3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Özet

Mevcut protokol, 3D baskılı damga benzeri bir cihaz kullanarak uygun maliyetli bir şekilde büyük ölçekte doku sferoidleri üretmek için bir tekniği açıklamaktadır.

Özet

3D hücre kültüründeki ilerlemeler, doku sferoidleri gibi fizyolojik olarak daha ilgili in vitro modeller geliştirmiştir. Sferoid olarak yetiştirilen hücreler, in vivo ortama benzeyen daha gerçekçi biyolojik tepkilere sahiptir. Avantajları nedeniyle, doku sferoidleri, geniş bir biyoteknolojik uygulanabilirlik yelpazesine sahip üstün, daha güvenilir ve daha öngörücü çalışma modellerine doğru yükselen bir eğilimi temsil etmektedir. Bununla birlikte, doku sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini sağlayabilen tekrarlanabilir platformlar, potansiyellerini tam olarak keşfetmek ve artırmak için karşılanmamış bir ihtiyaç haline gelmiştir. Burada, homojen doku sferoidlerinin büyük ölçekli üretimi, düşük maliyetli ve zaman açısından etkin bir metodoloji kullanılarak rapor edilmektedir. 6 oyuklu plaka başına 4.716'ya kadar sferoid üretmek için 3D baskılı damga benzeri bir cihaz geliştirilmiştir. Cihaz, fotokürlenebilir bir reçine kullanılarak stereolitografi yöntemiyle üretilir. Son cihaz, 1,3 mm yüksekliğe ve 650 μm genişliğe sahip silindirik mikro pimlerden oluşur. Bu yaklaşım, tek tip şekil ve boyuta ve %>95 hücre canlılığına sahip homojen sferoidlerin ve birlikte kültürlenmiş sferoidlerin hızlı bir şekilde üretilmesine izin verir. Ayrıca, damga benzeri cihaz, farklı boyutlardaki kuyu plakaları ve Petri kapları için ayarlanabilir. Kolayca sterilize edilir ve uzun süre tekrar kullanılabilir. Homojen doku sferoidlerinin verimli ve büyük ölçekli üretimi, doku mühendisliği, ilaç geliştirme, hastalık modelleme ve isteğe bağlı kişiselleştirilmiş tıp gibi birçok endüstri alanı için çevirilerinden yararlanmak için çok önemlidir.

Giriş

Doku sferoidleri, dış kuvvetler olmadan kendi kendine bir araya gelen hücre süspansiyonları tarafından oluşturulan 3 boyutlu mikro dokulardır¹. Bu sferoidler, insan fizyolojik sisteminin temel özelliklerine benzerlikleri nedeniyle biyofabrikasyon protokollerinde yaygın olarak kullanılmaktadır ^2,3. Doku sferoidleri, geleneksel tek katmanlı hücre kültüründen daha benzer metabolizma, hücre iskeleti dinamikleri, hücre canlılığı ve metabolik ve sekresyon aktivitesi sağlar¹. Füzyon yetenekleri nedeniyle, gelişmiş biyolojik alaka düzeyine sahip karmaşık doku mühendisliği yapıları oluşturmak için yapı taşları (örneğin, biyo-baskı protokolleri) olarak da kullanılabilirler ^4,5.

Biyolojik ilgileri nedeniyle, doku sferoidleri, doku mühendisliği, ilaç geliştirme, hastalık modelleme ve nanotoksikolojik değerlendirme gibi çeşitli protokoller için biyoteknolojik bir araç olarak kullanılmış, zaman, alan maliyetleri ve hayvan testlerini azaltmıştır 3,6,7,8. Bununla birlikte, doku sferoidlerinin potansiyelini tam olarak keşfetmek ve bunlardan yararlanmak için, büyük ölçekli üretimlerini hedefleyen güvenilir ve tekrarlanabilir yöntemler son derece gereklidir ve bunlar devam eden bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Asılı damla, kaplanmış u şeklindeki dip kuyuları, mikroakışkanlar ve polimerik bir matris ^9,10 kullanma gibi çeşitli metodolojiler sferoidler üretir. Bu metodolojiler küresel üretim pazarının yolunu açmış olsa da, hala karmaşık, zaman alıcı, emek yoğun veya pahalıdır¹⁰.

