Pnömoni Çözünürlüğünü Değerlendirmek için Deneysel Model

Özet

Bu el yazması, farelerde enfeksiyöz bir pnömoni modelinin oluşturulmasını ve bakteri yetiştirme ve intratrakeal damlatma yöntemleri ile birlikte yaralanma çözünürlüğünün ilgili karakterizasyonunu açıklamaktadır. Bağışıklık ortamını değerlendirmek için yüksek boyutlu akış sitometrisi kullanan yeni bir yaklaşım da açıklanmaktadır.

Özet

Akut respiratuar distres sendromu (ARDS), hızlı alveoler hasar ve ciddi hipoksemi ile karakterize akut akciğer hasarına neden olur. Bu da yüksek morbidite ve mortaliteye yol açmaktadır. Şu anda, insan ARDS'nin karmaşıklığını özetleyen klinik öncesi modeller yoktur. Bununla birlikte, enfeksiyöz pnömoni modelleri (İİAB) ARDS'nin ana patofizyolojik özelliklerini çoğaltabilir. Burada, C57BL6 farelerinde canlı Streptococcus pneumoniae ve Klebsiella pneumoniae'nin intratrakeal damlatılmasıyla indüklenen bir PNA modelini açıklıyoruz. Modeli değerlendirmek ve karakterize etmek için, yaralanmaya neden olduktan sonra, akciğer hasarı belirteçlerini ölçmek için vücut ağırlığı ve bronkoalveoler lavaj (BAL) seri ölçümleri gerçekleştirdik. Ek olarak, hücre sayımı ve diferansiyelleri, BAL protein miktarı, sitospin, bakteri kolonisi oluşturan birim sayıları ve histoloji için akciğerleri hasat ettik. Son olarak yüksek boyutlu akım sitometrisi yapıldı. Bu modeli, akciğer hasarının erken ve geç çözünürlük aşamalarında bağışıklık ortamını anlamak için bir araç olarak öneriyoruz.

Giriş

Akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS), yoğun bakım ünitesi (YBÜ) hastalarının yaklaşık %10'unu ve mekanik ventilasyon altındaki bireylerin %23'ünü etkileyen ve %35-%46 arasında bir hastane mortalite oranına yol açan yaygın bir ölümcül ve engelleyici sendrom olmaya devam ^etmektedir1. Ayrıca, son COVID-19 pandemisi, ARDS çalışmasının önemini bir kez daha vurgulamıştır. COVID-19 pozitif vakalar, ARDS mortalitesinde bir artışa neden olmuş ve farmakolojik tedavilerin sınırlılığını vurgulamıştır².

İnsanlarda ARDS, hızlı başlangıçlı hipoksemi (PaO₂ / FiO₂ < 300) ve aşırı alveolar-kapiller geçirgenlik ve alveolit^3'e bağlı hidrostatik olmayan bilateral pulmoner ödem kanıtı ile karakterizedir. ARDS geleneksel olarak çeşitli hakaretlere sekonder bir akut akciğer hasarı (ALI) paterni olarak tanımlansa da, bakteriyel ve viral pnömoni (PNA) en yaygın nedenler arasında yer almaktadır. Eksüdatif, proliferatif ve fibrotik evreler olmak üzere üç ana patofizyolojik evre tanımlanırken, ARDS'nin iki ana kardinal özelliği düzensiz inflamasyon ve alveolokapiller bozulmadır⁴. Bu süreçler sırasında, alveolar hasar, enflamatuar sitokinlerin salınmasıyla üretilir (ör., tümör nekroz faktörü [TNF-α], interlökin [IL-1β, IL-6, IL-8, vb.]), nötrofil ve inflamatuar makrofaj akışı ve protein açısından zengin sıvının taşması. Sonuçta, bu olaylar yamalı ve bilateral alveoler hasara yol açar 5,6,7,8.

Erken akciğer hasarı ve inflamasyonunun anlaşılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiş olmasına rağmen, PNA'nın rezolüsyonunun altında yatan mekanizmalar daha az bilinmektedir ve gelecekteki mekanik araştırmaların odak noktası olmalıdır. Bu yöntem makalesinin temel amacı, araştırmacılara ARDS'nin ana patofizyolojik özelliklerini kopyalayabilen bir enfeksiyöz pnömoni yaralanma çözünürlük modeli sunmaktır. Bu modelin, akciğer iltihabı ve onarımının çözümünün altında yatan biyolojik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacağını ve böylece kurtarma terapötikleri için bir platform görevi göreceğini öneriyoruz.

ARDS sırasında meydana gelen ana fizyopatoloji aşamaları, inflamatuar yanıt, doku hasarı, fizyolojik disfonksiyon, alveolit ve alveolar-kapiller bariyerin değişmesinin histolojik kanıtını içermesi gereken ALI'nin klinik öncesi hayvan modellerinde tekrarlanabilir⁹. PNA ve ALI'yi indükleyen bir fare modeli, yüksek tekrarlanabilirliği, hızlı üremesi ve mekanik ve moleküler çalışmaları gerçekleştirmek için birden fazla aracın mevcudiyeti nedeniyle avantajlıdır. İnsan ARDS^9'un tüm özelliklerini tam olarak özetleyen tek bir model yoktur.

