Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Özet

Kütle spektrometrisine dayalı proteomik analiz ile bu biyokimyasal saflaştırma yöntemi, Alzheimer hastalığını önleme hedeflerinin belirlenmesini hızlandırabilecek amiloid fibril çekirdeklerinin sağlam karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Özet

Proteinli fibriller inklüzyonlar çoklu nörodejeneratif hastalıkların anahtar patolojik özellikleridir. Alzheimer hastalığının (AD) erken evrelerinde, amiloid-beta peptitleri, hücre dışı boşlukta, yavaş yavaş büyüyen ve büyük amiloid plaklara olgunlaşan tohumlar gibi davranan protofibriller oluşturur. Bu temel anlayışa rağmen, beyindeki amiloid fibril yapısı, bileşimi ve biriktirme kalıpları hakkındaki mevcut bilgiler sınırlıdır. En büyük engellerden biri, yüksek oranda saflaştırılmış amiloid fibrillerinin beyin ekstraktlarından izole edilememesi olmuştur. Afinite saflaştırma ve lazer yakalama mikrodiseksiyon tabanlı yaklaşımlar daha önce amiloidleri izole etmek için kullanılmıştır, ancak geri kazanılabilecek az miktarda malzeme ile sınırlıdır. Bu yeni, sağlam protokol, sodyum dodesil sülfat (SDS) çözünürlüğü kullanılarak sodyum dodesil sülfat (SDS) çözünürlüğü kullanılarak amiloid plak çekirdeklerinin biyokimyasal saflaştırılmasını açıklar ve sakkaroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ve ultrasonikasyon ile AD hastalarından ve AD model beyin dokularından oldukça saf fibriller verir. Saflaştırılmış malzemenin kütle spektrometresi (MS) tabanlı aşağıdan yukarıya proteomik analizi, amiloid fibrillerin neredeyse tüm birincil protein bileşenlerini tanımlamak için sağlam bir stratejiyi temsil eder. Amiloid koronadaki proteinlerin önceki proteomik çalışmaları, beklenmedik derecede büyük ve işlevsel olarak çeşitli protein koleksiyonunu ortaya çıkarmıştır. Özellikle, saflaştırma stratejisini rafine ettikten sonra, birlikte saflaştırıcı proteinlerin sayısı, izole SDS çözünmeyen malzemenin yüksek saflığını gösteren 10 kattan fazla azaltılmıştır. Negatif boyama ve immüno-altın elektron mikroskopisi, bu preparatların saflığının doğrulanmasına izin verdi. Bu proteinlerin amiloid kapanımlarına birikmesine katkıda bulunan mekansal ve biyolojik özellikleri anlamak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Birlikte ele alındığında, bu analitik strateji amiloid biyolojisinin anlaşılmasını arttırmak için iyi konumlandırılmıştır.

Giriş

Amiloid, bazıları patolojik değişikliklere yol açan çeşitli protein panellerinde bulunan son derece kararlı bir supramoleküler düzenlemedir¹. Hücre içi veya hücre dışı amiloid agregaların birikmesi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda gözlenir². Amiloid agregaları heterojendir ve çok sayıda protein ve lipit ile zenginleştirilmiştir³. Son yıllarda, amiloid proteomuna olan ilgi, temel ve translasyonel sinirbilimciler arasında önemli bir ilgi yaratmıştır. Amiloid agregalarını fare ve ölüm sonrası insan beyin dokularından çıkarmak ve saflaştırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu, immünopresipitasyon, desellülarizasyon ve amiloid agregaların biyokimyasal izolasyonu, amiloid plakları, fibriller ve oligomerleri çıkarmak ve saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir 4,5,6,7. Bu çalışmaların çoğu, yarı kantitatif MS kullanarak sıkıca paketlenmiş bu fibriller birikintilerin protein bileşimini belirlemeye odaklanmıştır. Bununla birlikte, mevcut sonuçlar tutarsızdır ve daha önce bildirilen şaşırtıcı derecede çok sayıda ortak saflaştırıcı proteinin yorumlanması zordur.

