JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A'nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.

Özet

Karmaşık bir hücresel ortam, tek moleküllü hareketlilik analizi için zorluklar doğurur. Bununla birlikte, görüntüleme tekniklerindeki ilerleme, tek moleküllü çalışmaları geliştirmiş ve floresan etiketli moleküllerin dinamik davranışlarını tespit etmede ve anlamada büyük popülerlik kazanmıştır. Burada, Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak kinesin-3 ailesi motorların in vitro tek moleküllü çalışmaları için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Kinesin-3, hücre içi kargo taşımacılığından hücre bölünmesine ve gelişime kadar değişen hücresel ve fizyolojik fonksiyonlarda kritik roller oynayan büyük bir ailedir. Yapısal olarak aktif dimerik kinezin-3 motorlarının, memeli hücrelerinde motor eksprese edilerek hazırlanan hücre lizatlarını kullanarak tek molekül düzeyinde yüksek mikrotübül afinitesi ile hızlı ve süperprosesik hareketlilik sergilediğini daha önce göstermiştik. Laboratuvarımız hücresel, biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlar kullanarak kinesin-3 motorlarını ve düzenleyici mekanizmalarını inceler ve bu tür çalışmalar büyük ölçekte saflaştırılmış proteinler gerektirir. Bu motorların memeli hücreleri kullanılarak ekspresyonu ve saflaştırılması pahalı ve zaman alıcı olurken, prokaryotik bir ekspresyon sistemindeki ekspresyon önemli ölçüde toplanmış ve inaktif protein ile sonuçlanmıştır. Bakteriyel saflaştırma sistemleri ve memeli hücre lizatının getirdiği sınırlamaların üstesinden gelmek için, bu motorları eksprese etmek ve saflaştırmak için sağlam bir Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kurduk. Kinesin-3 motorları, gelişmiş sinyaller sağlayan ve fotobeyazlatmayı azaltan 3-tandem floresan proteinleri (3xmCitirine veya 3xmCit) ile C-terminal olarak etiketlenmiştir. Sf9 saflaştırılmış proteinlerin in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, kinezin-3 motorlarının memeli hücre lizatlarını kullanan önceki çalışmalarımıza benzer şekilde hızlı ve süperprosesik olduğunu göstermektedir. Bu testleri kullanan diğer uygulamalar, motorların oligomer koşulları, biyokimyasal çalışmalara paralel özel bağlanma ortakları ve kinetik durumları hakkında ayrıntılı bilgi içerir.

Giriş

Son derece kalabalık bir hücre ortamı, kaderindeki proteinleri ve molekülleri sıralamada birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Sitoplazma içindeki moleküllerin organizasyonu ve mekansal zamansal dağılımının bu yoğun iş yükü, moleküler motorlar ve sitoiskelet izleri tarafından kolaylaştırılmıştır. Moleküler motorlar, ATP gibi enerji para birimlerini hidrolize eden ve bu enerjiyi hareket ve kuvvet üretimisırasında kullanan enzimlerdir. Amino asit dizisi benzerliğine dayanarak, kinezinler 14 aileye ayrılır ve bu benzerliğe rağmen, her motor bir hücrenin işleyişine benzersiz bir şekilde katkıda bulunur. Kinesin-3 ailesi motorlar, vezikül taşıma, sinyalleşme, mitoz, nükleer göç ve gelişim 3,4,5 dahil olmak üzere çeşitli hücresel ve fizyolojik işlevlerle ilişkili beş alt aileden (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 ve KIF28)2 oluşan en büyüklerden birini oluşturur. Kinezin-3 taşıma fonksiyonundaki bozulma birçok nörodejeneratif bozukluk, gelişimsel defekt ve kanser hastalığına etki eder 6,7,8,9.

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kinezin-3 motorlarının monomer olduğunu, ancak kargo kaynaklı dimerizasyona uğradığını ve geleneksel kinesin10,11,12,13'e kıyasla hızlı ve süperprosesik hareketliliğe neden olduğunu göstermiştir. Biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonları büyük miktarda saflaştırılmış, aktif proteine ihtiyaç duyar. Bununla birlikte, prokaryotik ekspresyon sistemindeki üretimleri, muhtemelen uyumsuz protein sentezi, katlama ve modifikasyon makineleri 14,15,16,17,18 nedeniyle inaktif veya agrega motorlarıyla sonuçlandı. Bu tür sınırlamaları aşmak ve verimi artırmak için, burada bu motorları ifade etmek ve saflaştırmak için sağlam bir Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kurduk.

