Kütle Spektrometrisi Kullanarak Tek Nöronlardaki RNA Modifikasyonlarını Karakterize Etme

Özet

RNA'nın transkripsiyon sonrası modifikasyonları, son zamanlarda merkezi sinir sistemi plastisitesi ile bağlantılı olan az çalışılmış bir translasyon düzenleme katmanını temsil eder. Burada, tek nöronlarda çok sayıda RNA modifikasyonunun eşzamanlı karakterizasyonu için numune hazırlama ve sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi yaklaşımı tanımlanmıştır.

Özet

RNA'nın transkripsiyon sonrası modifikasyonları (PTM'ler), merkezi sinir sisteminde (CNS) translasyonun düzenlenmesinde rol oynayan az çalışılmış bir mekanizmayı temsil eder. Son kanıtlar, spesifik nöronal RNA modifikasyonlarını öğrenme ve hafıza paradigmalarına bağlamıştır. Ne yazık ki, bu epitranskriptomik özelliklerin tespiti için geleneksel yöntemler, yalnızca toplu dokularda oldukça bol miktarda RNA modifikasyonlarını karakterize edebilir ve aktif davranışsal devreler içindeki bireysel nöronlar için mevcut olabilecek benzersiz PTM profillerinin değerlendirilmesini engeller. Bu protokolde, tek nöronlarda çok sayıda modifiye ribonükleoziti aynı anda tespit etmek ve ölçmek için kütle spektrometrisi (SNRMA-MS) ile tek nöron RNA modifikasyon analizi - bir yaklaşım açıklanmaktadır. Yaklaşım, deniz yumuşakçaları Aplysia californica'nın bireysel nöronları kullanılarak, nöron hücresi cisimciklerini açığa çıkarmak için majör CNS ganglionlarının cerrahi izolasyonu ve enzimatik tedavisi ile başlayarak, ardından keskin iğneler ve bir mikropipet kullanılarak manuel tek nöron izolasyonu ile doğrulanmıştır. Daha sonra, numunenin küçük bir tampon hacminde mekanik ve ısıl işlemi, sonraki RNA sindirimi için RNA'yı bireysel bir hücreden serbest bırakmak için yapılır. Modifiye nükleozitler daha sonra optimize edilmiş bir sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi yöntemi kullanılarak tanımlanır ve nicelleştirilir. SNMA-MS, A. CALIFORNICA'dan bilinen morfolojileri ve işlevleri olan tek, tanımlanmış nöronlar için RNA modifikasyon kalıpları oluşturmak için kullanılır . Nöronal ağlardaki bireysel nöronlar arasında RNA modifikasyonlarının heterojen dağılımını vurgulayan kalitatif ve kantitatif SNRMA-MS örnekleri sunulmuştur.

Giriş

RNA'nın kanonik nükleositlerindeki modifikasyonlar, protein translasyonunun düzenlenmesindeki sayısız rolleri nedeniyle giderek daha fazla tanınmaktadır. Bugüne kadar, metilasyondan, heteroatom ilavesinden, hücresel metabolitlerle konjugasyona kadar karmaşıklık bakımından değişen 150'den fazla benzersiz RNA modifikasyonu bildirilmiştir ^1,2. Epitranskriptom olarak da bilinen bu genişletilmiş RNA alfabesi, enzimatik yazarlar tarafından üretilir ve hücresel RNA'ların stabilitesini³, katlanır⁴ ve çeviri verimliliğini ^5,6'yı değiştirmekten sorumludur. Seçilmiş RNA modifikasyonları enzimatik silgiler^7,8 ile tersine çevrilebilirken, diğerleri RNA'lara substokiyometrik olarak ^9,10 olarak eklenir ve biyolojik sistemlerde modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş RNA dizilerinin karmaşık bir manzarasını oluşturur.

RNA modifikasyonlarının biyolojik fonksiyondaki önemi, modifikasyonların merkezi sinir sisteminin (CNS) alt bölgeleri de dahil olmak üzere farklı organ ve dokular arasında eşit olmayan dağılımı ile ^{gösterilir11}. Bu kimyasal heterojenlik, CNS gelişimi¹², stres tepkisi¹³ ve aktiviteye bağlı plastisite¹⁴ ile ilişkilendirilmiştir. CNS alt bölgeleri ayrıca, bireysel hücrelerin farklı kimyasal profiller sergilediği heterojen hücre popülasyonlarını içerir^15,16,17,18. Aynı tipteki tek hücreler bile, kısmen doku mikroortamları¹⁹ ve stokastik gen ekspresyonu²⁰ nedeniyle benzersiz transkriptomlar gösterebilir. Bununla birlikte, tek hücreli transkriptomun karakterizasyonu biraz rutin olsa da, çoklu RNA modifikasyonları için tek hücreli epitranskriptomlar oluşturmak için benzer yöntemler yoktur. CNS ve diğer biyolojik sistemlerdeki transkripsiyon sonrası modifikasyonların (PTM'ler) hücresel heterojenliğinin ve düzenleyici etkisinin kapsamlı analizi için RNA modifikasyonlarının bireysel hücrelerdeki dağılımını profilleyebilen yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır.