Farelerde PNA modelleri, insanlarda enfeksiyöz ARDS tarafından üretilen hızlı başlangıç, histolojide doku hasarı kanıtı, alveolo-kılcal bariyer bozukluğu, inflamatuar yanıt kanıtı ve fizyolojik işlev bozukluğu gibi temel patofizyolojik mekanizmaların replikasyonuna izin verirken, mütevazı mortalite üretirken¹⁰ . Enfeksiyöz modeller, patojenin lokal veya sistemik olarak verilmesiyle indüklenebilir, intranazal, intratrakeal ve intravenöz uygulama en sık uygulama yollarıdır. İntratrakeal yol, enfeksiyöz ajanın akciğerlere doğrudan aşılanmasına izin verir, aerosolizasyonu azaltır ve uygulamayı optimize eder^11,12.

Canlı Streptococcus pneumoniae (Spn) veya Klebsiella pneumoniae'nin (Kp) intratrakeal damlatılması ile PNA'nın klinik öncesi bir murin modeli için metodoloji burada açıklanmaktadır. Bu modeller, bakteriyel PNA tarafından üretilen ARDS'nin iyi bir vekilini temsil eder ve aşağıdakiler de dahil olmak üzere çeşitli avantajlara sahiptir: insan PNA-ARDS'nin yaygın nedenleri (toplum ve hastane kaynaklı); yüksek tekrarlanabilirlik; mortalite ve yaralanma, alveolit ve alveolokapiller disfonksiyona yol açan sağlam bir enflamatuar yanıt sergilemek için kolayca titre edilebilir (farklı derecelerde pulmoner inflamasyonun modellenmesi); akciğer hasarının erken ve geç evrelerinin değerlendirilmesi ve çözülmesi; ve PNA-ARDS'nin farklı aşamalarında terapötik stratejilerin değerlendirilmesi.

Protokol

Bu çalışmada açıklanan tüm hayvan protokolleri, hayvan protokolü MO21M160 için Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. Ek olarak, deneyler hayvan araştırmaları için kurumsal, eyalet ve federal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirildi.

DİKKAT: Aşağıda açıklanan tüm protokollerin çoğaltılmasının, biyogüvenlik kabini altındaki tüm kurumsal BSL-2 yönergelerine uygun olarak bir Biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) kabininde gerçekleştirilmesi gerekir.

1. Bakteri stoklarının ticari döngülerden kaplanması

NOT: Bu protokol, sağlayıcıdan elde edilen çeşit ilmeklerden başlayarak Spn (ATCC 49619) ve Kpn (ATCC 43816) için bakteri stoklarının yetiştirilmesi için kullanılabilir (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın).

1. %5'lik bir koyun kanı agar plakasını bir kuluçka makinesinde 37 °C'de 15 dakika ısıtın. Bu amaçla bir hücre inkübatörü kullanılabilir.
2. Kaputun altında, kılıfı bakteri aşılama halkasından çıkarın ve zikzak bir desen izleyerek agar plakasına çizerek dikkatlice yayın. Kopya olarak ayrı bir plaka kullanarak bu adımı tekrarlayın. Aynı döngü ile en fazla beş plaka çizilebilir.
3. Optimum bakteri üremesi için plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Bakterileri 3 gün boyunca günlük olarak geçirin. Kanlı agar plakalarını 37 ° C'de 15 dakika ısıtın, tek kullanımlık bir aşılama halkası kullanarak ilk agar plakasından 15 ila 20 koloni alın ve bunları yeni, önceden ısıtılmış bir agar plakasına yayın. Plakayı uygun şekilde etiketleyin.

2. Gelecekte kullanılmak üzere bakteri üremesi ve depolanması

1. 3 gün sonra, bir çizgi halkası ile kanlı agar plakasından 30'a kadar koloni alın ve doğrudan Todd Hewitt suyu (TH suyu) içeren 250 mL'lik bir şişeye yerleştirin. 37 ° C'de, 250 rpm'de çalkalayarak, yaklaşık 4 saat% 5 CO₂ ile inkübe edin.
2. OD_620nm'yi 0.3'e ulaşana kadar ölçmek için her 15 dakikada bir alikot alın, bu da mL başına yaklaşık 3 x 10⁸ koloni oluşturan birime (CFU) eşdeğerdir.
3. Yeni bakteri stoğunun 1 mL'sini hemen 2 mL'lik kriyojenik şişelere boşaltın. Taze aliquoted şişeleri 5 dakika boyunca sıvı nitrojen içinde dondurun. Bakteri parçalarını -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın (şişeler, güçlerini kaybetmeden önce 6-8 aya kadar kullanılabilir).
4. 7 günlük donmadan sonra, alikotlar hayvan çalışmaları için kullanılabilir. Bu nedenle, bakterilerin yeni konsantrasyonunu belirleyin.

3. İntratrakeal damlatma için bakteri çözme

1. Bir kanlı agar plakasını bir çalkalayıcıda 37 °C'de 10 dakika ısıtın. Dondurucudan yeni stok şişelerinden birini alın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda yaklaşık 2 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak çözdürün. O-ringe veya kapağa ılık suyla dokunmaktan kaçının.
2. Bakteri kolonilerini manuel olarak saymak için bir kan agar plakası üzerindeki plaka. 1 x ^10-6 seyreltme gerçekleştirin ve önceden ısıtılmış bir kan agar plakasında son seyreltmeden 200 μL plaka yapın. Bunu iki kopya halinde yapın.
3. Bakterilerin en iyi şekilde büyümesi için plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Ertesi gün, yeni bakteri konsantrasyonunu belirlemek için aşağıdaki formülü uygulayın: CFU/mL = (koloni sayısı x seyreltme faktörü) / kaplanmış stok hacmi

4. Canlı bakterilerin intratrakeal damlatılması

NOT: Bu protokol, intratrakeal olarak 50 μL'lik bir hacim aşılamak için optimize edilmiştir. Bakteri stokları 6-9 aya kadar saklanabilir. Her şişede bakteriyel CFU'yu sağlamak için, her deneyden önce plakaladığınızdan emin olun, bakteri stok CFU'sunu yukarıda açıklandığı gibi hesaplayın ve sonraki seyreltmeler için TH suyu kullanın.