Bakülovirüs ekspresyon sistemi, yüksek verimli ökaryotik rekombinant protein ekspresyonu 19,20 için konakçı sistem olarakSf9 böcek hücre hatlarını kullanır. Bakülovirüs, heterolog gen ekspresyonuna ve çözünür rekombinant proteinlerin üretimine yardımcı olan güçlü bir polihedrin promotörüne sahiptir17. Uygun maliyeti, kullanımı güvenli ve yüksek miktarda aktif protein ekspresyonu nedeniyle, güçlü bir araç haline gelmiştir21. İlgilenilen bir proteini ifade etmek için önemli bir adım, rekombinant bir bacmid üretmektir. Ticari olarak temin edilebilen bacmid üretim kitleri pahalı olduğundan ve daha fazla numune ile çalışacağımızdan kinezin-3 motorlarının hem büyük hem de küçük ekleri için bacmidlere şirket içi bir protokol geliştirdik. Sf9-saflaştırılmış kinesin-3 motorları, toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak in vitro tek moleküllü ve çok motorlu mikrotübül kayma özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Motorlar, gelişmiş sinyal sağlamak ve fotobeyazlatmayı azaltmak için 3 tandem floresan molekülleri (3xmCit) ile C-terminal olarak etiketlenmiştir. Artan sinyal-gürültü oranı, daha az fototoksisite ve kapak kaymasına yakın çok küçük bir alanın seçici görüntülenmesi nedeniyle, TIRF görüntüleme, protein dinamiklerini in vivo ve in vitro olarak tek moleküllü seviyede görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bu çalışmada, Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak kinesin-3 motorlarının saflaştırılması ve TIRF mikroskobu kullanılarak motorların in vitro tek moleküllü görüntüleme ve çok motorlu kayma analizi tartışılmaktadır. Toplamda, bu çalışma, Sf9 saflaştırılmış motorların hareketlilik özelliklerinin, memeli hücre lizatlarından hazırlanan motorlarınkiyle aynı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sisteminin, ilgilenilen herhangi bir motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uyarlanabileceğine inanıyoruz.

Protokol

1. Sf9 kültürü, transfeksiyonu ve virüs üretimi

NOT: Sf9 hücrelerini, 28 °C'de herhangi bir antibiyotik/antimikotik olmadan 100 mL steril, tek kullanımlık konik şişede 30 mL Sf-900/SFM ortamında muhafaza edin. Süspansiyon kültürünü yörüngesel bir çalkalayıcıda 90 rpm'de tutun. CO2 ve nem bakımı gerekli değildir. Hücreler genellikle dördüncü günde 2.0 x 10 6 hücre / mL yoğunluğa ulaşmak için 0.5 x 106 hücre / mL aşılanarak her dördüncü günde bir alt kültüre alınır.