AD ve AD fare modeli beyinlerde amiloid çekirdek proteomunu tanımlayan mevcut literatürün birincil sınırlaması, saflaştırılmış materyalin yönetilemeyen sayıda birlikte saflaştırıcı protein içermesidir. Bu yöntemin genel amacı, bu sınırlamanın üstesinden gelmek ve amiloid fibril çekirdeklerini izole etmek için sağlam bir biyokimyasal saflaştırma geliştirmektir. Bu strateji, SDS'nin çözünmez zenginleştirilmiş amiloid fraksiyonlarının ölüm sonrası AD insan ve fare beyin dokularından izolasyonu için daha önce tanımlanmış bir sakkaroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme bazlı biyokimyasal yöntem kullanmaktadır ^8,9. Bu yöntem mevcut literatüre dayanmaktadır, ancak ultrasonikasyon ve SDS ile daha da ileri giderek, gevşek bağlı amiloid ile ilişkili proteinlerin çoğunu çıkarmak için yıkanır ve yüksek oranda saflaştırılmış amiloid fibrillerin izolasyonuna yol açar (Şekil 1). Bu protokol ile saflaştırılan fibriller, beyin ekstraktlarından izole edilen amiloid fibrillerin yapısal çalışmalarında sıklıkla karşılaşılan çeşitli mevcut zorlukların üstesinden gelir. Bu fibrillerin transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile görselleştirilmesi, saflaştırılmış malzemenin bütünlüğünü ve saflığını doğrular (Şekil 2). Bu çalışmada, izole fibriller çözülür ve tripsin ile peptitlere sindirilir ve etiketsiz MS analizi, fibril çekirdeğini oluşturan proteinlerin kimliğini kolayca ortaya çıkarabilir. Özellikle, bu proteinlerin bazıları, zara bağlı olmayan organellerde supramoleküler gruplar oluşturma eğilimindedir. Ek olarak, amiloid-beta (Aβ) fibrillerinin analizinde tanımlanan proteinlerin çoğu, diğer nörodejeneratif hastalıklarla da ilişkilidir, bu da bu proteinlerin çoklu proteinopatilerde önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir.

Bu SDS / ultrasonikasyon yönteminin fibril çekirdeklerin yapısını değiştirmesi veya bozması muhtemel değildir. Saflaştırılmış malzeme ayrıca çok çeşitli yukarıdan aşağıya ve aşağıdan yukarıya proteomik analiz yaklaşımları ve kimyasal çapraz bağlama veya hidrojen-döteryum değişimi gibi ek MS tabanlı yapısal analiz stratejileri için de uygundur. Bu yöntemi kullanarak genel iyileşme nispeten yüksektir ve bu nedenle, saflaştırılmış malzemenin miligramlarına mikrogram gerektiren ayrıntılı yapısal çalışmalar için uygundur. Saflaştırılmış malzeme ayrıca kriyoEM ve atomik kuvvet mikroskobu kullanan yapısal çalışmalar için de uygundur. Bu protokol, memelilerin kararlı izotopik etiketlemesi ile birlikte, amiloid yapısı^10'un katı hal nükleer manyetik rezonans (NMR) çalışmalarını kolaylaştırabilir.

Protokol

Bu protokol, insan veya omurgalı beyin dokularının kullanımını içerir. Tüm araştırmalar, Northwestern Üniversitesi'nin onaylanmış kurumsal kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Mevcut iş akışı, APP-knock in (Uygulama^{NL-G-F / NL-G-F}) fare beyni kortikal ve hipokampal beyin bölgesi özleri¹¹ kullanılarak standartlaştırılmıştır. Bu protokol, 6-9 aylıkken farelerden elde edilen beyin ekstraktları için optimize edilmiştir ve amiloidleri hem erkek hem de dişi hayvanlardan etkili bir şekilde arındırabilir.

NOT: Genel deneysel yordamı daha iyi anlamak için, iş akışının şeması için Şekil 1'e bakın.