DİKKAT: Biyogüvenlik kabininin altında, steril cerrahi aletler kullanarak bir kemirgen hayatta kalma prosedürü gerçekleştirin.

1. İntraperitoneal olarak 100 mg / kg ketamin ve 2.5 mg / kg asetilpromazin enjekte ederek fareyi uyuşturun. Bir seferde enjekte edilen fare sayısı için tekrarlayın.
   NOT: Fareler, hayvan kullanımını kolaylaştırmak için izoflurana maruz kalabilir. Bununla birlikte, önemli hayvan sıkıntısına neden olmadan intraperitoneal anestezikleri enjekte edebilen deneyimli bir işleyici, izofluran maruziyetini önleyebilir. Enjekte edilecek fare sayısı cerrahın uzmanlığına bağlıdır.
2. Tüm fareler uygun anestezi altında olduktan sonra, anesteziyi kuyruk tutamıyla onaylayın. Anestezi uygulanmış fareyi temiz ve sterilize edilmiş bir yüzeye yerleştirin, hayvanı kesici dişlerinden asın ve ön ayakları nazikçe bantlayın (Şekil 1A).
   NOT: Hayvan sağlığını sağlamak için, anestezi uygulanan tüm hayvanlarda kornea kayganlığı sağlayın. Karboksimetilselüloz göz damlası kullanılabilir, göz başına bir damla uygulanır.
3. Boyun bölgesini tıraş edin ve bölgeyi klorheksidin ve% 70 alkol ile dezenfekte edin. Cerrahi makas kullanarak, trakeayı görüntülemek için 1 cm'lik yüzeyel orta hat boyun kesisi yapın (Şekil 1B). Küçük bir kesi yeterli olmalıdır, ancak bol miktarda yağ dokusu görülürse, trakeayı görselleştirmek için yağ dokusunu dikey olarak dikkatlice inceleyin.
   NOT: Yalnızca uç tekniği ile steril eldivenler ve steril aletler kullanın. İşlem steril koşullar altında yapılırsa enfeksiyon riski minimumdur.
4. Forseps kullanarak, her fareyi entübe edin. Dili nazikçe dışarı doğru çekin ve kateteri trakeaya doğru ilerleterek ağızdan 20 G'lik bir anjiyo-kateter sokun. Entübasyonu kolaylaştırmak için trakea üzerine hafif bir baskı uygulayın.
   NOT: Trakea fare gövdesinin önünde olduğundan, kateterin ucunu hafifçe bükün, çünkü bu, fareyi başarılı bir şekilde entübe etmek için açıyı elde etmeye yardımcı olacaktır. Boyun kesisi esas olarak görselleştirme amaçlı yapılır; Alternatif olarak, operatör trakeayı kör olarak entübe edebilir.
5. Entübasyondan sonra, entübasyonu onaylamak için fareyi bir solunum cihazına bağlayın. Bu prosedürde kullanılan normal ventilatör parametreleri 200 μL strok hacmi ve dakikada 200 stroktur. Hızlı ve kolay onay için ventilatör oranını kısa bir süre yukarı ve/veya aşağı çevirin.
6. Entübasyonu onayladıktan sonra, fareyi solunum cihazından ayırın ve 200 μL'lik bir pipet jel yükleme ucu kullanarak anjiyo-kateter yoluyla 50 μL bakteri ajanını dikkatlice damlatın. Kontrol fareleri için 50 μL steril TH suyu enjekte edin.
7. Bakteriyel ajanı damlattıktan sonra, solunumu yeniden başlatmaya yardımcı olmak için fareyi tekrar solunum cihazına bağlayın. Fareyi 30-60 saniye solunum cihazında bırakın. Tüm fareleri enjekte ettikten sonra solunumlarını izleyin. Yavaş bir solunum paterni varsa, fareleri tekrar solunum cihazına bağlayın.
8. Cilde küçük bir damla yapıştırıcı ekleyerek kesiği kapatın. Cilt kıvrımlarını bir araya getirin ve tutkal kuruyana kadar hafif bir baskı uygulayın.
9. Fareleri iyileşmek için bir ısıtma yastığına yerleştirin ve yeterli bilinçlerini geri kazanana kadar yakından izleyin. Tamamen iyileştikten sonra fareleri kafese geri aktarın. Ameliyat sonrası ağrı / sıkıntı yönetimi için, fareler deri altından (SC) 0.05-0.1 mg / kg'lık bir dozla buprenorfin ile tedavi edilebilir.
   NOT: %20'den fazla kilo kaybı olan veya işlem sonrası uyuşukluk, suya veya yiyeceğe ulaşamama, nefes almada zorluk, dış uyaranlara tepkide bozulma veya zihinsel uyanıklıkta azalma gibi önemli sıkıntılar yaşayan hayvanlara ötenazi yapılmalıdır.