  1. P0 virüs stok üretimi
    1. Transfeksiyon için, tohum hücrelerini 4.5 x 10 5 hücre / mL akıcılığa sahip35 mm'lik bir kaba koyun ve titremeden 28 ° C'de tutun.
    2. 24 saat sonra, hücreler bağlandıktan ve sağlıklı göründükten sonra, aşağıda açıklandığı gibi transfeksiyona devam edin.
      1. Tüp A: Yapısal olarak aktif KIF1A (1-393LZ)-3xmCit-FLAG spesifik kinesin-3 motor için 1 μg bacmid DNA kodlamasını 100 μL takviyesiz Grace ortamı ile karıştırın.
      2. Tüp B: 6 μL transfeksiyon reaktifini 100 μL takviyesiz Grace ortamı ile karıştırın.
      3. Tüp A'nın içeriğini dikkatlice Tüp B'ye aktarın ve yukarı ve aşağı pipetleyerek, yukarı ve aşağı (yaklaşık 20 kez) iyice karıştırın.
      4. Karışımı oda sıcaklığında ~ 45 dakika boyunca inkübe edin.
    3. Kuluçkayı tamamladıktan sonra, yukarıdaki karışıma 0,8 mL takviyesiz Grace ortamı ekleyin ve pipetleme ile yavaşça karıştırın.
    4. Sf-900/SFM ortamını hücrelerden nazikçe aspire edin (transfeksiyon verimliliğini etkileyebilecek serum izlerini çıkarmak için).
    5. Transfeksiyon karışımını 1.1.3 adımından damla damla hücrelerin üstüne ekleyin ve plakayı 28 ° C'de 6 saat boyunca inkübe edin.
    6. Kuluçkadan sonra, transfeksiyon karışımını dikkatlice çıkarın, 2 mL Sf-900 / SFM ortamı ekleyin ve 28 ° C'de 48 saat daha inkübe edin.
    7. Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu altında motor protein ekspresyonunu kontrol edin. Motor protein, sarı floresan proteininin bir varyantı olan floresan proteini mCitrin ile etiketlenmiştir.
      NOT: Transfekte hücreler, diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve epifloresan aydınlatma ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop altında, 20x objektif (200 kat büyütme), cıva lambası ve bir EM-CCD kamera ile görselleştirilmiştir. mCitrine uyarımı ve emisyon filtresi küpü aracılığıyla hücrelerdeki mCitrin etiketli motorların ekspresyonunu izleyerek virüs üretiminin ve enfeksiyonun verimliliğini kontrol edin. Ek olarak, genişlemiş hücreler / çekirdekler gibi enfekte olmuş hücrelerin morfolojik değişikliklerini kontrol edin (Şekil 1A-C).
    8. Yine, enfeksiyondan 72 saat sonra hücreleri kontrol edin. Genellikle hücreler yüzeyden ayrılmaya başlar (Şekil 2).
    9. Hücrelerin% >5'i yüzeyden ayrılırsa, medyayı 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüplerinde enfekte olmuş hücrelerle hasat edin ve 500 x g'de 5 dakika boyunca döndürün.
    10. Süpernatantı toplayın ve 1 mL'lik dondurucu alikotları sıvı azotta toplayın ve -80 ° C'de P0 stoğu olarak saklayın veya P1 virüs stoğu oluşturmak için kullanın.
  2. P1 virüsü stok üretimi
    1. P0 bakülovirüs stoğunu daha da arttırmak ve protein ekspresyonunu doğrulamak için, sıvı süspansiyon kültüründe Sf9 hücrelerini büyütün.
    2. Steril 100 mL konik şişede, hücre yoğunluğu 2 x 106 hücre/mL ve 1 mL P0 virüs stoğuna sahip 10 mL Sf-900/SFM ortamı ekleyin. 90 rpm'de sürekli sallama ile 28 ° C'de inkübe edin.
    3. 72 saatlik enfeksiyondan sonra, daha önce tarif edildiği gibi protein ekspresyonunu kontrol edin (adım 1.1.7). Protein ekspresyonu iyiyse (hücrelerin% >90'ı parlak bir mCitrine floresan sinyali gösterir) ve önemli miktarda hücre ölümü (yaklaşık% 10 -% 15) gösteriyorsa, hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'de 15 mL steril konik bir tüpte döndürün.
    4. Sıvı azotta 1 mL'lik (P1 stok) süpernat, çıtçıtlı dondurucu alikotları toplayın ve -80 ° C'de saklayın veya büyük ölçekli enfeksiyon ve protein saflaştırması için devam edin.
  3. Büyük ölçekli enfeksiyon
    1. Büyük ölçekli protein ekspresyonu için, süspansiyon kültürünün 30 mL'sini 2 x 106 hücre / mL yoğunlukta 1 mL P1 virüs stoğu ile enfekte edin ve 90 rpm'de sürekli sallanarak 28 ° C'de inkübe edin.
    2. Enfeksiyon sonrası ~ 72 saat sonra, protein ekspresyonunu kontrol edin (genel olarak, maksimum protein ekspresyonu enfeksiyon sonrası 65-75 saat arasında elde edilir).
    3. Hücrelerin% >90'ı minimum hücre ölümü (% <5) ile parlak bir floresan sinyali gösteriyorsa, hücreleri steril bir 50 mL konik tüp içinde toplayın ve 15 dakika boyunca 4 ° C'de 500 x g'de aşağı doğru döndürün.
      NOT: Minimum hücre ölümü (% <5) olmalıdır, çünkü ölü hücreler hücresel içeriği ortama bırakır ve bu da eksprese edilen protein kaybına yol açar.
    4. Süper natantı atın, hücre peletini toplayın ve protein saflaştırmaya devam edin.

