeren çözeltiye aktarın (bkz.
   NOT: Seyreltme tamponu bileşimi, 1x PBS'de% 1 normal eşek serumu,% 0.2 Triton-X 100 ve% 0.2 sodyum aziddir.
8. Doku bölümlerini oda sıcaklığında yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, ardından yıkama tamponunda 4 °C'de gece boyunca çalkalayıcıda tutun.
   NOT: Yıkama tamponu bileşimi 0,1 M PB'de (pH 7,4) %0,2 Triton-X 100'dür.
9. Ertesi gün, doku kesitlerini eşek anti-fare IgG H & L Alexa-Flour488 (1:500) ve eşek anti-koyun IgG H & L Alexa-Flour405 (1:500) ve Alexa-Flour594 falloidin (1:1000) (bkz.
10. Doku kesitlerini, oda sıcaklığında 1 saat, iki kez yıkama tamponu ile altı delikli bir plakada yıkayın. Doku bölümlerini çalkalayıcı üzerindeki yıkama tamponunda gece boyunca 4 ° C'de tutun.
11. Doku kesitlerini doku temizleme reaktifine aktarın ( bakınız Malzeme Tablosu, hacmi numune hacminden beş kat daha fazlaydı) ve çalkalayıcı üzerinde 60 rpm'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca yavaşça döndürün.
    NOT: Bu tedaviden sonra doku kesitleri netleşir (Şekil 2B).
12. Temizlenmiş dokuları slayta monte edin, dokuları bir ara parça ile daire içine alın ve boşluğu taze doku temizleme reaktifi ve örtü kayması ile yapıştırın.

3. Geleneksel yaklaşımı takiben CGRP, falloidin ve LYVE1 ile üçlü floresan boyama

NOT: Bir karşılaştırma olarak, aynı boyama geleneksel teknikler izlenerek 30 μm kalınlığında doku kesitlerinde de gerçekleştirilmiştir.

1. Doku kesitlerini enine yönde bir mikrotom üzerinde 30 μm'de dilimleyin ve slayta monte edin.
2. 0,1 M PB'de %3 normal eşek serumu ve %0,3 Triton X-100 içeren blokaj çözeltisi ekleyin ve bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
3. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve fare monoklonal anti-CGRP (1:500) ve koyun poliklonal anti-LYVE1 antikorunun (1:500) birincil antikorlarını içeren çözelti ile bölümleri, 4 ° C'de gece boyunca seyreltme tamponunda inkübe edin.
4. Ertesi gün, doku bölümlerini 0.1 M PB (pH 7.4) ile üç kez yıkayın, eşek anti-fare IgG H & L Alexa-Flour488 (1: 500) ve eşek anti-koyun IgG H & L Alexa-Flour405 (1: 500) ve Alexa-Flour594 falloidin (1: 1000) sekonder antikorlarını içeren karışık çözeltiyi ekler ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
5. Mikroskobik gözlemden önce, bölümleri üç kez 0.1 M PB (pH 7.4) içinde yıkayın, ardından% 50 gliserin içindeki kapaklarla örtün.