5. Bronkoalveoler lavaj ve akciğer hasadı

1. Fareyi% 5 izofluran içeren kapalı bir kaba koyarak ötenazi yapın. Fare nefes almayı bıraktıktan sonra 1 dakika boyunca izofluran maruziyetine devam edin. Ötenaziyi doğrulamak için torakotomi yapın.
   NOT: Görsel ve fizik muayene ile ötenaziyi onaylayın. Kalp atmayı bırakmış ve fareler nefes almıyor olmalı. Mukoza zarları beyaz veya soluk olmalıdır.
2. Fareyi temiz bir cerrahi tahta üzerine sırtüstü pozisyonda yatırın ve kesici dişlerden asın. Fare derisine% 70 etanol püskürtün. Cerrahi makas kullanarak, farenin trakeasını görselleştirmek için küçük bir yüzeysel orta hat boyun kesisi yapın.
3. Trakeayı 20 G'lik bir kateter ile kanüle edin. Dikkatlice, 1 mL'lik bir şırınga kullanarak intratrakeal olarak 1 mL kalsiyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Tam akciğer genişlemesine izin verin ve ardından aynı şırıngayı kullanarak sıvıyı aspire edin. Bu adımı toplam 2 mL boyunca tekrarlayın.
4. BAL'ı 2 mL'lik bir alikot içine aktarın. 2 mL'lik son hacim için bu adımı iki kez gerçekleştirin. Alveolar boşluğun bozulma riski yüksek olduğu için akciğerleri bir seferde 1 mL'den fazla lavaj yapmayın.
5. Göğüs boşluğunu açın ve makas ve forseps kullanarak akciğeri, kalbi ve trakeayı ortaya çıkarın. Diyaframı dikkatlice inceleyin ve göğüs kafesini çıkarın. Akciğer dokusunu sıkıştırmadığınızdan emin olun.
6. Kan kaybına izin vermek için abdominal aortu transekt edin. Makas kullanarak sağ ventrikülde yaklaşık 2 mm'lik küçük bir kesi yaparak akciğer dokusunu perfüze edin ve 20 G kateter kullanarak 5 mL soğuk PBS enjekte edin. PBS akciğere perfüze etmelidir. Yeterli bir perfüzyon yapılırsa, akciğer dokusu beyaza dönecek ve PBS abdominal aort yoluyla intravasküler bölmeyi terk edecektir.
7. Dikkatlice, akciğerleri çıkarın ve histoloji veya tek hücreli süspansiyona daha fazla işlem yapmak için trakeadan inceleyin.
8. Histoloji için işleniyorsa, akciğerleri formalin çözeltisi (nötr tamponlu% 10) ile 25 cm H₂O'ya kadar şişirmek için dikkatlice 20 G'lik bir kateter yerleştirin. Akciğerler insüflasyona uğradıktan sonra, trakeanın altından yaklaşık 5 cm uzunluğunda bir 3.0 dikiş ipi geçirin ve formalinin akciğer dokusunda kalmasını sağlamak için iki kez sıkıca bağlayın. Nazikçe, akciğeri dokuların geri kalanından ayırın ve 10 mL formalin çözeltisi içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.

6. Bronkoalveoler lavaj işleme

1. BAL'ı 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücresiz süpernatanı ayrı bir tüpte çıkarın ve -80 °C'de saklayın.
   NOT: BAL süpernatında, protein miktar tayini (örneğin, BCA testi¹³) veya spesifik biyobelirteçlerin veya sitokinlerin ölçümü (ELISA testleri ve MSD ve Luminex gibi platformlarla çoklu tahliller) dahil olmak üzere daha fazla analiz yapılabilir.
2. 1 dakika boyunca 100 μL parçalama tamponu ekleyerek kırmızı kan hücrelerini parçalayın. 1 mL PBS ekleyerek parçalanma reaksiyonunu nötralize edin. BAL'ı 5 dakika boyunca 4 ° C'de 500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
3. Hücreleri PBS'de yeniden süspanse edin (100-300 μL; hücre pelet boyutuna bağlı olarak). Manuel veya otomatik hücre sayımı ile %0,4 tripan mavisi lekesi olan bir hücre sayımı gerçekleştirin. Daha fazla test için sıvı nitrojen içinde akış sitometrisi boyama ve/veya kriyoprezervasyon (kriyoprezervasyon solüsyonunda yeniden süspanse ederek) için kalan peleti kullanın.