2. Kinesin-3 motorlarının Sf9 saflaştırılması

  1. Yukarıdaki hücre peletine, 5 mM DTT, 5 μg / mL aprotinin, 5 μg / mL leupeptin ve 5 μg / mL PMSF ile taze olarak takviye edilmiş 3 mL buz gibi soğuk lizis tamponu (Ek Tablo 1) ekleyin ve hücreleri herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadan 20-25 kez pipetleyerek lize edin. Tüm tampon bileşimleri ve reaktifleri için lütfen Ek Tablo 1'e bakınız.
  2. Hücre lizatını 150.000 x g'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca döndürün.
  3. Süpernatantı taze, steril bir tüpe toplayın ve ~ 40 μL% 50 anti-FLAG M2 afinite reçinesi ile karıştırın. Karışımı 4 °C'de 3 saat boyunca uçtan uca yuvarlanarak inkübe edin.
  4. Kuluçkadan sonra, 4 ° C'de 1 dakika boyunca 500 x g'de döndürerek FLAG reçinesini pelet edin. Peleti 26 G'lik bir iğne ile rahatsız etmeden süpernatantı nazikçe aspire edin ve atın.
  5. FLAG reçine peletini üç kez, 2 mM DTT, 5 μg / mL aprotinin, 5 μg / mL leupeptin ve 5 μg / mL PMSF ile taze olarak desteklenmiş buz gibi soğuk yıkama tamponu (Ek Tablo 1) ile yıkayın. Her yıkamada 4 °C'de 1 dakika boyunca 500 x g'da eğirerek boncukları topaklayın.
  6. Üçüncü yıkamadan sonra, peleti rahatsız etmeden yıkama tamponunu mümkün olduğunca dikkatlice boşaltın. Protein elüsyonu için, reçine peletine 100 μg / mL FLAG peptid içeren ~ 70 μL yıkama tamponu ekleyin ve uçtan uca yuvarlanma ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  7. Ertesi gün, reçineyi 4 ° C'de 1 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Saflaştırılmış protein içeren süpernatantı taze bir tüpe toplayın ve% 10 gliserol ile destekleyin. 5 μL'lik alikotları sıvı azotta dondurun ve daha fazla kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.
  8. Protein konsantrasyonunu ve verimini belirlemek için SDS-PAGE jelini çalıştırın. İlgilenilen saflaştırılmış protein ile birlikte, standart bir protein kontrolü, standart bir eğri oluşturmak için 0.2 μg, 0.4 μg, 0.6 μg, 0.8 μg ve 1 μg arasında değişen bilinen konsantrasyonların BSA'sı yüklenir. Jeli Coomassie Brilliant mavi ile lekeleyin (Şekil 3).
  9. ImageJ yazılımında yerleşik bir jel niceleme aracı kullanarak jeli analiz edin. İlk olarak, bilinen BSA konsantrasyonlarının bant yoğunluğunu ölçün ve standart eğriyi oluşturun. Ardından, saflaştırılmış protein bandının yoğunluğunu ölçün ve protein konsantrasyonunu belirleyin. Bunu yapmak için Image J yazılımını açın, menü çubuğundaki Analiz Et seçeneğine tıklayın ve açılır menüden Jeller'i seçin.

3. Sf9-saflaştırılmış kinezin-3 motorları kullanılarak in vitro tek moleküllü motilitesi testi

NOT: Sf9-saflaştırılmış kinezin-3 motorları, ATP devir hızı, mikrotübül afinitesi, hız, çalışma uzunluğu, adım boyutu ve kuvvet üretimi gibi biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri incelemek için kullanılabilir. Burada, Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak KIF1A'nın (1-393LZ) in vitro tek moleküllü hareketlilik analizi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Tüm tampon bileşimi ve reaktifleri için lütfen Ek Tablo 1'e bakınız.