Toplu hücrelerde/dokularda çok sayıda RNA modifikasyonunun eşzamanlı ölçümü, sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) teknikleri kullanılarak kolayca gerçekleştirilir. Modifiye ribonükleositlerin LC-MS / MS analizi için, RNA hücrelerden (tipik olarak 10 3-10 ⁶ hücre) ekstrakte edilir, çökeltme ve yeniden süspansiyon ile saflaştırılır ve daha sonra nükleositlere sindirilir. Kanonik ve modifiye nükleositlerden oluşan numune karışımı daha sonra analit ayrımı ve tespiti için LC-MS sistemine enjekte edilir ve bu da bir organizmadaki RNA modifikasyonlarının tam tamamlayıcısının belirlenmesine yol açar^21,22,23. LC-MS / MS son zamanlarda nörobiyolojik modelin CNS'sinde 26 RNA modifikasyonunu belirlemek için kullanıldı, Aplysia californica (A. californica). Bu epitranskriptomik işaretlerin bazılarının bolluğu, hayvandaki davranış değişiklikleriyle ilişkili zamana ve bölgeye bağlı dinamikler sergiledi²⁴. Bununla birlikte, RNA modifikasyonlarını sadece yöntemin sınırlı duyarlılığı nedeniyle >10³ hücre içeren toplu örneklerde tespit etmek mümkündü. Bu daha büyük örnekler muhtemelen popülasyon ortalamalarına sahip bireysel hücrelerin benzersiz ve işlevsel olarak önemli RNA modifikasyon profillerini gizlemiştir. Numune hazırlama koşullarının dikkatli kontrolü, küçük hacimli numunelerde RNA modifikasyonları için tespit sınırlarını iyileştirmiş olsa da^25,26,27,28, tek hücrelerde birden fazla modifiye ribonükleoziti tespit edebilen ve ölçebilen analitik yöntemlere ihtiyaç vardır.

Bu protokol, A. californica^29'un CNS'sinden tek nöronlarda bir düzineden fazla RNA modifikasyonunun tespit edilmesine izin veren kütle spektrometresi (SNRMA-MS) ile tek nöron RNA modifikasyon analizini sunar. Yaklaşım, majör CNS ganglionlarından tek, tanımlanmış hücrelerin cerrahi izolasyonu ve ardından MS uyumlu bir tamponda mekanik hücre lizisi, RNA denatürasyonu ve enzimatik hidrolizi içeren optimize edilmiş bir numune hazırlama iş akışından oluşur. Transkripsiyon sonrası modifiye nükleozitlerin tanımlanması ve nicelleştirilmesi daha sonra LC-MS / MS kullanılarak gerçekleştirilir. snrma-ms, tek nöronlar için transkripsiyon sonrası RNA modifikasyon profillerinin edinilmesini kolaylaştırarak RNA modifikasyon analizi alanında karşılanmamış bir ihtiyacı karşılar ve gelecekteki diğer hücre tiplerine uygulama potansiyeline sahiptir.

Protokol

1. Malzeme ve çözeltilerin hazırlanması

1. Sıkı bir arıtma sisteminden elde edilen suda 460 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl 2,₂₂ mM MgCl_{2, 26} mM MgSO₄ ve 10 mM HEPES ile yapay deniz suyu (ASW) hazırlayın. 1 M NaOH veya HCl kullanarak pH'ı 7,8'e ayarlayın. tipik olarak, 1 L ASW hazırlayın ve kullanıma kadar 14 ° C'de saklayın.
2. 10.000 U / mL penisilin G, 10 μg / μL streptomisin ve 10 μg / μL gentamisin içeren bir ASW-antibiyotik çözeltisi hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın. Deneyden hemen önce, dondurulmuş antibiyotik stok çözeltisini 20-40 mL ASW'de 1:100 çözün ve seyreltin. Çalışan ASW çözeltisindeki antibiyotiklerin son konsantrasyonu 100 U / mL penisilin G, 100 μg / mL streptomisin ve 100 μg / mL gentamisin'dir.
3. 1 μL 10 μg / μL sığır serum albümini, 0.5 μL 0.5 μg / μL pentostatin, 0.495 μL 2 U / μL alkalen fosfataz, 1 μL 0.1 U fosfodiesteraz I (10 mM MgCl 2'de) ve Serratia marcescens'ten (₂₅ U) 0.38 μL endonükleazı birleştirerek bir RNA sindirim tamponu hazırlayın. Birden fazla numuneyi analiz ediyorsanız, her bir reaktifin hacminin analiz edilecek numune sayısıyla çarpıldığını ve pipet transfer adımlarından kaynaklanan arızi reaktif kaybını hesaba katmak için bir tane daha içeren ayrı bir tüpte bir ana karışım hazırlayın.
4. Nöronların manuel izolasyonu için birkaç keskin iğne (cam veya metal) hazırlayın. ^30'da olduğu gibi tungsten telin elektrokimyasal aşındırılmasıyla evde metal iğneler yapın veya satın alın. Bir mikropipet çektirici kullanarak kalın veya standart duvar borosilikat cam kılcal damarlardan (1 mm dış çap) cam iğneler hazırlayın. Mevcut yöntem için, iğne ucu çapını 1-5 μm arasında, boyun uzunluğu 100-150 μm arasında tutun.
   NOT: Hem metal hem de cam iğnelerin imalatı, araştırmacının bireysel ihtiyaçlarına ve araştırılan spesifik biyolojik modele uygun araçlar üretmek için optimize edilebilir.