7. Tek hücreli süspansiyon için akciğer işleme

1. Akciğeri dokuların geri kalanından nazikçe inceleyin ve 5 mL soğuk PBS içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Akciğeri PBS'den çıkarın ve bir kağıt havlu kullanarak kurulayın.
2. 1 mL düşük glikozlu Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerine (DMEM) 1 mg DNaz ve 5 mg kollajenaz ekleyerek bir sindirim kokteyli hazırlayın. Akciğeri 1 mL sindirim kokteyli içeren bir C-tüpüne aktarın.
3. C-tüpünü doku ayrıştırıcıya aktarın ve akciğer dokusunu işlemek için standartlaştırılmış protokolü izleyin¹⁴.
4. C-tüpüne 10 mL soğuk PBS ekleyin ve uygun şekilde karıştırın. 50 mL'lik bir konik tüpün üstünde 70 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak tek hücreli süspansiyonu filtreleyin. Filtrelemeyi iki kez gerçekleştirin.
5. Süspansiyonu 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1 mL parçalama tamponu ekleyin. Parçalanma reaksiyonunu durdurmak ve süpernatanı çıkarmak için 10 mL soğuk PBS ekleyin.
6. Süspansiyonu 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve 10 mL soğuk PBS ekleyin.
7. Manuel veya otomatik hücre sayımı ile tripan mavisi lekesi ile hücre sayımı yapın. Daha fazla test için akış sitometrisi boyama ve/veya sıvı nitrojen içinde kriyorezervasyon için bir hücre peleti kullanın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan prosedürler, farelerde bakteriyel pnömoniye bağlı akciğer hasarının altında yatan patofizyolojik mekanizmaların modellenmesine izin verdi. Modellemeye başlamak için, C57BL / 6 vahşi tip (WT) fareler Jackson Laboratuvarı'ndan elde edildi ve enstitünün hayvan tesisinde yetiştirildi. 8 haftalık erkek WT C57BL / 6 farelerine, TH et suyu (kontrol), 3 x 10⁶ CFU canlı Spn veya 200 CFU canlı Kpn'nin intratrakeal aşılaması uygulandı. Enfeksiyondan sonra, fareler Spn ve Kpn için sırasıyla 6 ve 10 gün boyunca izlendi. Enfekte gruplar, enfekte olmayan kontrole kıyasla daha düşük vücut ağırlığı gösterse de, Spn grubu vücut ağırlıklarını taban çizgisine doğru geri kazanırken, Kpn ile enfekte olmuş fareler 6 günlük enfeksiyondan sonra yavaş iyileşme gösterdi (Şekil 2A). Çalışma süresi boyunca, vücut ağırlığının% 20'nin üzerinde olması nedeniyle ötenazi geçirmesi gerekmeyen hiçbir fareye ihtiyaç duyulmadı ve ağrı ve sıkıntı olduğuna dair bir kanıt yoktu.

Akciğer hasarını farklı aralıklarla ölçtük. Enfekte gruplarda BAL protein konsantrasyonu ve hem BAL hem de akciğerler için toplam hücre sayısı belirgin şekilde daha yüksekti (Şekil 2). Her iki modelde de inflamatuar süreci gösteren temsili histolojik kesitler, aşılamadan sonraki 2, 4 ve 6. günlerde elde edildi (Şekil 3), Kpn ile enfekte farelerde (Şekil 4), hatta 10. günde bile kalıcı alveolar inflamasyon kanıtı gösterdi. Kpn ile enfekte fareler 10. güne kadar yaralanmaya devam ederken (Şekil 2 ve Şekil 4), Spn ile enfekte fareler akciğer iltihabını 6. güne kadar çözdü (Şekil 2 ve Şekil 3).

Akciğer tek hücreli süspansiyonlar, floresanla aktive hücre sıralamasında (FACS) 18 renkli bir panel kullanılarak, Spn modelinde enfeksiyondan sonraki 6. günde yüksek boyutlu akış sitometrisi ile bağışıklık manzarasını ayırt etmek için kullanıldı. T-dağıtılmış stokastik komşu gömme (t-SNE) kullanılarak, bağışıklık hücresi bileşimindeki genel farklılıklar görselleştirilebilir, artan sayıda granülosit (CD45 +, CD11b +, CD24 +, MHC-II-), interstisyel makrofajlar (CD45 +, CD11b +, MHC-II-, CD24-), monositler (CD45 +, CD11b +, MHC-II-, CD24-, CD64-), B hücreleri (CD45 +, CD19 +) ve T hücreleri (CD45 +, CD3 +), doğal öldürücü hücreler (CD45 +, CD3 +, NK1.1 +) dahil, Şekil 5'te gösterildiği gibi. Geçit stratejileri Şekil 6'da gösterilmiştir.