Mevcut protokol, düşük maliyetli ve zaman etkin bir metodoloji kullanarak homojen doku sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini rapor etmektedir. 6 oyuklu plaka başına 4.716'ya kadar sferoid üretmek için 3D baskılı damga benzeri bir cihaz geliştirdik. Ayrıca, damga benzeri cihaz, farklı hücre kültürü plakaları için uygun, kuyu başına daha fazla sferoid üretecek şekilde uyarlanabilir. Kolayca sterilize edilebilir ve uzun süre tekrar kullanılabilir. Homojen doku sferoidlerinin verimli ve büyük ölçekli üretimi, kullanımlarını kliniklere çevirmek ve doku mühendisliği, ilaç geliştirme, hastalık modelleme ve isteğe bağlı kişiselleştirilmiş tıp gibi birçok endüstri alanına katkıda bulunmak için çok önemlidir.

Protokol

Bu çalışma için L929 hücre hattı, fare fibroblastları kullanıldı. Damga benzeri 3D baskılı biyocihaz, ticari bir kaynaktan elde edildi (bkz. Protokol boyunca iyi hücre kültürü uygulamaları ve steril teknikler izlendi. Üretilen cihaz %70'lik alkol ile silinerek ve 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılarak sterilize edildi. Hücre kültürü ortamı ve çözeltileri, hücreler veya doku sferoidleri ile temas etmeden önce 37 °C'ye ısıtıldı. Protokolün şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Damga benzeri cihazdan yapışmayan kalıpların hazırlanması

1. Aşağıdaki adımları izleyerek% 2 (a / h) agaroz jeli hazırlayın.
   1. Agaroz tozunu fosfat tamponlu salin (1x PBS) içinde seyreltin ve elde edilen süspansiyonu dairesel hareketlerle homojenize edin.
      NOT: Bu çözelti bir cam şişeye yerleştirilebilir. Bu adımda, agaroz çözeltisi yarı saydam olmayacaktır.
   2. Cam şişeyi mikrodalgaya koyun ve 30 saniye bekletin. Her 5 saniyede bir mikrodalgayı durdurun, cam şişeyi çıkarın ve çözeltiyi dairesel hareketlerle manuel olarak homojenize edin. Isıtma işleminin, çözelti sıvı-berrak bir duruma ulaşana kadar gerçekleştirilmesi gerekir.
      NOT: Mikrodalga alternatifi olarak bir sıcak plaka da kullanılabilir. Isıtma işleminden sonra çözelti yarı saydam/berrak olmalıdır.
   3. Deney için planlanan 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL agaroz çözeltisi ekleyin.
   4. ~ 15 dakika veya agaroz katılaşana kadar bekleyin.
      NOT: Katılaşma süresini azaltmak için bir soğutma plakası kullanılabilir.
   5. 1-2 mL agaroz solüsyonu ekleyin ve cihazı yavaşça sıvı agarozun üzerine yerleştirin.
      NOT: Agaroz-cihaz arayüzünde hava kabarcıklarını önlemek için cihazın yerleşimi dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
   6. ~ 30 dakika veya agaroz katılaşana kadar bekleyin.
      NOT: Katılaşma süresini azaltmak için bir soğutma plakası kullanılabilir.
   7. Cihazı agarozdan yavaşça çıkarın.
      NOT: Kaldırma işlemi çok önemlidir. Agaroz özelliklerini sağlam tutmak için dikkatli bir şekilde çıkarılmalıdır; Aksi takdirde, agaroz bozulabilir.
   8. 2 mL DMEM ortamı ekleyin, 10 dakika bekleyin, ortamı atın ve yeni DMEM ile değiştirin. İyiliği düzgün bir şekilde yıkamak için bunu üç kez tekrarlayın.
   9. 2 mL DMEM ekleyin ve 6 oyuklu plakayı hücre tohumlanana kadar bir inkübatöre (% 5 CO₂ ve% 80 nemde 37 ° C'de) yerleştirin (Şekil 2A-F, Ek Video 1).

2. Doku sferoidlerinin oluşumu

NOT: Farklı hücre soyları farklı yapışma özelliklerine sahiptir. Bu nedenle, bu metodolojiyi kullanarak, bazı hücre türleri doku sferoidlerini düzgün bir şekilde oluşturmayabilir.