2. Tek nöronun izolasyonu

1. 0,33 M MgCl₂ solüsyonunu 14 °C'ye soğutun. 50 mL'lik bir şırınga kullanarak, MgCl 2 çözeltisini hayvanın vücut boşluğuna enjekte ederek A. californica'yı (150-250 g) uyuşturun. En iyi sonuçlar, çözelti hacminin (mL) hayvan vücut kütlesine (g) 1:3 oranı ile elde edilir. Hayvanın rahatlaması için yaklaşık 3 dakika bekleyin, dokunsal stimülasyona yanıt olarak vücut kasılmaları göstermediğinden emin olun.
2. Hayvan ventral tarafını (ayak tarafı) diseksiyon tepsisine yerleştirin. Hayvanı cerrahi makas kullanarak hayvana doğru yerleştirilmiş bir künt uçla disseke edin ve ayaktan uzunlamasına bir kesim yapın.
3. Vücut boşluğunda bulunan iç organları ve CNS gangliyonlarını açığa çıkarmak için hayvan vücudunun rostral, kaudal ve lateral taraflarını sabitleyin. Majör CNS ganglionlarını, sinirleri ve ganglionlardan kaynaklanan bazı bağlayıcıları cerrahi olarak keserek hayvandan izole edin.
4. Ganglionları Streptomyces griseus'tan (ASW-antibiyotik çözeltisinde 10 mg / mL) proteaz tip XIV çözeltisine batırın ve 30 dakika veya 1 saat (serebral ganglion için) 34 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Kuluçka süresi mevsime, hayvan büyüklüğüne ve durumuna ve ayrıca hedeflenen nöronlara bağlıdır. Bazı nöronların izolasyonu diğerlerinden daha uzun inkübasyon gerektirir ve deneysel olarak belirlenmelidir.
5. Gangliyonları 6x'i ASW-antibiyotik çözeltisi ile durulayın ve tüm ganglionları, ~ 5 mm'lik bir açıklığa kesilmiş bir polipropilen transfer pipeti kullanarak ASW-antibiyotik çözeltisi ile doldurulmuş silikon polimer kaplı bir kaba aktarın. Ganglionların pipete yapışmasını en aza indirmek için pipeti ASW'de 1 mg/mL sığır serum albümini ile tedavi edin (isteğe bağlı). Ganglionları her zaman ASW'ye batırılmış halde tutun.
   NOT: Enzimatik tedavi, nöronların ve çevresindeki bağ dokusunun mekanik stabilitesini azaltır ve sonuç olarak, gangliyon transferi sırasında havaya maruz kalma nedeniyle nöronal membranlar hasar görebilir.
6. Ganglionları sabitleyin ve ganglion kılıflarını çıkarmak için mikro makas ve ince forseps kullanın. Yeterince güçlü enzimatik işlemle, kılıf açmak için cam veya metal iğneler kullanın.
7. İlgilenilen A. californica nöronlarını görsel olarak tanımlayın. Bu çalışmada, aşağıdaki hücreler incelenmiştir: abdominal ganglionda R2, plevral ganglionda LPl1, serebral ganglionda metaserebral hücreler (MCC'ler) ve bukkal ganglionda B2 hücreleri. Her hücre tipinin boyutlarını ve hacimlerini belirlemek için toplam 20x büyütmede kalibre edilmiş bir mikroskop kullanarak tüm nöral ve gangliyonik preparatların optik görüntülerini alın.
8. Çekilmiş bir cam kılcal damar veya keskin tungsten iğneleri kullanarak, tanımlanan hücreyi toplu gangliondan dikkatlice izole edin.
9. Plastik bir mikropipete az miktarda (1 μL) ASW çekin ve ardından izole edilmiş hücreyi 4 μL 0.365 M amonyum asetat (pH 9.2) içeren bir PCR numune tüpüne aktarın. Boş ölçümler için, ganglionu içeren çanaktan ASW-antibiyotik çözeltisinin 5 μL alikotunu toplayın ve sindirim tamponu ile karıştırın (aşağıda açıklanmıştır).