1. Doku hasadı ve amiloid saflaştırma

NOT: İdeal olarak, amiloid fibriller yeni disseke edilmiş beyin bölgelerinden izole edilmelidir. Bununla birlikte, bu yöntem aynı zamanda anlık veya flaş dondurulmuş beyin dokularıyla da iyi çalışır. Aşağıda, daha sonra kullanılmak üzere saklanmak üzere dondurucu beyin dokularının kısa bir taslağı bulunmaktadır.

1. Beyin dokusu toplama ve depolama: Fare beyinlerini disseke edin ve amiloid yüklü bölgeleri (yani korteks ve hipokampus) hızlı bir şekilde hasat edin, ardından sıvı azotta veya kuru buzlu alkol banyosunda anında dondurun.
   NOT: Çıtçıtlı dondurma, dokunun bileşenlerinin yapısal özelliklerinin korunmasına yardımcı olur. Fareler izofluran ve servikal çıkık^12,13 ile ötenazi yapılır. CO₂ kullanmaktan kaçınmanız önerilir, çünkü bu beyin proteom bütünlüğünü tehlikeye atabilir.
2. Diseksiyon sonrası, taze dokuları küçük bloklarda (örneğin, 5 mm x 5 mm) kesin ve saklayın, çünkü bu, amiloid ekstraksiyonundan önce daha verimli homojenizasyonu kolaylaştırır. Dokuyu steril kriyojenik şişeye aktarın, kapağını sıkın ve hızla suya batırın.
3. Dokuları ultra soğuk koşullarda donmuş halde tutun (yani, -80 ° C veya sıvı azot). Ekstraksiyon birkaç gün sonra yapılacaksa, dokuları -20 ° C'de saklayın ve donma ve çözülme döngülerinden kaçının. Dondurulmuş dokuları ekstraksiyon ve saflaştırmaya hazır olduğunda ıslak buz üzerinde çözün.
   NOT: Dokuların sıvı azot ile doğrudan teması doku ve protein hasarına neden olabilir. Bir alkol banyosunun tüp etiketlerinden kalıcı belirteçleri çıkarabileceğini unutmayın.