Şekil 1: Canlı bakterilerin intratrakeal damlatılması için cerrahi prosedür. (A) Farenin steril cerrahi alanda, kesici dişlerden asılı pozisyonu. (B) Kesi alanı ve trakea maruziyeti. (C) 20 G kateterin yerleştirildiği entübasyon işlemi. Biorender.com ile oluşturulan figür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Pnömoni modellerinden sonra akut akciğer hasarı (ALI) profilleri. (A) Taban çizgisine göre zaman içinde vücut ağırlığı, Kpn ve Spn'ye karşı kontrol (n = 4, grup başına). (B) BCA testi ile BAL toplam protein tayini (n = 4, grup başına). (C) Kontroldeki BAL toplam hücre sayıları (n = 3), Kpn (n = 4) ve Spn (n = 3). (D) Kontroldeki akciğer toplam hücre sayısı (n = 3), Kpn (n = 4) ve Spn (n = 3). (E-G) Kontroldeki BAL sitospininin manuel histoloji sayısı (n = 3), Kpn (n = 4) ve Spn (n = 3) ile BAL hücre diferansiyeli. İstatistiksel testler, enfekte olmayan kontrol ile enfekte grupları karşılaştıran bireysel t-testi ile yapıldı. *p < 0.05. Veriler, her çizim için standart hata (SE) kullanılarak görüntülenir. Y ekseni, tüm paneller için enfeksiyondan sonraki günlerdir. Kısaltmalar: BAL = bronkoalveoler lavaj; Spn = Streptococcus pneumoniae; Kpn = Klebsiella pneumoniae. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Spn enfeksiyonu sırasında akciğer histopatolojik bulguları. Spn'nin intratrakeal enfeksiyonundan sonra ve 2, 4 ve 6. günlerde temsili bir BAL ve akciğer bölümünün histolojik bölümlerinin hematoksilen ve eozin (H&E) boyanması. BAL büyütme = 100x; Akciğer büyütme = 10x. Kısaltmalar: BAL = bronkoalveoler lavaj; Spn = Streptococcus pneumoniae. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kpn enfeksiyonu sırasında akciğer histopatolojik bulguları. 2, 4, 6 ve 10. günlerde Kpn'nin intratrakeal enfeksiyonundan sonra temsili bir BAL ve akciğer bölümünün histolojik bölümlerinin hematoksilen ve eozin (H&E) boyanması. Görüntüler yüksek güçte büyütme gösterir (ölçek çubuğu = 50 μm). Kısaltmalar: BAL = bronkoalveoler lavaj; Kpn = Klebsiella pneumoniae. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: 6 günlük Spn enfeksiyonundan sonra çok renkli akış sitometrisi ile bağışıklık hücresi manzarası. (A) Akciğerin bağışıklık hücresi popülasyonlarını (CD45+) görselleştirmek için enfekte olmamış kontrol ile enfekte olmuş grubu karşılaştırmak için T-dağıtılmış stokastik komşu gömme (t-SNE) kullanıldı. (B) Akciğerdeki toplam CD45 + hücrelerinden bağışıklık hücresi frekanslarının özeti. (C) Her bir popülasyonun toplam hücre sayısı. İstatistiksel karşılaştırmalar, kontrol ve enfekte olanlar arasında t-testleri ile yapıldı. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001. Veriler, her çizim için standart hata (SE) kullanılarak görüntülenir. Kısaltmalar: BAL = bronkoalveoler lavaj; Spn = Streptococcus pneumoniae. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Başlangıçta ve pnömoni sonrasında akciğerlerdeki bağışıklık hücresi alt popülasyonunu tanımlamak için geçit stratejileri. BAL ve Akciğer hücre süspansiyonu çok renkli akım sitometrisi için boyandı. Enkaz ilk olarak SSC-A ve FSC-A kullanılarak dışarı çıkarıldı ve tek hücreler iki strateji ile kapılandı (SSC-W'ye karşı SSC-H ve FSC-W'ye karşı FSC-H). Canlı hücreler, SSC-A'ya karşı canlı/ölü ayrımcı kullanılarak tanımlandı. Sonraki hücre popülasyonları, önceden tanımlanmış belirteçler ¹⁵ ile tanımlandı. Kısaltma: BAL = bronkoalveoler lavaj. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

PNA'nın deneysel fare modelleri, ARDS'nin yaralanmasının altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları ve çözünürlüğü değerlendirmek için bir platform sunar. Değerlendirilebilecek patofizyolojik bileşenler arasında erken inflamatuar yolaklar, bakteriyel klirens, dinamik immün manzara değişiklikleri, inflamasyonun çözülmesi, fibroproliferasyon ve epitel ve vasküler onarım^{yer alır 16}. Bununla birlikte, bu pnömoniye bağlı akciğer hasarı modelini tekrarlamayı planlarken, yaş, cinsiyet, fare suşu, içsel konak faktörleri (örneğin, bağışıklığı baskılanmış durum), kullanılan spesifik patojen ve bakteri yükü ve prosedürü gerçekleştiren personelin deneyimi dahil olmak üzere çeşitli hususlar göz önünde bulundurulmalıdır.

PNA, ARDS'nin önde gelen nedenleri arasındadır. İnsanlarda toplum ve hastane kökenli PNA'nın yaygın nedenleri olan canlı Spn ve Kpn'yi kullanmayı tercih ettik¹⁷. Araştırmacının hipotezine en iyi uyan istenen mortalite ve yaralanma çözünürlük profilini elde etmek için canlı bakteri dozlarını titre ederek PNA'nın bakteriyel modellerini optimize etmeyi öneriyoruz. Farelerde Spn için 3 x 10⁶ CFU ve Kpn için 200 CFU'luk intratrakeal bakteri aşılamasını optimize ettik, bu da alveolar inflamasyona, alveolokapiller bariyerin bozulmasına ve organ disfonksiyonuna neden oldu (Şekil 2). Bununla birlikte, farklı kaynaklardan veya hatta çift döngüler içindeki bakteri yığınları, aynı suş ve CFU kullanıldığında bile farklı derecelerde iltihaplanma ve yaralanma gösterebilir.

Bu nedenle, bu yazıda sunulan sonuçları tekrarlamak için araştırmacılar burada açıklanan bakteri konsantrasyonu ile başlamalıdır; Bununla birlikte, benzer bir model profili elde etmek için dozu artırmaları veya azaltmaları gerekebilir. Bu nedenle, kullanılan her yeni bakteri partisinin potansiyel yaralanma çözme etkisi için optimize edilmesi gerekir. Araştırmacıların immünolojik mekanizmaları değerlendirmeleri ve özellikle pik enfeksiyonda veya sonrasında (örneğin, enfeksiyondan 2 gün sonra) terapötik müdahaleleri test etmeleri için platformlar olarak hizmet edebilecek, biri kendi kendine çözülen (Spn) ve diğeri yavaş/çözülmeyen (Kpn) olmak üzere iki farklı çözünürlük sonucuna sahip sağlam bir PNA modeli sunuyoruz.