3. SNRMA-MS için hücre lizisi ve RNA sindirimi

1. İzole edilmiş nöronları tekrarlanan aspirasyon ve 0.365 M amonyum asetat içinde bir mikropipet (~ 100 μm iç çap) ile dağıtarak lize edin. Bazı küçük hücreler hemen yırtılmayabilir; Onları lize etmek için, çekilmiş bir cam kılcal damar ile hücrenin çapı boyunca basınç uygulayın.
2. Numuneleri aşağıdaki sıcaklık programıyla ısıtmak için bir termal döngücü kullanın: 3 dakika boyunca 95 °C, 3 dakika boyunca 10 °C, 10 °C'de tutun. Numune tüpünü termal döngüleyiciden çıkarın.
3. Her numune için 3.375 μL RNA sindirim tamponu ekleyin ve çözeltiyi birkaç kez çekip dağıtarak bir mikropipet kullanarak çözeltiyi karıştırın. PCR tüpünün duvarlarına yapışan sıvı damlacıklarını döndürmek için 30 s boyunca 2700 x g'de minyatür bir tezgah üstü santrifüj kullanın.
4. Termal döngüdeki numuneleri 3 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin, ardından 10 °C'de tutun (ısıtılmış kapak AÇIK olarak ayarlanmış). Numune 10 °C'ye soğutulduktan hemen sonra, otomatik numune alma tüpünde kabarcık oluşumunu önlemeye özen göstererek, çözeltinin 7 μL'sini 250 μL'lik bir kesici uç ile donatılmış bir otomatik numune alma şişesine aktarın.

4. Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi

NOT: Tek nöron sindirimlerini ve otantik modifiye nükleozid standartlarını, bir elektrosprey iyonizasyon kaynağı ve altı portlu yönlendirici valf ile donatılmış bir LC-MS / MS sistemi kullanarak analiz edin.

1. LC sistemini kanonik ve modifiye nükleositlerin ayrılmasına hazırlamak için, bir C18 kolonunu (150 mm x 2,1 mm, 2,2 μm partikül boyutu, 120 şgözenek çapı) %99 mobil faz A (5 mM amonyum asetat, pH 5,6) ve %1 mobil faz B (60/40 mobil faz A/asetonitril (ACN)) ile 36 °C'de 12 dakika boyunca 0,2 mL/dak akış hızında dengeleyin. Mobil fazların hazırlanması için LC-MS sınıfı çözücüler kullanın.
2. LC dengelenirken, 5 μL/dak akış hızına sahip şırınga pompası aracılığıyla kütle spektrometresine 50/50 ACN/su içinde 1 mM'lik bir sodyum asetat çözeltisi ekleyerek kütle spektrometresini kalibre edin. Kalibrasyondan sonra, LC akışını kütle spektrometresine yeniden bağlayın.
3. Aşağıdaki doğrusal gradyan parametrelerini programlayın: 0-5 dakika için %1 B, 9 dakikada %5 B, 11 dakikada %7 B, 13 dakikada %10 B, 32 dakikada %15 B, 38 dakikada %40 B, 43 dakikada %50 B, 50 dakikada %100 B, 60 dakikada %100 B, 61 dakikada %1 B, ve bir sonraki enjeksiyondan önce% 1 B'de 12 dakikalık bir yeniden dengeleme.
4. MS cihazını aşağıdaki parametrelerle pozitif modda çalıştırın: kılcal gerilim 4.500 V'a ayarlanmış, kurutma sıcaklığı 275 °C,_N2 kurutma gazı 5 L/dak ve nebülizasyon gazı 1 bar. Saptırıcı valfini analizin ilk 2 dakikası için boşa ve çalışmanın geri kalanı için kaynak sağlayacak şekilde ayarlayın.
5. 110-600 m / z aralığında kütle spektrumları toplayın. Veritabanı² kullanılarak oluşturulan tercih edilen bir kütle listesi ve 0,5 ± bir yalıtım penceresi kullanarak 3 s döngü süresi boyunca 35-40 eV'de çarpışma kaynaklı ayrışma için iyonları seçin. İyonları üç spektrumdan sonra parçalanmadan hariç tutmak için aktif dışlama kullanın.
6. Yoğunlukları sırasıyla 4 Hz ve 1 Hz'de 50.000 sayımın üstünde ve altında olan iyonlar için dinamik MS/MS spektrumu alımını ve 1.990 sayımda iyon seçimi için minimum eşiği ayarlayın.
7. Kantitatif SNRMA-MS için, bilinmeyen endojen analit konsantrasyonlarının interpolasyonuna izin vermek için modifiye nükleozid standartları için elde edilen ekstrakte edilmiş iyon kromatogramı (EIC) tepe alanlarını kullanarak en az beş konsantrasyonda kalibrasyon eğrileri oluşturun.
   NOT: Vücut kütleleri 150-250 g olan hayvanlardan elde edilen nöronlar tipik olarak modifiye nükleozitler için 0.02 pmol ila 2 pmol arasında değişen kalibrasyon eğrileri gerektirir, ancak bu değerler cihazın hassasiyetine bağlı olarak değişebilir.

5. Veri analizi

1. Modifiye nükleozitler için EIC'ler oluşturun (veritabanı değerlerinden m/z ²). MS2 spektrumları ve LC tutma özelliklerini^{veritabanı değerleri 2} ile karşılaştırarak varsayılan modifiye nükleozitlerin kimliklerini doğrulayın. A. californica'dan tek nöronlarda tespit edilen tipik RNA modifikasyonlarının bir listesi için Tablo 1'e bakınız.
2. Modifiye edilmiş ve kanonik nükleozitlere karşılık gelen pikleri manuel olarak entegre edin ve bu değerleri bir elektronik tabloya kaydedin. Her modifiye nükleozid için pik alanını, numunede tespit edilen kanonik sitidin, idrar ve guanozin için pik alanların toplamı ile normalleştirin.
   NOT: Adenosin, CNS'de dinamik bir nöromodülatör³¹ olarak rolü nedeniyle normalizasyona dahil edilmez.
3. Her bir tek nöron örneğinden ve sinyal-gürültü oranları >10 sergileyen modifiye nükleozitler için karşılık gelen normalleştirilmiş tepe alanlarından oluşan bir veri matrisi oluşturun. Ana bileşen analizi (PCA) gerçekleştirin ve ilk iki ana bileşeni puan grafiğinde görüntüleyin. Nükleozid standartlarının seri seyreltilmesinden elde edilen EIC tepe alanlarından doğrusal kalibrasyon eğrileri oluşturun ve tespit edilen analitlerin konsantrasyonlarını hesaplayın.