2. SDS çözünmeyen malzemenin zenginleştirilmesi

NOT: Aksi belirtilmedikçe, buz ve santrifüj üzerindeki tüm adımları 4 °C'de gerçekleştirin. Bu protokolde kullanılan tüm arabelleklerin ve çözümlerin ayrıntıları Ek Dosya 1'de verilmiştir. Kimyasal ve aletlerin üreticileri ve katalog numaraları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. 6-8 seramik boncuk ve taze hazırlanmış buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu (0.25-1 g ıslak doku kütlesi için 1 mL) içeren 2 mL'lik bir tüpe yerleştirilmiş taze disseke edilmiş veya dondurulmuş beyin dokusu bölgeleri (buz üzerinde çözülmüş) ile başlayın.
2. Tüpleri boncuk değirmeni homojenizatörüne aktarın ve doku içeriğini 4000 rpm'de, her biri 30 sn'lik iki döngü ve aralarında 30 s'lik bir aralıkla öğütün.
   NOT: Alternatif olarak, dokuları öğütmek ve homojenize etmek için motorlu karıştırıcı veya homojenizatör sistemleri kullanılabilir.
3. 15 mL tüplerde 1 mL beyin tüm doku homojenatına 9 mL buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu ekleyin, laboratuvar balmumu film şeritleriyle kapatın ve sağlam çözünürlük sağlamak için gece boyunca 4 °C'de uçtan uca döndürün.
   NOT: İstenmeyen büyük hücresel kalıntıları ve lipitleri çıkarmak için, ertesi sabah, tüpleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de 800 x g'da döndürün ve süpernatantı taze bir tüpte toplayın. Kalan peleti 2 mL buz gibi soğuk homojenizasyon tamponunda yeniden askıya alın, iyice karıştırın, 4 ° C'de 10 dakika boyunca tekrar döndürün ve iki süpernatantı birleştirin.
4. Doku ekstraktı süspansiyonuna 1.2 M'lik son konsantrasyona yavaşça katı sakkaroz ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C'de 45 dakika boyunca 250.000 x g'de santrifüj yapın.
5. Bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. Pelet, tritürasyon yoluyla 1,9 M sakkaroz içeren 2 mL homojenizasyon tamponunda yeniden askıya alın, ardından 4 ° C'de 45 dakika boyunca 125.000 x g'de santrifüjleme yapın.
   NOT: Arabellek hacmi, önceki adımdan geri kazanılan malzeme miktarına göre ayarlanabilir. Genel olarak, 10 hacimli homojenizasyon tamponu (V/V) bu adım için idealdir.
6. Bir pipet kullanarak üst beyaz katı tabakayı toplayın, taze bir tüpe aktarın ve hava kabarcıkları sokmadan birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, 1 mL buz gibi soğuk yıkama tamponunda çözün.
7. Üst tabakanın yanı sıra, pelet ayrıca amiloid fibrilleri ile zenginleştirilmiştir. Daha yüksek bir verim için, iki fraksiyonu birleştirin ve devam edin. Bir pipet kullanarak orta sulu tabakayı dikkatlice çıkarın ve atın.
8. Kombine fraksiyonları 8000 x g'de 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin. Süper natantı atın.
9. Yıkanmış pelete 1 mL buz gibi soğuk sindirim tamponu ekleyin, yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında (RT) 3 saat boyunca inkübe edin.
10. 4 °C'de 20 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj yapın ve bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın.
11. Sindirilmiş peleti 1 mL buz gibi soğuk Tris tamponunda iki kez askıya alın ve yıkayın (Adım 2.8 ile aynı).
12. Yıkanmış peleti, %1 SDS ve 1,3 M sakkaroz içeren 1 mL çözündürme tamponunda yukarı ve aşağı pipetle indirerek yeniden askıya alın. 4 °C'de 60 dakika boyunca 200.000 x g'de hızlı bir şekilde santrifüj yapın.
    NOT: Amiloid fibriller deterjanlara ve denatürantlara karşı oldukça dirençli olmasına rağmen, deterjana çok uzun süre maruz kalmak (%1 SDS) fibrillerin bütünlüğünü etkileyebilir veya sıkıca bağlanmış proteinleri uzaklaştırabilir, bu da sonraki analizleri tehlikeye atacaktır. Bu nedenle, peletleri askıya aldıktan hemen sonra, santrifüjlemeye devam edin.
13. Sakkaroz konsantrasyonunu 1,3'ten 1 M'ye düşürmek için 50 mM Tris tamponu (1:0,3 oranında) ekleyerek peleti koruyun ve kalan süpernatantın hacmini artırın ve 4 ° C'de 45 dakika boyunca 200.000 x g'de bir kez daha santrifüj yapın.
14. İki peleti,% 0.5 SDS içeren 100 μL Tris tamponunda ve amiloid saflaştırma için havuzda çözün. Görünür peletler küçüktür ve opak ve kirli beyaz görünmelidir (bkz. Şekil 2A).

3. Amiloid saflaştırma

NOT: İki peleti birleştirin, düzgün bir çözelti elde edene kadar pipetleme ile çözün ve aşağıdaki amiloid saflaştırma adımlarına devam edin.

1. Peletlerde bulunan amiloid bakımından zengin malzemenin tamamen çözünmesi için, tüpü 20 döngü için orta menzilli bir frekansta 30 s ON ve 30 s OFF için çalışan bir banyo sonikasyon cihazında ultrason dalgaları tarafından üretilen mekanik kesmeye maruz bırakın.
2. Malzemeyi derhal 4 °C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj edin ve peleti %0,5 SDS Tris tamponunun 500 μL'sinde yeniden askıya alın.
3. Adım 3.1'i tekrarlayın. ve Adım 3.2. toplam beş yıkama için dört kez. Saflığı artırmak için yıkama sayısı arttırılabilir.
   NOT: Sonication ve yıkama adımları% 0.5 SDS'de optimize edilmiştir, çünkü daha yüksek konsantrasyonlar fibrillerin yapısını, bütünlüğünü veya protein bileşimini etkileyebilir. Bu adımda SDS konsantrasyonunun arttırılması önerilmez.
4. Son santrifüjleme adımından sonra, peleti 200 μL ultra saf su içinde yıkayın ve kalan deterjanı çıkarmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj yapın. Saflaştırılmış amiloid fibriller içeren yıkanmış pelet yarı saydam renkte görünür ve bazen görülmesi zordur.
5. Arıtılmış amiloid fibriller içeren son peleti 100 μL ultra saf su içinde çözün. Çıkış yönündeki işleme için hemen bir sonraki adıma geçin veya daha fazla analiz için fibril süspansiyonu -20 °C'de kaydedin. Donmuşsa, yağışa başlamadan önce buz üzerinde çözülür.