1. Geleneksel tek tabakalı kültürü takiben hücreleri büyütün (yani, hücreleri% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 μg / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş düşük glikozlu DMEM kullanarak hücre kültürü şişelerinde büyütün) (bkz. Hücreleri %5'lik bir CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de tutun ve birleşme oranının %80'ine ulaşana kadar izleyin.
2. İstenilen birleşmeye ulaştıktan sonra, hücreleri 1x PBS ile yıkayın.
   NOT: 25 cm'lik^2'lik mataralar için 5 mL, 75 cm'lik^2'lik mataralar için 10 mL, 150 cm'lik^2'lik mataralar için 15 mL kullanılması tavsiye edilir.
3. Ayrışma enzimini ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ve% 80 nemde 2-5 dakika inkübe edin.
   NOT: Bu çalışmada ayrışma enzimi olarak 0.78 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ile %0.125 tripsin kullanılmıştır (bkz.
4. Hücrelerin hücre kültürü şişelerinden ayrılmasını gözlemleyin ve hücre ayrışma enzimini nötralize etmek için FBS ile desteklenmiş bir büyüme ortamı ekleyin.
   NOT: Bu çalışma için, düşük glukozlu DMEM ( Materyal Tablosuna bakınız)% 10 FBS ile desteklenmiş olarak kullanılmıştır.
5. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Ardından, hücreleri manuel olarak sayın.
6. Tüp başına 50 x 10⁵ hücre alın ve 5 mL 1x PBS ekleyin.
   NOT: Ekilen hücre sayısı, nihai doku sferoid çapını etkiler. Bu nedenle, daha büyük çaplı doku sferoidleri oluşturmak için hücre sayısı artırılabilir.
7. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
8. Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın, 1 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve çözeltiyi homojenize edin.
   NOT: Bu çalışmada, %10 FBS, 100 μg/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş, düşük glikozlu tam bir DMEM kültür ortamı kullanılmıştır.
9. 6 oyuklu plakadan (adım 1.1.9) 2 mL ortamı çıkarın ve 3D baskılı biyocihaz tarafından oluşturulan agaroz kalıbının merkezine 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin (adım 1.1.7). Mikro rezeksiyonlarda hücreler çökelene kadar bekleyin (~ 20-30 dakika) ve kuyucuğa dikkatlice 1 mL hücre kültürü ortamı ekleyin.
   NOT: Bu adımda ekstra dikkatli olmak gerekir. Ortamın nazikçe eklenmesi, pipet ucunun kuyu duvarına yakın yerleştirilmesi ve küçük miktarlarda dağıtılması önerilir.
10. Doku sferoidlerinin oluşması için 6 oyuklu plakayı inkübatöre (%5 CO₂ ve %80 nemde 37 °C'de) yerleştirin (hücre tipine bağlı olarak yaklaşık 24-48 saat) (Şekil 3).
    NOT: Farklı hücre tipleri (örneğin, kanser hücreleri, birincil hücreler) farklı kendi kendine montaj kinetiğine sahiptir¹¹.

Sonuçlar

3D baskılı damga benzeri cihaz kullanılarak homojen mikro rezeksiyonların oluşturulması
3D baskılı damga benzeri cihaz, fotokürlenebilir bir reçine kullanılarak stereolitografi yöntemi¹² ile başarıyla üretildi (Şekil 2A). Son cihaz, 1.3 mm yüksekliğinde ve 650 μm genişliğinde silindirik mikro pimlerden oluşuyordu (Şekil 2A). Yapışık olmayan mikro rezeksiyonlar...

Tartışmalar

Mevcut protokol, doku sferoidlerinin büyük ölçekli üretimi için basit, hızlı ve ucuz bir yöntemi tanımlamaktadır. Ana kalıp olarak damga benzeri bir 3D baskılı cihaz kullanıldı ve bu da 6 oyuklu plaka başına 4.716'ya kadar sferoid üretti. Sferoid olarak yetiştirilen hücrelerin, in vivo ortama çok benzeyen daha gerçekçi biyolojik tepkilere sahip olduğu gösterilmiştir¹. Avantajları nedeniyle, doku sferoidleri üstün, daha güven...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well plate	Merck	CLS3516
Agarose	Promega	V3121
Biodevice	Bioedtech
Biological Safety Cabinet	ThermoFisher	51029701
Centrifugue	ThermoFisher	75004031
Corning 50 mL centrifuge tubes	Merck	CLS430829-500EA
Corning cell culture flasks surface area 75 cm2	Merck	CLS430641
Draft Resin	FormLabs	FLDRBL01
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - low glucose	Merck	D6046
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
Form 2	FormLabs
Incubator	ThermoFisher	51033782
L929 cell lines	Stablished in the lab
Penicillin and Streptomycin (PS)	ThermoFisher	15140122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Merck	806552
Trypsin with EDTA	Merck	T3924