Sonuçlar

SNRMA-MS, tanımlanan nöronların lizis, sindirim ve LC-MS / MS analizi için küçük numune hacimlerine manuel izolasyonunu içerir (Şekil 1A). Bu iş akışı, A. californica'nın CNS'sinden tek nöronlarda bir düzineden fazla RNA modifikasyonunu rutin olarak tespit etti (Şekil 1B), bu hayvanın bilinen epitranskriptomunun neredeyse yarısının kapsamını temsil ediyor²⁴ tek bir hücrede. Örneğin, LPl1 nöronunun (~ 500 μm çapında) SNRMA-MS'ye maruz bırakılması, 15 ± 1 RNA modifikasyonunun (n = 3) tespit edilmesiyle sonuçlandı. Modifiye nükleozitler üç özniteliğe dayanarak pozitif olarak tanımlanmıştır: LC tutma özellikleri, tam kütle ve MS2 parçalanma profilleri veritabanı^2'de sağlanan değerlere kıyasla. Tablo 1, LPl1 nöronunda tespit edilen tüm RNA modifikasyonlarının bir listesini göstermektedir. Bu deneyler için kullanılan yüksek çözünürlüklü kuadrupol uçuş süresi kütle spektrometresi, modifiye nükleozid N6,6-dimetiladenozin için m / z 164'te karakteristik MS2 fragman iyonunun tespitinin yanı sıra 4 ppm'lik bir kütle doğruluğu sağladı (m⁶⁶A, Şekil 1B). Veri tabanında biriken bulgularla (N6-metiladenozin (m 6 A) sonra m^66Asalınımları) ile aynı fikirde olan LC ayırma verileriyle birleştirildiğinde, SNRMA-MS yaklaşımı, modifiye nükleozid kimliklerinin doğru atandığını göstermiştir.

SNRMA-MS platformu, tek nöronların RNA modifikasyon profillerini oluşturmak ve toplu dokularla ilişkilerini araştırmak için kullanılabilir. R2 nöronları, abdominal ganglionda bulunan büyük (~ 500 μm çapında) kolinerjik hücrelerdir. SNRMA-MS, R2 nöronlarındaki RNA modifikasyonlarını ve çevresindeki toplu abdominal ganglionu analiz etmek için kullanıldı (Şekil 2A). Her nöron/ganglion örneğinde RNA modifikasyonları için normalize edilmiş pik alanlar (n = 7) PCA için girdi olarak kullanılmış ve R2 nöronlarının içinde bulundukları ganglionlara kıyasla farklı RNA modifikasyon profilleri sergilediklerini ortaya koymuştur (Şekil 2B). Bu, PCA skor grafiğinin farklı bölgelerini işgal eden R2 nöronları ve abdominal ganglionlar için veri noktaları ile kanıtlanmıştır. Benzersiz modifiye nükleozid paternleri için daha fazla destek, hem tek nöronlarda hem de toplu dokuda yaygın olarak tespit edilen 13 RNA modifikasyonu için çift yönlü karşılaştırmaların yapıldığı ayrı bir hayvan kohortundan (n = 7) elde edildi (Şekil 2C). İki modifiye nükleosit, psödoüridin (Ψ) ve 2'-O-metilguanosin (Gm), abdominal ganglionlarda R2 nöronlarına kıyasla anlamlı derecede daha yüksek bolluktaydı. Belirtilen R2 nöron-ganglion çiftleri ile RNA modifikasyonlarının bir alt kümesini görüntülerken, abdominal ganglionların tümü daha yüksek Ψ ve Gm seviyeleri sergiledi ve R2 nöronlarından biri hariç hepsi, karşılık gelen ganglionlardan daha yüksek miktarda 2'-O-metiladenozin () bolluğuna sahipti (Şekil 2D). Genel olarak, SNRMA-MS sonuçları, tek hücrelerin RNA modifikasyon profillerinin aynı dokudaki toplu hücrelerden ayrılabileceğini ilk kez ortaya koymaktadır.