4. Görüntüleme ve analizler

1. Lekeli örnekleri floresan mikroskop altında gözlemleyin ve ardından konfokal mikroskop kullanarak görüntüleri alın.
2. Her 300 μm kalınlığındaki bölümden her biri 10 μm karede 30 görüntü (Z-yığınları ) yakalayın ve konfokal mikroskopi sisteminin görüntü işlemcisini kullanarak tek bir odak içi görüntüyü entegre edin (bkz.
   1. Üç boyutlu (3B) analiz için konfokal kurulumun görüntü işleme yazılımında aşağıdaki adımları gerçekleştirin: Başlangıç Odak Düzlemini Ayarlama | Bitiş odak düzlemi | ayarlama Adım boyutu | ayarlama Derinlik Deseni | Seçin Görüntü Yakalama | Z serisi.
      NOT: Mavi floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 401 nm ve 421 nm idi. Yeşil floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 499 nm ve 519 nm idi. Kırmızı floresan sinyallerinin uyarılması ve emisyon dalga boyları sırasıyla 591 nm ve 618 nm idi. 152 μm, konfokal iğne deliğinin çapıdır (10x objektif lens, NA: 0,4). Görüntü yakalama çözünürlüğü 1024 × 1024 piksel idi.
3. Geleneksel numuneler için (adım 3), her 30 μm kalınlığındaki bölümden 1 μm karede 30 görüntü (Z-yığınları) yakalayın ve bu görüntüleri yukarıda belirtildiği gibi ele alın (adım 4.1-4.2).
4. Görüntü işleme sistemi ile görüntüleri 3D rekonstrüksiyon deseninde gösterin.
5. Z-yığını konfokal görüntüleri Imaris 9.0'a içe aktararak 3B rekonstrüksiyonlar gerçekleştirin (hücre görüntüleme yazılımı, bkz. Malzeme Tablosu) ve leke yoğunluklarına göre yüzey işlemeleri oluşturun: Yeni yüzeyler ekleyin | Kaynak Kanal | Surface Detail (Yüzeyler Ayrıntısı) | pürüzsüz seçeneğindeki parametreleri belirleyin Mutlak Yoğunluk |'nin eşik seçeneğindeki parametreleri belirleyin Yüzeyleri Sınıflandırma | Bitirin.
6. Hücre görüntüleme yazılımı ile pozitif sinir liflerinin yüzey alanında veri elde edin. İşlenen görüntü | İstatistik | Detaylı | Belirli Değerler | Hacim.

Sonuçlar

Üçlü floresan boyama işleminden sonra, sinir lifleri, kan damarları ve lenfatik damarlar, tüylü ve göz kamaştırıcı deride sırasıyla CGRP, faloidin ve LYVE1 ile açıkça etiketlendi (Şekil 3,4). Temizleme tedavisi ile, CGRP-pozitif sinir lifleri, faloidin-pozitif kan damarları ve LYVE1-pozitif lenfatik damarlar, cildin tüm yapısal bilgisini elde etmek için daha derin bir derinlikte görüntülenebilir (Şekil 3). Bu doku yapı...

Tartışmalar

Bu çalışma, deri innervasyonunu daha iyi anlamak için daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan ve 3D görünüm ile daha kalın doku kesitlerinde immünofloresan kullanılarak tüylü ve göz kamaştırıcı derideki kutanöz sinir liflerinin ayrıntılı bir gösterimini sunmaktadır. 1-2 güne kadar antikor inkübasyon süresi ve gece boyunca temizleme işlemi önemlidir. Bu iki önemli adım, kalın kesitlerin immünofloresan boyama etkisini doğrudan etkiler. Hepsi kalın kesitler için uygun olmayan antikor...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate-buffered saline	Solarbio Life Sciences	P1020	pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Life Science	T48402-5G
Confocal fluorescence microscopy	Olympus Corporation	Fluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488	Abcam plc.	ab150105
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405	Abcam plc.	ab175676
EP tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.	615001	1.5 mL
Freezing stage sliding microtome system	Leica Biosystems	CM1860
Imaris Software	Oxford Instruments	v.9.0.1
IRIS standard scissor	WPI (World Precision Instruments Inc.)	503242
iSpacer	SunJin Lab co.	IS005
Micro forceps-Str	RWD	F11020-11
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody	Santa cruz biotechnology, Inc.	sc-57053
Neutral buffered Formalin	Solarbio Life Sciences	G2161	10%
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 mL
Peristaltic pump	Longer Precision Pump Co., Ltd	BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A12381
RapiClear 1.52 solution	SunJin Lab co.	RC152001	10 mL
Regular agarose	Gene Company Limited	G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str	RWD	F13038-12
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody	R&D Systems, Inc.	AF7939
Six-well plate	Corning Incorporated	3335
Sodium azide	Sigma Life Science	S2002	25 g
Sucrose	Sigma Life Science	V900116	500 g
Super Glue	Henkel AG & Co.	Pattex 502
Surgical Handles	RWD	S32003-12
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 mL
Urethane	Sigma Life Science	U2500	500 g
VANNAS spring scissors	RWD	S1014-12
Vibratory microtome	Leica Biosystems	VT1200S