  1. Mikrotübül polimerizasyonu
    1. Önceden soğutulmuş 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünde, aşağıdaki sırayla pipetleme yaparak bir polimerizasyon karışımı hazırlayın: 12,0 μL BRB80 tamponu, pH 6,9; 100 mM MgCl 2'nin 0,45 μL'si,25 mM GTP'nin 1 μL'si.
    2. Sıvı azotta depolanan 10 mg / mL tübülinden oluşan 10 μL'lik bir alikotu çıkarın, hemen çözün ve yukarıdaki polimerizasyon karışımına ekleyin. Hava kabarcığı oluşturmadan 2-3 kez pipetleyerek, hafifçe karıştırın.
      NOT: Yukarıdaki adımları buz üzerinde hızlı ve kesin bir şekilde uygulayın.
    3. Yukarıdaki karışımı 5 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.
      NOT: Bu, tübülinin denatüre olmasını önlemek veya kısa mikrotübül tohumlarının oluşumunu önlemek için kritik bir adımdır.
    4. Tüpü önceden ısıtılmış 37 °C ısı bloğu / su banyosuna aktarın ve mikrotübüllerin polimerizasyonu için 30 dakika boyunca inkübe edin.
    5. Mikrotübüller polimerize olurken, P12 tamponunun bir alikotunu çözün ve oda sıcaklığına getirin.
    6. 30 dakikalık inkübasyonu tamamlamadan önce, 100 μL P12 tamponunu taze bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyerek, MT stabilizasyon tamponunu hazırlamaya başlayın. Buna, 1 μL 1 mM taksol ekleyin ve hemen karışımı vorteksleyin.
      NOT: Adım 3.1.4'te inkübasyonu tamamlamadan yaklaşık 5 dakika önce MT stabilizasyon tamponunu hazırlamaya başlayın. Taxol, polimerize mikrotübülleri β-tübüline bağlayarak stabilize eder.
    7. Mikrotübül stabilizasyon tamponunu 37 ° C'de 2-3 dakika ısıtın ve alttaki polimerizasyon karışımını bozmadan polimerize mikrotübüllere yavaşça ekleyin.
      NOT: Stabilizasyon tamponunun ısıtılması, polimerizasyon karışımı ile aynı sıcaklığa getirecektir.
    8. Karışıma dokunmayın veya pipet uygulamayın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de daha fazla inkübe edin.
    9. Karışıma hafifçe dokunun ve pipeti kullanarak eğimli bir kesme ucu (200 μL kapasiteli) ile yavaşça karıştırın.
      NOT: Bu noktadan itibaren, mikrotübül kesmeyi önlemek için mikrotübülleri her zaman eğimli bir kesme ucuyla tutun.
    10. Uygun mikrotübül polimerizasyonunu kontrol etmek için bir akış hücresinde 10-15 μL polimerize mikrotübül alın.
      NOT: Bir DIC mikroskopi kurulumu kullanarak etiketlenmemiş mikrotübüller görselleştirilebilir.
    11. Mikrotübüller konsantre edilmişse, bunları 10 μM taksol ile desteklenmiş P12 tamponunda seyreltin.
  2. Motiliteli akış hücresi odasının hazırlanması
    1. Bir cam slayt, çift taraflı bant ve cam kapak kayması (22 mm x 30 mm) kullanarak bir hareketlilik odası hazırlayın.
    2. Bir cam slayt alın, ortasına bir damla (~ 70 μL) deiyonize damıtılmış su yerleştirin ve tüy bırakmayan bir kağıt mendille silin.
    3. İki çift taraflı bant şeridini (~ 35 x 3 mm) kesin ve bunları cam slayta paralel olarak sıkıca yapıştırın, dar bir geçit oluşturmak için iki şerit arasında ~ 4-5 mm'lik bir boşluk bırakın.
    4. Daha sonra, bir kapak kayması alın ve ortasına bir damla (~ 20 μL) deiyonize damıtılmış su ekleyin. Tüy bırakmayan lens temizleme mendili kağıdından oluşan bir şeridi, suyu emene kadar su damlasının üzerine yerleştirin. Ardından, yavaşça kapak kaymasının bir ucuna doğru kaydırın.
      NOT: Kapak kapağı tamamen kuru olmalıdır. Kapak kapağında su görünmemelidir.
    5. Kapak kaymasını slayta sıkışmış çift taraflı şeritlerin üzerine yerleştirin ve sıkıca yapışması için kapak kaymasını şeritler boyunca eşit şekilde bastırın.
      NOT: Lütfen kapak kapağının temizlenmiş tarafının cam kızağa baktığından emin olun.
    6. Bunun birlikte, hareketlilik testi yapmak için 10-15 μL kapasiteli dar bir oda oluşturduğundan emin olun (Şekil 4A).
  3. In vitro tek moleküllü motilitesi testi
    NOT: Motorların mikrotübül bazlı tek moleküllü hareketlilik özelliklerini incelemek için, mikrotübüllerin hareketlilik odasındaki örtü kayması yüzeyine adsorbe edilmesi gerekir.