Model hayvan A. californica'yı araştırmak için SNRMA-MS'i kullanmak, tanımlanmış, işlevsel olarak farklı nöronlardaki RNA modifikasyon profillerini karakterize etmek için eşsiz bir fırsat sağlar. RNA modifikasyonları, tanımlanan dört hücrede SNRMA-MS tarafından değerlendirildi: R2 ve LPl1 (homolog, defansif mukoza salınımında rol oynayan kolinerjik hücreler)32, MCC'ler (beslenmede rol oynayan serotonerjik modülatör nöronlar)³³ ve B2 hücreleri (bağırsak hareketliliğinde rol oynayan peptiderjik nöronlar)³⁴. Bu tanımlanmış nöronlardaki altı RNA modifikasyonunun PCA'sı, enzimatik tedaviden hemen sonra izole edilmiş veya 48 saat boyunca bir gangliyon preparatında kültürlenmiş, tek hücreli epitranskriptomların stabilitesini ve dinamiklerini göstermiştir. İşlevsel olarak farklı hücrelerdeki RNA modifikasyonları, skor grafiğinde benzersiz kümeler oluştururken, homolog R2 / LPl1 nöronları birlikte kümelenmiştir (Şekil 3A). Yükleme grafiği, farklılıkların öncelikle 2'-O-metiladenozin () ve N1-metiladenozin^{(m 1}A) dahil olmak üzere metiladenozinin konumsal izomerlerinin bolluğundan kaynaklandığını göstermektedir (Şekil 3B). Aynı analizde, taze izole edilmiş hücrelerin ve 48 saat boyunca in situ (yani kendi gangliyonlarında) kültürlenmiş hücrelerin bir karşılaştırması yapıldı. PCA skor grafiğinde gösterildiği gibi, fonksiyonel olarak farklı hücreler RNA modifikasyon profilleri ile ayırt edilebilir kaldı.

Kantitatif SNRMA-MS, otantik standartların mevcut olduğu seçilmiş RNA modifikasyonlarının mutlak miktarlarını belirlemek için kullanılabilir. M1 A, Ψ, 2'-O-metilsitidin (Cm), ve m⁶A için harici kalibrasyon eğrileri üretildi ve MCC ve R2 / LPl1 hücre çiftlerindeki her modifiye nükleozid miktarı interpolasyon ile belirlendi (Şekil 4A-E). İki çift simetrik MCC'deki m1 A ve Ψ hücre içi miktarları benzer görünürken, bu modifikasyonların miktarlarındaki daha büyük farklılıklar üç çift R2 /^LPl1hücresinde gözlenmiştir. İncelenen hücrelerin fiziksel büyüklüğünden kaynaklanan farklılıkları açıklamak için, RNA modifikasyon miktarları, modifiye nükleositlerin hücre içi konsantrasyonlarını elde etmek için hücre çaplarının optik ölçümünden hesaplanan hücre hacimleri ile normalleştirildi. MCC'ler ve R2 / LPl1 nöronları arasında hücre içi Cm ve konsantrasyonlarında anlamlı farklılıklar gözlendi. Genel olarak, SNRMA-MS, tek nöronlardaki RNA modifikasyonlarının hem kalitatif hem de kantitatif profillemesini sağlar.

Şekil 1: SNRMA-MS iş akışı ve tek nöronlardaki çoklu RNA modifikasyonlarının LC-MS / MS ile tespiti. (A) Kılıfsız bukkal ganglionun ve bir numune tüpüne tek nöron izolasyonunun fotoğrafları. Ölçek çubuğu = 200 μm, oklar tanımlanmış B1 hücresini gösterir. LC-MS/MS analizi için numune hazırlama prosedürünün bir diyagramı da gösterilmiştir. (B) Tek bir LPl1 nöronunda RNA modifikasyonları için üst üste bindirilmiş EIC'ler, N6, N6-dimetiladenozin (m 66 A) için MS1 ve MS2 spektrumlarını gösteren iç^kısımlar. Modifiye nükleositler için EIC'ler üretmek için kullanılan m/z değerleri için Tablo 1'e bakınız. Bu rakam^29'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: SNRMA-MS, tek nöronların ve toplu dokunun RNA modifikasyon profillerini ayırt eder. (A) A. californica CNS'nin şeması ve R2 nöronlarını ve çevresindeki abdominal ganglionu analiz etmek için iş akışı. Fotoğraf abdominal ganglion ve R2 nöronu (görünürlük için Hızlı Yeşil boya enjekte edilmiş) göstermektedir. (B) PCA skorunu (üstte) ve yükleme (altta) grafiklerini oluşturmak için 13 RNA modifikasyonundan göreceli tepe alanları kullanıldı. (C) Abdominal ganglion ve R2 nörondaki RNA modifikasyonlarının ikili olarak karşılaştırılması. Hata çubukları ±1 standart sapma (SD), *p < 0,05, ***p < 5 x 10⁻⁴, Bonferroni-Holm düzeltmesi ile eşleştirilmiş t-testini temsil eder. (D) Her hayvan için R2-abdominal ganglion çiftlerinin damla çizgileriyle gösterildiği C panelinden seçilmiş RNA modifikasyonlarının karşılaştırılması. Bu rakam^29'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: A. californica CNS'den tanımlanmış, işlevsel olarak farklı nöronlardaki RNA modifikasyonlarının profillenmesi . (A) MCC'ler için PCA skoru grafiği ve 48 saat boyunca in situ kültürü takiben yeni izole edilmiş veya izole edilmiş B2, R2 ve LPl1 hücreleri (cMCC, cB2, cR2, cLPl1 ile gösterilir) ve (B) bu hücrelerde yaygın olarak tespit edilen altı RNA modifikasyonu için yükleme grafikleri. Bu rakam^29'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: A. californica nöronlarında kantitatif SNRMA-MS. Kantitatif SNRMA-MS, tek, tanımlanmış A. californica nöronlarında birkaç modifiye nükleozid için mutlak miktarlar ve hücre içi konsantrasyonlar sağlar. Serebral ganglionda (A) sol ve sağ MCC'lerin (sırasıyla LMCC ve RMCC) ve abdominal ganglionda (B) R2 ve plevral ganglionda LPl1'in fotoğrafları. Görünürlüğü artırmak için hücreler daire içine alınır. Tek hücrelerde (renkli noktalar) modifiye nükleozid miktarlarının interpolasyonu için kullanılan (C)^m1A ve (D) Ψ (üçgenler) için doğrusal kalibrasyon grafikleri. Her hayvandan hücre çiftleri 1-3 olarak etiketlenir. (E) MCC ve R2/LPl1 hücre çiftlerinde beş modifiye nükleozidin hücre içi konsantrasyonları. Kalın çizgiler hücre çiftlerini birbirine bağlar. *p < 0.05, **p < 0.005, Bonferroni−Holm düzeltmesi ile eşleştirilmiş t-testi, MCC'ler için n = 2 hayvan (toplam dört hücre) ve R2/LPl1 için n = 3 hayvan (toplam altı hücre). Bu rakam^29'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