4. Metanol kloroform çökeltme

NOT: Nihai amaç protein analizi yapmaksa, tuzdan arındırılması ve proteinli olmayan ilave safsızlıkların giderilmesi önerilir.

1. 1.5 mL'lik bir tüp ve vorteks kuyusunda saflaştırılmış 100 μL amiloid fibrillerine 400 μL metanol ekleyin.
2. Tüpe ve vorteks kuyusuna 100 μL kloroform ekleyin.
3. 300 μL ultra saf su ve vorteksi iyice ekleyin. Bu, protein çökelmesi nedeniyle karışımı bulanıklaştırır.
4. RT'de 2 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj.
5. Sulu tabakayı (yani üstte) protein pulunu içeren arayüz tabakasını bozmadan dikkatlice çıkarın.
6. Aynı miktarda metanolü tekrar ekleyin ve RT'de 2 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
7. Süpernatantı bir pipet kullanarak atın ve peleti RT'de hava ile kurutun; amiloid fraksiyonunun aşırı kurutulması durumunda yeniden çözünmesi zordur.

5. Tripsin sindirimi

1. Peleti 50 μL guanidin hidroklorür (GuHCl) tamponunda çözün. Buz gibi soğuk bir su banyosunda sonikat yapın ve gerekirse 95 ° C'de 5 dakika ısıtın.
2. Tamamen çözmek için RT'de 45 dakika ila 1 saat boyunca iyice vorteks. Pelet bu adımdan sonra görünmeyecek ve çözelti görünüşte net görünüyor.
3. Aynı hacimde% 0.2 yüzey aktif madde çözeltisi ekleyin. RT'de vorteksleme ile 60 dakika çözün. Bu adım tripsin enzimatik aktivitesini arttırır.
4. 500 mM stok çözeltisinden 1 μL tris-2-karboksiyetilfosfin (TCEP) ekleyin. 60 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
5. 2 μL 500 mM iyodoasetamid (IAA) ekleyin ve karanlıkta 20 dakika inkübe edin.
6. IAA'yı 15 dakika boyunca 5 μL TCEP çözeltisi ile söndürün.
7. Guanidin konsantrasyonunu 1,5 M'ye düşürmek için tüpe gerekli hacimde 50 mM amonyum bikarbonat çözeltisi ekleyin.
8. Tüpe % 1 yüzey aktif madde çözeltisi ekleyin (1 μL / 50 μg protein).
9. Tripsin (1 μg / 100 μg protein) ekleyin ve tüpün gece boyunca 37 ° C'de karışmasını sağlayın.

6. Peptit temizleme

1. Ertesi sabah, formik asit ekleyerek pH'ı 2.0'a düşürerek sindirilmiş peptit çözeltisini asitleştirin.
2. 200 μL% 50 metanol çözeltisi ekleyerek 2 mL'lik bir alıcı tüpünde C18 (n-oktadesil) spin kolonunu etkinleştirin ve RT'de 2 dakika boyunca 1500 x g'de döndürün.
3. C18 kolon reçine yataklarını 200 μL denge tamponu ekleyerek ve aynı koşullarda 2 dakika boyunca eğirerek dengeleyin. Bu adımı tekrarlayın.
4. Asitleştirilmiş peptit çözeltisini C18 kolonuna yükleyin ve RT'de 2 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj yapın. İkinci akışı atın.
5. C18 reçinesine bağlı peptitleri, Adım 6.3'te yapıldığı gibi yıkama tamponu 2x ile yıkayın. Kolonu yıkamak için aynı denge tamponunu kullanın.
6. 40 μL elüsyon tamponu ekleyerek peptidleri süzün ve ardından RT'de 2 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleme yapın.
7. Peptitleri, sulu çözeltiyi buharlaştırarak hızlı bir vakum yoğunlaştırıcısında kurutun. Kuru peletler, MS analizinden önce birkaç hafta boyunca -20 ° C'de saklanabilir.