Yaş, cinsiyet, zorlanma ve genetik faktörler yaralanma rezolüsyon modellerinin kinetiğini etkiler¹⁶. Örneğin, cinsiyet, kadınlarda erkeklere kıyasla daha hızlı çözünürlük sağlar¹⁸; Bu nedenle, bakteri yükündeki artış, erkeklerde kadınlara kıyasla mortalitenin artmasına ve gecikmiş çözülmeye yol açar. Yaşlanma, kullanılan bakterilerin CFU'sunu titre ederken göz önünde bulundurulması gereken başka bir faktördür. Yaşlanan fareler, belirtilen Spn dozunu kullandığımızda% 100 mortalite gösterdi (burada gösterilmemiştir). Genç fareler en sık pnömokok PNA modellerinde (6 ila 14 hafta arasında değişen) kullanılırken, yaşlı fareler (19-26 aylık) değişmiş bir bağışıklık tepkisi gösterir ve PNA^11'de yaşlanmanın rolünü araştırmak için kullanılır. Yaşlanan hayvanlarda hayatta kalabilmek için CFU'yu %300'e düşürmek zorunda kaldık (burada gösterilmemiştir). Bu çalışmada erkek C57BL / 6 fareleri (8-12 haftalık) kullanıldı ve enfeksiyondan 6 ila 10 gün sonra takip edildi. Suşlar arasında duyarlılıkta önemli farklılıklar da bulunabilir; BALB/C ve C57BL6/J gibi akraba suşların enfeksiyona farklı yanıtları vardır^11,19.

Bakterilerin intratrakeal olarak doğrudan aşılanması, aşının (% 99'a kadar) akciğerlere¹² daha hassas bir şekilde verilmesine izin verir, bu da daha az virülan serotipler için bir alternatifi temsil eder ve bakterilerin aerosolizasyonunu azaltır¹¹. Ancak invaziv bir işlem olduğu söylenebilir. Entübasyon zor olabilir, sistemik anestezi gerektirir ve ardından hava yolu ödemi ve stridor ile trakeal travmaya yol açabilir. Fareler, apneye yol açan bir vazovagal refleks geliştirebilir ve bunun için gerektiğinde ek ventilatör desteği sağlamak için küçük bir fare ventilatörüne sahip olmak gerekir. İşlemi gerçekleştiren cerrahın uzmanlığı, başarılı entübasyonu garanti etmek için kritik bir bileşendir¹¹. Çalışmamızda, uygun ağrı yönetimi ve vücut ağırlığının% 20'den fazla olmaması nedeniyle hiçbir fareye ötenazi yapılmasına gerek yoktu. Uyuşukluk, suya veya yiyeceğe ulaşamama, nefes almada zorluk veya zihinsel uyanıklıkta azalma gibi ağrı ve sıkıntı belirtisi görülmedi. Akciğerlere doğrudan bakteri verilmesinin alternatif yöntemleri orofaringeal aspirasyondur, ancak akciğer hasarının çözülmesi daha hızlı gerçekleşiyor gibi görünmektedir ve bazı bakteriler mide ve gastrointestinal sistemde sona erebilir²⁰.

PNA'nın klinik öncesi modelleri, araştırmacıların bağışıklık ortamını değerlendirmelerini sağlar. Bronkoalveolar ve interstisyel bölmeler, bağışıklık hücrelerindeki dinamik değişiklikler için değerlendirilebilir¹⁶. Ayrıca, hücreler, spesifik sitokin ve kemokin üretimlerini belirlemek için ex vivo olarak kültürlenebilir ve uyarılabilir. Burada, çok renkli akış sitometrisi kullanarak akciğer ve BAL'daki bağışıklık hücresi manzarasını keşfetmeye odaklanıyoruz. Tek hücreli RNA dizilimi, yaralanma çözünürlüğünün farklı aşamalarında hücreye özgü transkriptomik imzaları anlamak için de yapılabilir.

PNA-ARDS modelleri, hastalığın seyri sırasında vücut ağırlığını ölçerek erken tespit edilebilen sistemik etkiler oluşturur¹⁰. ARDS'nin sistemik etkilerini doğrudan ölçmesek de, organ disfonksiyonu kimya profillerinin kan ölçümü ve histoloji için dalak, böbrek ve karaciğer gibi farklı dokuların toplanması ile de değerlendirilebilir. Pnömokokal PNA-ARDS'nin sistemik etkileri daha önce aynı bakteri suşunu kullanan diğer gruplar tarafından tanımlanmıştır²¹.