    1. Polimerize taksol stabilize mikrotübülleri, 1:5 oranlarında 10 μM taksol ile desteklenmiş P12 tamponunda seyreltin ve eğimli bir uçla yavaşça pipetleyerek karıştırın.
    2. Akış odasını eğimli konumda tutun (~ 15-20 °). Sıvıyı emmek için alt uçta tüy bırakmayan bir doku kağıdı tutarken, 30 μL seyreltilmiş mikrotübül çözeltisini üst uçtan akış odasından geçirin. Bu, mikrotübülü akış yönünde hizalamak için bir kesme kuvveti oluşturur ve mikrotübülleri düz adsorbe etmeye ve paralel olarak hizalamanıza yardımcı olur.
    3. Odanın her iki ucunda küçük bir sıvı damlası bırakın ve hareket odasının kurumasını önlemek için akış hücresini kapalı, nemli bir odada ters çevrilmiş bir konumda (kapak kayması tabana bakan) tutun.
    4. ~ 30 dakika bekletin, böylece mikrotübüller hareket odasının içindeki kapak kaymasının yüzeyine adsorbe olur.
    5. Bu arada, 500 μL P12-BSA tamponunu 5 μL 1 mM taksol ile karıştırarak blokaj tamponunu hazırlayın.
    6. 40-50 μL blokaj tamponu akışı sağlayın ve sürgüyü nemli bir odada 10 dakika boyunca ters çevrilmiş konumda inkübe edin.
    7. Aşağıdaki bileşenleri aşağıdaki sırayla 500 μL kapasiteli steril bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyerek, hareketlilik karışımını hazırlayın: Taksollü 25 μL P12 tamponu, 0,5 μL 100 mM MgCl2, 0,5 μL 100 mM DTT, 0,5 μL 20 mg/mL Glikoz oksidaz, 0,5 μL 8 mg/mL Katalaz, 0.5 μL 2.25 M Glikoz ve 1.0 μL 100 mM ATP.
      NOT: Floresan görüntüleme biyolojik uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır22,23,24,25,26. Floresan proteinlerin fotoeksitasyonu, floresan proteinlerin fotobeyazlamasına ve biyolojik örneklere zarar verebilecek reaktif oksijen türleri (ROS) üretir27,28. Glikoz, glikoz oksidaz ve katalaz gibi oksijen temizleyiciler, fotohasarı sınırlamak ve floresan proteinlerin ağartma süresini uzatmak için motilitesi testlerinde rutin olarak kullanılmaktadır.
    8. Son olarak, saflaştırılmış motorun 1 μL'sini yukarıdaki hareketlilik karışımına ekleyin ve hareketlilik odasına akmadan önce iyice karıştırın.
    9. Hareketlilik odasının her iki ucunu da sıvı parafin mumu ile kapatın ve 1.5x büyütme ile 1.49 NA'lık 100X TIRF hedefini kullanarak TIRF aydınlatması altında hemen görüntü alın.
    10. Kapak kayması yüzeyini odaklamak için, ilk olarak, diferansiyel girişim kontrastı (DIC) aydınlatması altındaki hareketlilik odasındaki çift taraflı bandın iç kenarlarından birine odaklanın.
      NOT: Parlak ve düz olmayan yüzey görünür olacaktır.
    11. Ardından, odağı hareketlilik odasına taşıyın. İnce ayar kullanarak, coverslip yüzeyine odaklanın ve coverslip yüzeyinde adsorbe edilen mikrotübülleri arayın.
    12. Mikrotübüller odaklandıktan sonra, 488 nm uyarma lazeri ile TIRF aydınlatmasına geçin ve en iyi ve düzgün TIRF aydınlatmasını elde etmek için uyarma ışını açısını değiştirerek aydınlatma derinliğini ayarlayın (Şekil 4B).
    13. 100 ms pozlama ile mikrotübül yüzeyi boyunca işlemsel olarak hareket eden mCitrine etiketli motorları odaklayın ve bir EM-CCD kamera kullanarak hareketi kaydedin.
      NOT: Hareketlilik testleri etiketlenmemiş mikrotübüller üzerinde gerçekleştirilmiş olsa da, mikrotübül izinin ana hatlarını ortaya çıkarmak için maksimum yoğunluk z-projeksiyon fonksiyonu kullanılabilir. Tercihen, uzun mikrotübül izlerindeki olaylar izleme analizi için dikkate alındı.
    14. Daha önce açıklandığı gibi ImageJ (nih.gov) yazılımında özel olarak yazılmış bir eklenti kullanarak uzun mikrotübül izleri üzerinde yürüyen floresan etiketli bireysel motorların konumunu kare kare izleyin29.
    15. Her bölmedeki olayların sayısını çizerek motor popülasyonu için hız ve çalışma uzunluğunun histogramlarını oluşturun. Ortalama hız ve çalışma uzunluğu12 elde etmek için bu histogramları tek bir Gauss tepe fonksiyonuna takın (Şekil 4C-E).