RNA modifikasyonu	Kısaltma	Elüsyon sırası (C18)	EIC için m/z	MS2 için m/z
dihidroüridin	D	1	247.09	115
psödoüridin	Y	2	245.08	209/179/155
3-metilsitidin	m3C	3	258.11	126
N1-metiladenozin	m1A	4	282.12	150
5-metilsitidin	m5C	5	258.11	126
N7-metilguanozin	m7G	6	298.12	166
2'-O-metilsitidin	Santim	7	258.11	112
inosin	I6A	8	269.09	137
2'-O-metilguanozin	Gm	9	298.12	152
N2-metilguanozin	m2G	10	298.12	166
N2, N2, N7-trimetilguanosin	m227G	11	326.15	194
N2, N2, -dimetilguanozin	m22G	12	312.13	180
2'-O-metiladenozin	Ben	13	282.12	136
N6-metiladenozin	m6A	14	282.12	150
N6,N6-dimetiladenozin	m66A	15	296.14	164
N6-isopenteniladenozin	i6A	16	336.17	204/136/148

Tablo 1: A. californica'dan tek nöronlarda tespit edilen RNA modifikasyonları. Modifiye nükleozitlerin karakterizasyonu için LC tutma sırası, EIC'lerin üretilmesi için m / z ve karşılık gelen CID fragmanları dahil olmak üzere nitelikler sağlanır.

Tartışmalar

SNRMA-MS, LC-MS platformuna teslim edilebilen küçük, MS uyumlu bir numune hacmi elde etmek için optimize edilmiş bir numune hazırlama yaklaşımından yararlanır. CNS ganglionlarının ilk enzimatik ön tedavisi, hem kılıflarının çıkarılma kolaylığını hem de izolasyon sırasında tek nöronların dayanıklılığını belirler. Serebral ganglion genellikle bukkal, plevral ve abdominal ganglionlara kıyasla nispeten kalın kılıfı nedeniyle genişletilmiş enzimatik tedavi gerektirir. Tek nöron izolasyonlarını gerçekleştiren bireysel araştırmacılar, mikromakas ve ince forseps kullanırken kılıfın ne kadar dayanıklı olması gerektiği konusunda farklı tercihlere sahip olabilir. Bununla birlikte, ganglionların aşırı sindirilmemesi önemlidir, çünkü bu yapısal bütünlüklerinde bir kayba, hedef hücreleri tanımlamak için kritik olan konumsal bilgi kaybına ve / veya hücre lizisine yol açabilir. Gangliondan izolasyonu takiben, nöronu numune tüpüne aktarırken minimum miktarda izolasyon ortamının aspire edilmesini sağlamak önemlidir. ASW ortamı, RNA hidrolizi sırasında sindirim enzimlerine müdahale edebilecek yüksek konsantrasyonda tuzlar içerir ve ayrıca numuneyi seyreltir.

Mekanik lizis adımı sırasında, büyük nöronların (>250 μm çapında) bir mikropipetten tekrar tekrar geçtikten sonra yırtılması yaygındır. Daha küçük nöronlar, tipik olarak hücre üzerinde bir cam kılcal damara basmayı içeren hücre lizisini sağlamak için ek dikkat gerektirebilir. Bu durumda, kılcal kuvvetler nedeniyle numune tamponunun kısmi bir hacminin kılcal damara çekilmesi mümkündür. Bu hacim, hiçbir numunenin kaybolmamasını sağlamak için cam kılcal damarın ucuna basınç uygulanarak numune tüpüne geri iletilebilir.