Burada, insan ARDS'sinin altında yatan bazı temel patofizyolojik bulgulara benzeyen bir deneysel PNA modeli tanımlanmıştır. İnsan ARDS^9'un karmaşıklığını ve heterojenliğini tamamen özetleyen ideal modeller olmamasına rağmen, bu modeller akciğer hasarı ve onarımı mekanizmalarını incelemek için ilgili ve tekrarlanabilirdir, aynı zamanda akciğer iltihabının çözülmesini hızlandırmaya ve akciğer onarımını teşvik etmeye odaklanan yeni potansiyel farmakolojik hedeflerin tanımlanması için bir platform görevi görür.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-200 µL Round 0.5 mm Thick Gel-Loading Pipet Tips	Corning	4853
2 mL Cryogenic vials	Corning Incorporated	431420	2 mL self standing, round bottom, red cap, polypropylene
2 mL Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes	Fisherscientific	05-402-24C	Shape: Round, Length (Metric): 38mm, Diameter (Metric) Outer: 10mm, Capacity (Metric): 2mL
70 µm Cell Strainer	Falcon	352350	White, Sterile, Individually Packaged
96-well Clear Round Bottom	Falcon	353077	TC-treated Cell Culture Microplate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile
Acepromizine Maleate Injection, USP 500 mg/50 mL (10mg/mL)	Phoenix	NDC 57319-604-04	EACH mL CONTAINS: acepromazine maleate 10 mg, sodium citrate 0.36%, Citric acid 0.075%, benzyl alcohol 1% and water for injection.
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer	Quality Biological	118-156-721	4 x 100mL
Anti-mouse I-A/I-E	Biolegend	107628	APC/Cyanine7 anti-mouse I-A/I-E [M5/114.15.2]; Isotype: Rat IgG2b
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
BD Trypticase Soy Agar	BD-Biosciences	90001-276	5% Sheep Blood Prepared Media Stacker Plates, BD Diagnostics
Biotix Disposable Reagent Reservoirs	Biotix	89511-194
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrih	A4503
CD103	Invitrogen	509723	Integrin alpha E) Armenian Hamster anti-Mouse, FITC, Clone: 2E7
CD11b	Invitrogen	RM2817	PE-Texas Red, Clone: M1/70.15, Invitrogen
CD11c	BD Biosciences	565872	Hamster anti-Mouse, APC-R700, Clone: N418, BD Horizon
CD19	Biolegend	152410	APC anti-mouse CD19 [1D3/CD19]; Isotype: Rat IgG2a, κ
CD24	BD Biosciences	563450	Rat anti-Mouse, Brilliant Violet 711, Clone: M1/69
CD4	BD Biosciences	563790	BUV395; Clone: GK1.5
CD45	Biolegend	103157	Brilliant Violet 750 anti-mouse CD45 [30-F11]; Isotype: Rat IgG2b, κ;
CD8a	BD Biosciences	612759	Rat anti-Murine, Brilliant Ultraviolet 737, Clone: 53-6.7
Cell Counting Slides	Bio-rad	1450017	For TC20 Cell Counter
Cell strainer 70 µL Nylon	Falcon	198718	REF 352350
Collagenase Type1	Worthington Biochemical Corporation	LS004197
Culti-Loop Streptococcus pneumoniae	Thermo Scientific	R4609015	ATCC 4961
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrih	DN25
Disposable inoculation loops/needles	Fisherbrand	22-363-603	Color blue; Volume 1 µL
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)	Corning	10-014-CV
Fc Block	BD Biosciences	553142	CD16/CD32 Rat anti-Mouse, Unlabeled, Clone: 2.4G2
Formalin solution	Sigma-Aldrih	HT501640	Formalin solution, neutral buffered, 10%
Gauze Sponges, Covidien	Curity	2146-
gentleMACS C Tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235	SN: 4715
Hema 3 Manual Staining System and Stat Pack	Thermo Scientific	23123869
Isoflurane Liquid Inhalation	Henry Schein	1182097
IV CATHETER JELCO 20GX1.25"	Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc	405611
Ketamine HCl Injection	Henry Schein	1049007	Ketamine HCl Injection MDV 100mg/mL 10mL 10/Box
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816	subsp. pneumoniae (Schroeter) Trevisan
Loctite 409	Electron Microscopy Sciences	7257009
Ly-6C	Biolegend	128036	Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6C [HK1.4]; Isotype: Rat IgG2c
Ly-6G	BD Biosciences	740157	Rat anti-Mouse, Brilliant Violet 510, Clone: 1A8, BD Optibuild
MiniVent Type 845	Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus	4694	D-79232 March (Germany)
NK-1.1	BD Biosciences	553165	Mouse anti-Mouse, PE, Clone: PK136, BD
Phase Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CV	1X without calcium and magnesium,
Round Bottom	Sarstedt	55.476.305
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352235	With Cell Strainer Snap Cap, 5mL
SealRite 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	USA Scientific	1615-5500	Free of detectable Rnase, DNase, DNA and pyrogens.
Shandon EZ Single Cytofunnel	Epredia	A78710003
Siglec-F	BD Biosciences	562681	Anti-Mouse, Brilliant Violet 421, Clone: E50-2440
Silk Black Braided 30"(75 cm) Sterile, nonabsorbable surgical suture U.S.P.	Ethicon	K-834	0 (3.5 metric)
Stainless-Steel Slide Clip	Epredia	59910052
Sterile Single Use Vacuum Filter Units	Thermo Scientific	1660045
Syringe sterile, single use, 1 mL	BD-Biosciences	309628
TC20 Automatic Cell Counter	Bio-Rad	508BR05740
TipOne 200 ul yellow pipet tip refill	USA Scientific	1111-0706
TODD HEWITT BROTH	RPI	T47500
TPX Sample Chamber	Epredia	A78710018
TPX Single Sample Chamber, Caps and Filter Cards	Epredia	5991022
Trypan Blue	Bio-rad	1450022
U-100 Insulin Syringes	BD-Biosciences	329461
Wet-Proof Multi-Heat Electric Heat Pad	Cullus	Model PR7791AB	120 volst AC; 45 watts; Listed 562B/E26869