7. Peptit analizi için kütle spektrometresinin kurulması

NOT: MS parametreleri için bkz: Ek Dosya 1 (laboratuvardan önceki bir yayından uyarlanmıştır)¹⁴.

1. MS analizi için peptid numunelerini yüklemeden önce, kuru peptit peletlerini 20 μL numune yükleme tamponunda çözün ve geri kazanılan peptitlerin konsantrasyonunu ölçmek için mikro BCA gerçekleştirin.
2. Çözünmüş peptitleri bir cam şişeye aktarın ve peptidlerin 3 μg'sini (mikro BCA'dan nicelleştirilmiş) UPLC sistemi otomatik numune alma cihazına yükleyin.
3. Numuneleri, 250 nL/dak akış hızına sahip havalandırmalı bir tuzak kolonuna (C18 HPLC kolonu, 0,075 mm x 20 mm) yükleyin.
4. Tuzak kolonunu analitik bir sütunla (0,075 μm x 500 mm) uyumlu olarak düzenleyin ve 2000 V'luk bir püskürtme voltajına maruz kalan elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağına bir yayıcı ucu monte edin.
   NOT: Bu çalışmada, mobil fazın gaz fazına yüksek voltajlı iyonizasyona tabi tutulduğu ESI gerçekleştirilmiştir. Bunun yarattığı sprey, ısıtılmış bir kılcal damar vasıtasıyla MS'in vakum odasına yönlendirilir. Vakum altındayken, damlacıkların çözülmesi ve iyonların atılması, ısı ve voltaj varlığında gerçekleşir. Bundan sonra, iyonlar yüksek voltajlı bir ortamın varlığında kütle analizörüne doğru hızlandırılır.
5. Örnekleri 2 saatlik alım çalışmalarıyla analiz edin. Bu çalışma, en yoğun ilk 20 öncü iyon seçimi paradigması ile veriye bağımlı edinim kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
   NOT: Veriye bağımlı alımda, MS1 taramasında sınırlı sayıda öncü peptit algılanır ve MS2 çözümlemesi için parçalanmaya tabi tutulur. Bununla birlikte, dinamik dışlama burada sorunludur, çünkü oldukça bol miktarda Aβ peptidleri parçalanma için ihmal edilecek ve miktarlarının hafife alınmasına neden olacaktır.
6. Aβ peptidlerinin mutlak niceliği için, hedeflenen MS / MS yöntemini kullanarak aynı örnekleri bir kez daha çalıştırın. Bu çalışma için, APP knock-in fare modelleri için çeşitli olası triptik Aβ peptidleri için tüm m / z oranlarının kapsamlı bir listesi hazırlanmıştır (Ek Tablo 1'e bakınız). Diğer gruplar, mevcut fare modeline ve ilgili proteinden üretilen olası peptitlere (örneğin, AD için Aβ) uygun olarak benzer bir liste hazırlamalıdır.
   NOT: Yüksek oranda bol miktarda peptidin dışlanmasını ele almak için, Aβ triptik peptitlere karşılık gelen seçilmiş m / z değerlerinin bir listesini sağlayarak hedefli bir yaklaşım kullanın. Bu yaklaşım, Aβ peptitlerinin veriye bağımlı dışlanması sorununu ele alır ve farklı monomerlerin (Aβ38, 40 ve 42 peptitleri) mutlak miktarlarını yüksek çözünürlükle ölçebilir.
7. Kütle spektrometresi, peptit örneklerinin MS spektrumlarını oluşturur ve ham veri dosyalarını hedef dizine kaydeder. İyi kurulmuş istatistiksel ve biyoinformatik araçları kullanarak spektral eşleştirme gerçekleştirmek için bu dosyayı kullanın. Birden çok çevrimiçi ve çevrimdışı veritabanı arama ve analiz aracı mevcuttur.

8. MS veri analizi

1. Çevrimdışı Rawconverter aracını (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/) kullanarak MS1 ve MS2 dosyalarını ayıklayın.
2. Web tabanlı bir MS veri arama motorundaki verilerin tanımlanmasını, nicelleştirilmesini ve ayrıntılı analizlerini gerçekleştirin. Bu çalışmada Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/) kullanılmıştır.
   NOT: MaxQuant (https://www.maxquant.org/) gibi diğer birçok çevrimiçi ve çevrimdışı MS veri analiz aracı mevcuttur ve ayrıca kullanılabilir.
3. MS1 ve MS2 dosyalarını karşıya yükledikten sonra, güncelleştirilmiş bir fare proteome veritabanı seçin. Burada, ProLuCId ve SEQUEST algoritmaları¹¹ kullanılarak peptitlerin tanımlanması için ek App knock-in spesifik mutasyonları içeren güncellenmiş bir fare veritabanı seçilmiştir.
4. IP2 analiz sisteminde, varsayılan parametreleri seçin ve bunları deneysel gereksinimlere göre değiştirin. Bu çalışmada, öncü için 50 ppm ve fragmanlar için 600 ppm'lik bir peptid kütle toleransı kullanılmıştır (IP2'de kullanılan diğer parametreler için Ek Dosya 1'e bakınız).
   NOT: Araştırmacılar, arama parametrelerini deneysel hedeflere uygun olarak değiştirebilirler. Örneğin, çeviri sonrası modifikasyonları tanımlamak için, çeşitli PTM'ler için diferansiyel modifikasyon değerleri ekleyin (örneğin, ubikitinasyon, SUMOilasyon, fosforilasyon).

Sonuçlar

Burada, modifiye edilmiş bir sakkaroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme saflaştırma yöntemi kullanılarak amiloid fibrillerin izolasyonu ve saflaştırılması için ayrıntılı bir yöntem özetlenmiştir (bkz. Şekil 1). Bu yöntemdeki yenilik, bir su banyosu sonikasyon sistemi kullanılarak ultrasonikasyon tabanlı yıkama adımlarının dahil edilmesinin ardından SDS çözündürücü, bu da gevşek ilişkili proteinlerin çoğunu son derece yoğun ve temiz fibriller ile birl...

Tartışmalar

Amiloid yapısı ve bileşimi hakkında net bir anlayış geliştirmek, AD beyin dokularından saflaştırılmış fibrillerin çıkarılmasındaki biyolojik karmaşıklıklar ve deneysel sınırlamalar nedeniyle yapısal biyologlar ve biyokimyacılar için zordur^16,17. Amiloid fibriller moleküler düzeyde polimorfiktir ve farklı uzunluklarda ve karmaşıklıklarda heterojen bir popülasyon gösterir^18,19

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm	Thermo Scientific	164535	Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody	Biolegend	803001
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody	Biolegend	800701
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody	IBL America	10323
anti-amyloid fibril LOC antibody	EMD Millipore	AB2287
BCA kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Bioruptor Pico Plus	Diagenode	B01020001
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Collagenase	Sigma-Aldrich	C0130
Complete  Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	EN0521
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	G4505
HyperSep C18 Cartridges	Thermo Fisher Scientific	60108-302
Integrated Proteomics Pipeline - IP2	http://www.integratedproteomics.com/
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149
K54 Tissue Homogenizing System Motor	Cole Parmer	Glas-Col 099C
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
Micro BCA kit	Thermo Fisher Scientific	23235
Nanoviper 75 μm x 50 cm	Thermo Scientific	164942
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman Coulter	BR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin Columns	Thermo Fisher Scientific	89870
Precellys 24 tissue homogenizer	Bertin Instruments	P000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer	Promega	V2072
RawConverter	http://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Sodium azide	VWR	97064-646
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	74255
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002446
Speed Vaccum Concentrator	Labconco	7315021
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025
Trypsin Gold-Mass spec grade	Promega	V5280
UltiMate 3000 RSLCnano System	Thermo Scientific	ULTIM3000RSLCNANO