4. In vitro mikrotübül kayma testi

NOT: Kinesin-3 motorlarının kolektif davranışını anlamak için, in vitro mikrotübül kayma testi 18,30,31 yapılmıştır. Motorların ters çevrilmiş bir konumda kapak kayması üzerine hareketsiz hale getirildiği ve hazneye mikrotübüller eklendikten sonra, mikrotübüller motorların üzerine iner ve motorlar üzerlerinde yürümeye çalışırken kayar (Şekil 5A, B).

  1. Floresan mikrotübül polimerizasyonu: Rodamin etiketli tübülin (3 mg / mL) ile etiketlenmemiş tübülin (10 mg / mL) oranının 1:10 oranında karıştırılması dışında, daha önce açıklanan protokolü izleyerek mikrotübülleri polimerize edin.
  2. 30 dakikalık polimerizasyondan sonra, 30 μL önceden ısıtılmış mikrotübül stabilizasyon tamponunu yavaşça ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika daha inkübe edin.
  3. Daha sonra, kılcal yükleme ucuyla pipetleme yaparak mikrotübülleri kesin (~ 25-30 kez).
  4. Motiliteli akış odasını daha önce tarif edildiği gibi hazırlayın, 50 μL Sf9-saflaştırılmış GFP nanocisimciklerini (50 μL P12 tamponunda seyreltilmiş 100 nM'nin 2.5 μL'si) akıtın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin, kapak kayması nemli bir odada aşağı bakacak şekilde inkübe edin.
    NOT: Motorlar C-terminali mCitrin ile etiketlenmiştir. GFP nanogövdeleri, düşük ayrışma sabiti32 nedeniyle motorları hareketsiz hale getirmek için kullanılır.
  5. Spesifik olmayan protein adsorpsiyonunu önlemek için akış odasına 50 μL blok tamponu akıtarak kapak kayma yüzeyini bloke edin ve 5 dakika boyunca daha fazla inkübe edin.
  6. Motor karışımını 50 μL blok tampon, 1 μL 100mM ATP ve 5 μL 100 nM Sf9 saflaştırılmış kinesin-3 motorlarını pipetleyerek hazırlayın. Odaya akmadan önce hafifçe karıştırın ve nemli bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  7. Odayı 50 μL P12 kazein ile iki kez yıkayın.
  8. Steril bir mikrosantrifüj tüpünde, kayma testi karışımını aşağıdaki sırayla hazırlayın, 10 μM taksol ile 45 μL P12-kazein, 1 μL 100 mM ATP, 0.5 μL 8 mg / mL katalaz, 0.5 μL 20 mg / mL glikoz oksidaz, 0.5 μL 2.25 M glikoz ve 1 μL kesilmiş floresan mikrotübüller. Hareketlilik odasına akmadan önce içeriği yavaşça karıştırın ve odanın uçlarını sıvı parafin mumu ile kapatın.
  9. 100 ms pozlamada TIRF aydınlatması altında kayan görüntü mikrotübülleri ve ekli EM-CCD kamera ile görüntüleri yakalayın.
    NOT: Ortalama mikrotübül kayma hızı, ImageJ29'daki özel olarak yazılmış bir eklenti kullanılarak yaklaşık 100 ayrı mikrotübülün kare kare manuel olarak izlenmesiyle belirlenmiştir. Bir histogram üreterek ve bir Gauss fonksiyonuna uyarak ortalama mikrotübül kayma hızını belirleyin (Şekil 5C, D).

Sonuçlar

Aktif ve fonksiyonel rekombinant motor proteinleri Sf9-bakülovirüs ekspresyonunu kullanarak büyük ölçekte eksprese etmek ve saflaştırmak için, sistemin Sf9 hücrelerini enfekte etmek için bir kodlama dizisi taşıyan viral parçacıkların üretilmesine ihtiyacı vardır. Bunu başarmak için, Sf9 hücreleri KIF1A (1-393LZ)-3xmCit-FLAG kodlayan rekombinant bacmid ile transfekte edildi. 72 saat sonra, önemli bir hücre popülasyonu, genişlemiş hücreler ve çekirdeklerle yeşil floresan proteininin (mCitrine)...