En iyi sonuçlar, RNA sindirimi için enzimler eklemeden önce bir ısıtma adımı dahil edilerek elde edilir. Bunun nedeni, 95 ° C'de ısıtmanın, RNazlar^35'in aktivitesini engelleyebilecek ve RNA biyopolimerlerinden salınan nükleozid miktarını azaltabilecek RNA ikincil yapılarını denatüre etmesidir. Kararlı izotop etiketli metiyonin ile çivilenmiş örnekleri kullanan kontrol deneyleri, ısıya bağlı RNA modifikasyon artefaktlarının, ısısız SNRMA-MS protokolü^29'a göre RNA modifikasyonları için gözlenen artan tepe alanlarının nedeni olup olmadığını araştırmak için daha önce gerçekleştirilmiştir. Optimize edilmiş SNRMA-MS yöntemini kullanarak RNA modifikasyonları için geliştirilmiş sinyallerin RNA'nın üstün sindiriminden kaynaklandığını gösteren böyle bir etiketleme gözlenmemiştir.

Toplam RNA'yı hücrelerden izole etmek için kullanılan geleneksel yöntemler, fenol-kloroform ile sıvı-sıvı ekstraksiyonunu (LLE) ve ardından RNA çökeltmesini, yıkamayı ve yeniden süspansiyonunu içerir. Bu yaklaşımların, seçilmiş genlerin ekspresyonunun tanımlanmış A. californica nöronlarında^36,37'de kolayca izlenebildiği ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu deneyleri için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, LLE yöntemleri, LC-MS tarafından modifiye ribonükleozitlerin tespiti için yeterli RNA'yı geri kazanamazken, burada açıklanan SNRMA-MS yöntemi, çok sayıda RNA modifikasyonunun saptanmasını sağlar²⁹. Toplu doku/hücre örneklerinde spesifik RNA tiplerinin (örneğin, rRNA, tRNA, mRNA) modifikasyon profillerini değerlendirmek için, anyon değişimli katı faz ekstraksiyonu²⁴, hibridizasyon probu bazlı zenginleştirme³⁸ ve kromatografik fraksiyonasyon³⁹ yaklaşımları uygulanmıştır, ancak tek hücreli RNA saflaştırması için benzer yöntemler henüz mevcut değildir. Spesifik RNA tiplerini tek hücrelerden izole edebilen RNA fraksiyonasyon yaklaşımlarının geliştirilmesi, RNA modifikasyonlarının işlevine yönelik ek bir fikir verecektir.

SNRMA-MS, A. CALIFORNICA'daki tek nöronların RNA modifikasyon manzarasında daha önce karakterize edilmemiş heterojenliği ortaya çıkardı ve memeli hücrelerinde benzer şekilde farklı PTM profillerinin var olduğu düşünülebilir . Memeli hücreleri, bu protokolde analiz edilen büyük A. californica nöronlarına kıyasla nispeten küçük olduğundan, daha düşük tespit limitlerini kolaylaştırmak için küçük numune hacimlerinin işlenmesinde iyileştirmelere ihtiyaç vardır. Şu anda SNRMA-MS ~ 5 μL'lik hacimlerle sınırlı olsa da, mikroakışkan sıvı işleme cihazlarının iş akışına dahil edilmesiyle önemli iyileştirmeler elde edilmesi beklenmektedir. Ayrıca, otomatik veya yarı otomatik hücre izolasyonlarının uygulanması, numune verimini artıracak ve daha büyük hücre popülasyonlarının tek hücreli RNA modifikasyon analizine izin verecektir. Nanoflow LC ayrımları²⁷ ile arayüz oluşturarak, daha küçük hücrelerde epitranskriptomik izlerin karakterizasyonu sağlanabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Aplysia californica	National Resource for Aplysia (Miami, FL)		150–250 g (adult)
Benchtop equipment
Glass capillary puller	Sutter	P-97	Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment
Milli-Q water purification system	Millipore		Equipped with ESI source
Minicentrifuge for PCR tubes	LW Scientific	ZS-1
Optical Microscope	Zeiss	Stemi 2000C
Thermocycler	Techne	EW-93945-01
HPLC column and consumables
Acclaim RSLC 120 C18 column	Thermo Scientific	71399
Autosampler vials	Thermo Scientific	C4011-13
LC and MS Instrumentation and Software
DataAnalysis 4.4 software	Bruker
Dionex Ultimate 3000 nanoLC	Thermo Scientific
Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer	Bruker
RStudio	RStudio
Microdissection tools
Microscissors extra fine vannas 3.5”	Roboz	RS-5640
Tungsten needles	Roboz	RS-6065
Reagents/Materials
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	H3375
Alkaline phosphatase	Worthington Biochemical Corp.	LS004081
Ammonium acetate	Honeywell	17836
benzonase (endonuclease from S. marcescens)	EMD Millipore	70746-4
bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
gentamycin sulfate	Fisher Scientific	G1264
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M9272
magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	208094
nucleosides test mix	Sigma-Aldrich	47310-U
penicillin G	Sigma-Aldrich	P7794
pentostatin	Sigma-Aldrich	SML0508
phosphodiesterase I	Worthington Biochemical Corp.	LS003926
protease type XIV from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147
sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Standard glass capillaries	A-M Systems	626000	1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in
streptomycin sulfate	Sigma-Aldrich	S9137