Tartışmalar

Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi, yüksek verimli protein üretimi için en çok yönlü ve başarılı yöntemlerden biridir 19,36,37. Sf9 hücrelerinin posttranslasyonel modifikasyon yeteneği, memeli sistemi15 ile oldukça karşılaştırılabilir. Bu sistemi kullanmanın önemli bir dezavantajı, yavaş ve kontaminasyona karşı hassas olmasıdır. En kritik adımlardan biri, Sf9 hücrelerinde etk...

Açıklamalar

Yazarların beyan etmek için rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Teşekkürler

VS ve PS, Prof. Kristen J. Verhey'e (Michigan Üniversitesi, Ann Arbor, MI, ABD) ve Prof. Roop Mallik'e (Hindistan Teknoloji Enstitüsü Bombay (IITB), Mumbai, Hindistan) çalışma boyunca koşulsuz destekleri için teşekkür eder. Not: Proje boyunca verdiği destek için Dr. Sivapriya Kirubakaran'a teşekkür eder. V.S., DBT (Hibe No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 ve BT/RLF/Re-entry/45/2015) ve DST-SERB (Hibe No.: ECR/2016/000913) aracılığıyla finansman sağlamaktadır. P.K.N, ICMR'yi finansman için kabul etmektedir (Hibe No. 5/13/13/2019/NCD-III). Not: DST'den fon kabul etmektedir (Hibe No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S, IIT Gandhinagar'ın bursunu kabul eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinityBiolegend651502For protein purification
AprotininSigmaA6279For protein purification
CellfectinInvitrogen10362100For Sf9 transfection
DTTSigmaD5545For motility assays and protein purification
FLAG peptideSigmaF3290For protein purification
GlycerolSigmaG5516To freeze the protein
HEPESSigmaH3375For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630SigmaI8896For Sf9 lysis buffer
KClSigmaP9541For buffers preparation
LeupeptinSigmaL2884For protein purification
MgCl2SigmaM2670For buffers preparation
NaClSigmaS7653For preparing lysis buffer
PMSFSigmaP7626For protein purification
Sf9 cellsKind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottlesThermo Scientific4115-0125For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X)Thermo Scientific10902-096 -500mlFor culturing Sf9 cells
SucroseSigmaS1888Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s mediaThermo Scientific11595030 -500mlFor Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATPSigmaA2647For motility and gliding assay
BSASigmaA2153For blocking motility chamber
CatalaseSigmaC9322For motility and gliding assay
DMSOSigmaD5879For dissolving Rhodamine
EGTASigma3777For preparing buffers
GlucoseSigmaG7021For motility and gliding assay
Glucose oxidaseSigmaG2133For motility and gliding assay
GTPSigmaG8877For microtubule polymerization
KOHSigmaP1767Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPESSigmaP6757For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needleDispovanFor shearing microtubules
CaseinSigmaC3400For microtubule glidning assay
GFP nanobodiesGift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)For attaching motors to the coverslip
RhodamineThermo Scientific46406For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tipsEppendorfFor Sf9 culture and purification
15ml concal tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
35mm cell culture dishCole Palmer15179-39For Sf9 culture
BalanceSartorious0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubatorREMIFor Sf9 suspenculture at 28oC
CameraEMCCD Andor iXon Ultra 897For TIRF imaging and acquesition
Double sided tapeScotchFor making motility chamber
Glass coverslipFisherfinest12-548-5Asize; 22X30
Glass slideBlue StarFor making motility chamber
Heating blockNeuationDissolving paraffin wax
Inverted microscopeNikon Eclipse Ti- UTo check protein expression
Lasers488nm (100mW)For TIRF imaging
Liquid nitrogenFor sample freezing and storage
Microcapillary loading tipEppendorfEP022491920For shearing microtubules
MicroscopeNikon Eclipse Ti2-E with DIC set upFor TIRF imaging
Mini spinGenetix, BiotechAsia Pvt.LtdFor quick spin
Objective100X TIRF objective with 1.49NA oil immersionFor TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XEBeckman CoulterFor protein purification
ParafilmEppendorf
pH-meterCorningCoring 430To adjust pH
Pipette-boyVWRFor Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21Thermo ScientificFor protein purification
Sorvall ST8R centrifugeThermo ScientificProtein purification
ThermoMixerEppendorfFor microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotorBeckman coulterSW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubesBeckman5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixerNeuationSample mixing
WaxSigmaV001228To seal motility chamber

Referanslar

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır