In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Özet

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

Özet

Metastaz, kansere bağlı ölümlerin birincil nedeni olmaya devam etmektedir. Metastatik kaskadı karakterize eden olayların art arda gelmesi, terapötik müdahale için birçok fırsat sunar ve bunları farelerde doğru bir şekilde modelleme yeteneği, etkilerini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir. Burada, ortotopik primer meme tümörlerinin kurulması ve daha sonra in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanılarak akciğerde metastatik lezyonların oluşumu ve büyümesinin izlenmesi için adım adım bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, primer tümör kaçışından akciğerlerdeki büyümeye kadar tüm metastatik gelişim aralığı boyunca tedavinin veya biyolojik etkilerinin değerlendirilmesine izin verir. Meme ortotopik tümörleri, farelerde 4. meme bezine lusiferaz işaretli bir hücre süspansiyonunun enjeksiyonu yoluyla üretilir. Tümörlerin belirli bir süre büyümesine ve yayılmasına izin verilir ve daha sonra cerrahi olarak rezeke edilir. Rezeksiyon sırasında spontan akciğer metastazı tespit edilir ve zaman içindeki büyüme in vivo biyolüminesans görüntüleme kullanılarak izlenir. İstenen deneysel son noktada, aşağı akış analizi için akciğer dokusu toplanabilir. Yerleşik, klinik olarak belirgin metastazın tedavisi, evre IV kanser hastaları için sonuçları iyileştirmek için kritik öneme sahiptir ve deneysel akciğer metastazının kuyruk ven modelleri aracılığıyla değerlendirilebilir. Bununla birlikte, metastatik yayılım meme kanserinin erken dönemlerinde ortaya çıkar ve birçok hastada ameliyattan sonra gizli, subklinik yayılmış hastalık vardır. Bunun gibi spontan modellerin kullanılması, hastalığın tüm spektrumunu, özellikle pre-metastatik niş hazırlama gibi primer tümörün tedavisinin neden olduğu sistemik etkileri inceleme ve cerrahi sonrası hareketsiz ve subklinik hastalık üzerindeki tedavileri değerlendirme fırsatı sağlar.

Giriş

Metastaz - kanser hücrelerinin birincil tümörden vücudun diğer bölgelerine yayılması - kanser hastalarının% 90'ından fazlasında ölüm nedeni olmaya devam etmektedir. Bu süreç karmaşıktır, tümör hücrelerinin primer tümörden dışarı göçünü ve dolaşıma intravazasyonu, kanda sağkalımı, hedef organda ekstravazasyon ve sağkalımı, proliferatif durumun yeniden kurulmasını ve büyüme^1'i içerir. Metastazın erken veya geç evrelerini araştırmak için spontan ve nakledilebilir murin kanseri modelleri kullanılmıştır ve her biri kendi avantaj ve dezavantajlarını sunmuştur^ve bunlar ayrıntılı olarak tartışılmıştır ^2,3,4.

Daha önce düşünülenden farklı olarak, tümör hücreleri, tümör gelişimi sırasında erken evrelerde primer tümörü terk eder, bazen uzak dokularda uzun süreler boyunca uykuda kalır 5,6,7,8. Ek olarak, primer tümörün hastalık sonuçları üzerinde sahip olduğu, genellikle metastatik toprağı koşullandıran veya kaşeksi ^9,10,11,12 sırasında kas kaybını uyaran çözünür faktörlerin ve eksozomların salgılanması yoluyla ortaya çıkan güçlü sistemik etkilere dair artan kanıtlar vardır. Bu nedenlerden dolayı, primer tümörün ilk varlığında metastatik sürecin uzunluğunun modellenmesi, bu süreçleri yönlendiren biyolojinin daha eksiksiz bir şekilde anlaşılmasını sağlamak ve süreci bozmayı veya geciktirmeyi amaçlayan potansiyel yeni müdahaleleri test etmek için gerekli hale gelmiştir.

Bu çalışmada, meme bezine ortotopik olarak enjekte edilen izlenebilir hücre hatlarından kendiliğinden ortaya çıkan akciğer metastazını ölçmek için bir protokol tanımlanmıştır, bu da metastatik kaskadda yukarıdaki adımların tümünü modelleyen bir süreçtir. Nakledilebilir metastaz modellerinin, kendiliğinden, genetik olarak yönlendirilen kanser modellerine kıyasla insan metastazını daha iyi temsil ettiği ve böylece klinik çevrilebilirliği iyileştirdiği bilinmektedir². Ayrıca, bu protokol, canlı hayvanlarda primer meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının büyümesini ve ilerlemesini gerçek zamanlı olarak incelemek için biyolüminesans görüntülemeyi kullanır, böylece metastatik yayılımın daha geleneksel histolojiye dayalı değerlendirmelerine göre verimliliği artırır. Bu protokol aynı zamanda primer tümörün cerrahi olarak çıkarılmasından sonra spontan metastazın değerlendirilmesini de içerir, bu hem klinik olarak önemlidir hem de araştırmacıların minimal rezidüel hastalığın metastatik süreç üzerindeki etkisini incelemesine olanak tanır. Son olarak, immünokompetan farelerin kullanımı, insan biyolojisinde olduğu gibi, metastatik süreci şekillendirmek için sağlam bir bağışıklık sistemine izin verme avantajı sağlar^10,11.

Protokol

Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri ve protokolleri, Virginia Commonwealth Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Enjeksiyon için hücrelerin hazırlanması

1. Lusiferaz ile dönüştürülmüş EO771 hücrelerini¹³ sıvı nitrojen deposundan çözün ve 1 x 10⁶ hücreyi tam hücre kültürü ortamında 10 cm'lik bir doku kültürü kabında (RPMI1640 +% 10 FBS +% 1 penisilin / streptomisin +% 1 amfoterisin B) çözün.
2. 37 ° C ve% 5 CO_2'de % 80 -% 90 birleşene kadar, gerektiğinde her 2-3 günde bir orta değişikliklerle inkübe edin.
3. Hücreleri hasat etmek için hücre kültürü ortamını aspire edin ve 1x PBS ile yıkayın. Hücreler ayrılana kadar 37 ° C'de yaklaşık 2-3 dakika boyunca 2 mL% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisi ile inkübe edin ve ardından reaksiyonu söndürmek için 8 mL tam ortam ile yıkayın.
   NOT: Tripsine uzun süre hücre maruz kalması, hücre yüzey proteinlerinin zardan sıyrılmasına ve sonuçta hücre ölümüne neden olacaktır.
4. İçeriği 10 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 350 x g'da döndürerek pellet yapın. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 10 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
5. Sayım için 50 μL'lik bir numune toplayın ve ardından 5 dakika boyunca 350 x g'da döndürerek hücreleri yeniden peletleyin.
   1. Hücreler santrifüjlenirken, 50 μL'lik numuneye 50 μL tripan mavisi ekleyin ve bir hemasitometre kullanarak canlı hücrelerin sayısını sayın. Sağlam hücre zarlarına sahip canlı hücreler, tripan mavisi eklendikten sonra boyayı dışlayacak ve berrak kalacaktır, ölmekte olan/ölü hücreler ise boyanın sitoplazmaya girmesine ve maviye dönmesine izin verecektir.
   2. Aşağıdaki formülü kullanarak hücreleri 6 x 10⁶ canlı hücre/mL'de (canlı hücre konsantrasyonu [canlı hücreler/mL]) yeniden süspanse etmek için gereken hacmi belirleyin:
      16 karelik 4 setteki ortalama canlı hücre sayısı × seyreltme faktörü × 1 x 10⁴ hücre / mL
6. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 6 x 10⁶ hücre / mL'ye seyreltmek için gerekli hesaplanan hacimde steril 1x PBS'de hücreleri yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve enjeksiyona hazır olana kadar buz üzerinde tutun.

2. Meme yağ yastığı enjeksiyonları

NOT: Mevcut protokol herhangi bir fare suşu ile kullanılabilir, ancak bağışıklık mikroortamına olan ilgimiz göz önüne alındığında, C57BL6 fareleri kullanıyoruz. 6-8 haftalık dişi, bakire fareler tipik olarak meme kanseri çalışmaları için kullanılır, çünkü parite tümör oluşumu süreçlerini geliştirir.

1. Büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisini buz üzerinde çözün ve enjeksiyona hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
2. Fareleri% 4 -% 5 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasında uyuşturun. Ayak parmağını kıstırma refleksinin eksikliğini değerlendirerek yeterli bir anestezi düzlemini onaylayın ve işlem sırasında bakım için gazı %2 izoflurana düşürün.
   DİKKAT: İzofluran, gözler ve cilt için tahriş edici ve merkezi sinir sistemi için toksik olduğu bilinen kokusuz bir solunan anesteziktir. Havalandırmanın yeterli olduğu bir ortamda kullanılmalıdır. İzoflurana uzun süreli veya kronik maruz kalmanın sağlık üzerinde olumsuz etkileri olabilir. Uygun şekilde kalibre edilmiş, gaz atma sistemlerinden yararlanan ve veteriner personeli tarafından sık sık bakımı yapılan veteriner anestezi ekipmanları kullanılmalıdır.
3. Elektrikli kesme makineleri kullanarak farenin karnındaki kılları tıraş edin ve ardından %2'lik bir bakım izofluran oranı kullanarak bir anestezi makinesine bağlı bir burun konisine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Kornea yaralanmasını önlemek için hayvanın her gözüne oftalmik merhem sürün.
4. Alternatif olarak% 70 etanol ve povidon-iyot çözeltisi kullanarak karın bölgesini dairesel hareketlerle üç kez cerrahi olarak fırçalayın. Ayak parmağı sıkıştırma refleksi eksikliğini değerlendirerek yeterli bir anestezi düzlemini onaylayın.
5. Makas kullanarak, karın derisinden 4. meme dokusu seviyesinde küçük bir orta hat kesisi (genellikle ~ 1 cm) yapın, altta yatan peritonu açığa çıkarın ancak nüfuz etmeyin.
   NOT: Meme bezinde tümör hücresi implantasyonu için deri altı enjeksiyon veya intraduktal aşılama gibi diğer prosedürler kullanılabilir. Biraz invaziv olsa da, bu cerrahi prosedürün öğrenilmesi ve ustalaşması kolaydır ve yağ yastığını görselleştirmek, meme bezinin dışına çok az enjeksiyon riski ile doğruluğu önemli ölçüde artırır, bu da tümörün daha sonra etkili bir şekilde çıkarılması için kritik öneme sahiptir.
6. Forseps kullanarak cildi peritondan uzak tutun. Cildi peritondan ayırmak için steril tuzlu suya batırılmış pamuklu çubuklar kullanın ve sağ meme yağ pedini ortaya çıkarmak için yanal olarak hareket edin. Sol meme yağ pedini ortaya çıkarmak için sol tarafta tekrarlayın.
7. EO771 hücre süspansiyonunu manuel bir pipet kullanarak yeniden süspanse edin ve 100 μL'yi yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Eşit hacimde bazal membran matris çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın, kabarcık oluşturmamaya dikkat edin ve buz üzerinde tutun. Son hücre süspansiyonu şimdi 50 μL'de 150.000 hücre içerecektir.
8. 28G 0.5 mL U-100 insülin şırıngasına 100 μL hücre süspansiyonu çekin ve buz üzerinde tutun.
9. Forseps kullanarak cildi kaldırın ve sağ meme yağ pedini nazikçe tutun ve açığa çıkarın. Meme yağ yastığına 50 μL hücre süspansiyonu enjekte edin ve matrisin katılaşmaya başlamasına izin vermek ve hücre süspansiyonunun enjeksiyon bölgesinden geri akma şansını azaltmak için şırıngayı meme yağ pedinden çıkarmadan önce 3-5 saniye bekleyin. Enjeksiyonun sonunda küçük bir kabarcık oluşacaktır.
10. Cildi forsepsten serbest bırakın ve meme yağ yastığının doğal olarak normal konumuna dönmesine izin verin. İşlemi sol meme yağ pedi ile tekrarlayın ve hücre süspansiyonunu içeren şırıngayı enjeksiyonlar arasında tekrar buzun üzerine yerleştirin.
11. Cilt kesisini kapatın, cilt zımbalarını uygulayın. Kesinin uzunluğu, gerekli cilt zımbalarının sayısını belirleyecektir ve çoğu prosedür, kesi başına bir ila iki zımba gerektirir. Zımbalar arasında en az 0.5 cm mesafe olduğundan emin olun.
12. Cerrahi kapatmanın ardından, fareyi temiz bir kurtarma kafesine aktarın. Hayvan hakları kendisi ve normal davranışına devam edene kadar gerektiği gibi izleyin. 3 gün boyunca her 24 saatte bir ağrı kontrolü için deri altına 40 μL meloksikam (2 mg / mL) uygulayın. Alternatif olarak, prosedür sırasında buprenorfin gibi bir opioidin yavaş salınan bir formülasyon dozu uygulanabilir ve bu doz 72 saat sürecektir.
13. Ameliyattan sonraki ilk 5 gün boyunca hayvanları günlük olarak izleyin, hayvanların kilosunu ve bakımsız kürk, kambur sırt ve kırmızımsı kahverengi burun veya oküler akıntı gibi herhangi bir sıkıntı belirtisini değerlendirin.
14. Hayvanları cerrahi alan eritem veya nekroz gibi yara enfeksiyonu belirtileri ve insizyon bölgesinin korunması açısından kontrol edin ve kuruma özel IACUC yönergelerinde açıklandığı gibi, başlangıçtaki vücut ağırlığının %>20'sini kaybeden veya ciddi sıkıntı kriterlerini karşılayan hayvanları insancıl bir şekilde kurban edin.

3. Tümör rezeksiyonları

1. Primer tümör uzunluğu (L) ve genişliği (W) ölçümlerini alarak ortotopik meme tümörü lezyonunun büyümesini haftada 3 kez izlemek için kaliperler kullanın. Formülü kullanarak tümör hacmini hesaplayın:
   πLW²/6
   1. Enjekte edilen spesifik hücre hattına bağlı olarak tümör rezeksiyonunu ampirik olarak belirleyin. Yeniden büyüme şansını azaltmak için tümörleri her zaman mümkün olan en küçük boyutta çıkarın. Bu protokolde tarif edilen EO771 hücreleri için, tümörler^{hacim olarak} 150 mm3'e ulaştığında tümör rezeksiyonu yapın.
      NOT: Tek tek hücre hatları için en uygun rezeksiyon zamanının belirlenmesi gerekir, ancak 150 mm³ iyi bir başlangıç noktasıdır, çünkü prosedür, kullanıcı deneyimli olduktan sonra tüm tümörü verimli bir şekilde eksize edebilir.
2. Fareleri% 4 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasında uyuşturun. Ağrı kontrolü için deri altına 40 μL meloksikam (2 mg / mL) uygulayın ve ardından fareyi% 2'lik bir idame izofluran oranı kullanarak bir anestezi makinesine bağlı bir burun konisine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Kornea yaralanmasını önlemek için hayvanın her gözüne oftalmik merhem sürün.
   NOT: Analjezik 3 gün boyunca her 24 saatte bir uygulanmalıdır. Alternatif olarak, prosedür sırasında buprenorfin gibi bir opioidin yavaş salınan bir formülasyon dozu uygulanabilir ve bu doz 72 saat sürecektir.
3. Gerekirse önceki cerrahi zımbaları çıkarın ve alternatif %70 etanol ve povidon-iyot çözeltisi turları kullanarak karın bölgesini dairesel hareketlerle üç kez cerrahi olarak ovalayın. Ayak parmağı sıkıştırma refleksi eksikliğini değerlendirerek yeterli bir anestezi düzlemini onaylayın. Makas kullanarak, karın derisinden 4. meme dokusu seviyesinde küçük bir orta hat kesisi (genellikle ~ 1 cm) yapın, altta yatan peritonu açığa çıkarın ancak nüfuz etmeyin.
4. Ortotopik tümörü peritondan ve üstteki deriden ayırmak için künt diseksiyon kullanın. Tümöre proksimal ve distal olarak yerleştirilmiş normal meme dokusunu makas kullanarak keserek ortotopik tümörü çıkarın ve tümör dokusunu bir biyolojik tehlike torbasına atın. Kontralateral tümör ile tekrarlayın. Kanama meydana gelirse, damar sistemini hızlı bir şekilde koterize edin.
   NOT: Ortotopik tümörler peritona sızmışsa, iyi sınırlandırılmamış veya künt diseksiyon ile peritondan kolayca ayrılabilen bir tümör tarafından kanıtlanmışsa, tümörün çıkarılması tamamlanmayacağından hayvanlar kurban edilmelidir ve yeniden büyüyerek arka plan biyolüminesans sinyalinin ve morbiditenin karışmasına yol açacaktır.
5. Cerrahi bölgeyi kapatmak için bir ila üç zımba kullanın ve tümör rezeksiyonu prosedürünü takiben hayvanın iyileşmesini iyileştirmek için fareyi altında sıcak bir ısıtma yastığı bulunan temiz bir kurtarma kafesine aktarın. Hayvan hakları kendisi ve normal davranışına devam edene kadar gerektiği gibi izleyin.
   1. İşlem sırasında bir miktar kan kaybeden hayvanlar için, cerrahi alanın kapatılmasını takiben intraperitoneal olarak uygulanan 300 μL'lik steril% 0.9 normal salin enjeksiyonu uygulayın.
   2. Gerekirse, tümör rezeksiyonunun eksiksizliğini ve başlangıç minimal rezidüel hastalığını değerlendirmek için adım 4'te açıklandığı gibi biyolüminesans sinyali için hayvanları bu noktada görüntüleyin. Rezeksiyon eksikse ve primer tümör bölgesinde kalan biyolüminesans sinyali varsa, kalan tümör hücrelerinin büyümesi arka plan biyolüminesans sinyalinin karışmasına neden olabileceğinden, hayvanı insanca kurban edin.
6. Ameliyattan sonraki ilk 5 gün boyunca hayvanları günlük olarak izleyin, hayvanların ağırlığını ve bakımsız kürk, kambur sırt ve kırmızımsı kahverengi burun veya oküler akıntı gibi herhangi bir sıkıntı belirtisini değerlendirin.
7. Hayvanları cerrahi alan eritem veya nekroz gibi yara enfeksiyonu belirtileri ve insizyon bölgesinin korunması açısından kontrol edin. Başlangıçtaki vücut ağırlığının %>20'sini kaybeden veya kuruma özel IACUC yönergelerinde açıklandığı gibi ciddi sıkıntı kriterlerini karşılayan hayvanları insancıl bir şekilde kurban edin.

4. Spontan akciğer metastazının in vivo miktar tayini

1. Bir başlangıç sinyali oluşturmak için tümör rezeksiyonu gününde hayvanların in vivo görüntülemesini gerçekleştirin ve daha sonra spontan metastatik akciğer tümörü lezyonlarının büyümesini değerlendirmek için haftada 2-3 kez gerçekleştirin.
2. Hayvanlar prosedür için hazırlanırken görüntüleme cihazını ısınma için başlatmak için Başlat'a tıklayın.
3. Fareleri% 4 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasında uyuşturun ve ayak parmağı sıkıştırma refleksi eksikliğini değerlendirerek yeterli bir anestezi düzlemini onaylayın. Oksijen ve izofluran anestezisinin görüntüleme cihazına aktığını onaylayın.
4. Hayvanlara 100 μL D-lusiferin çözeltisi (steril PBS'de 15 mg / mL) retro-orbital enjeksiyon kullanarak, iğneyi burundan 45 ° 'lik bir açıyla gözün medial kantusuna sokarak enjekte edin. İğneyi kemik direnci hissedilene kadar sokun, bu noktada iğnenin retroorbital venöz sinüs içine yerleştirildiğinden emin olmak için D-lusiferin solüsyonunu enjekte etmeden önce iğneyi ~ 1 mm geri çekin.
   NOT: D-lusiferin çözeltisi, intraperitoneal veya subkutan enjeksiyon gibi diğer yollarla verilebilir, ancak substrat metabolizasyonunun kinetiği daha uzun olacak ve farklı organlara dağılım heterojen olacaktır.
5. Teslimat sırasında herhangi bir sıvının geri akmamasıyla enjeksiyonun başarılı olduğunu onaylayın ve görüntülemeden önce 2 dakika bekleyin. Beklerken, hayvanları sırtüstü pozisyonda biyolüminesans görüntüleyicinin içinde bulunan burun konilerine aktarın ve izofluranı %2'lik bir bakım oranına düşürün.
6. Hayvanın bir biyolüminesans görüntüsünü almadan önce, orta gruplama ve f/stop 8 kullanarak hayvanın bir fotoğrafını aynı anda elde etmek için Fotoğraf'ın yanındaki onay kutusunun işaretli olduğundan emin olun. Fotoğrafı biyolüminesans görüntüsüyle kaplamak için Yer Paylaşımı'nın yanındaki onay kutusunun işaretli olduğundan emin olun. Pozlama süresini orta gruplama ile 1 dakikaya ayarlayın, f/stop = 1 ve Al'a tıklayarak bir görüntü yakalayın.
7. Foton akısını aşağıdaki gibi ölçün. Kare Yatırım Getirisi düğmesini tıklayarak resimde gösterilen her hayvan için ROI araçları açılır menüsünü kullanarak bir kare ROI oluşturun. Fare ile tıklayıp sürükleyerek otomatik olarak oluşturulan ROI'yi her hayvanın göğüs kafesi üzerinde yeniden konumlandırın.
8. ROI'leri Ölç düğmesini tıklayın ve farklı pozlama süreleriyle elde edilen görüntülerin karşılaştırılabilmesi için verilerin sayım olarak değil, parlaklık (fotonlar/sn) olarak görüntülendiğinden emin olun.

5. Histolojik analiz için akciğer dokularının toplanması

NOT: Hayvanlar, herhangi bir deneysel zaman noktasında veya hayvanlar insancıl kurban kriterlerini karşıladığında, kuruma özel IACUC yönergelerine göre aşağıda açıklandığı gibi kurban edilebilir. Deneyimlerimize göre, fareler primer tümörlerin rezeksiyonundan yaklaşık 21-28 gün sonra insancıl son noktaya ulaşır.

1. Fareleri% 4 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasında uyuşturun ve ayak parmağı sıkıştırma refleksi eksikliğini değerlendirerek yeterli bir anestezi düzlemini onaylayın. Ardından, fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın.
2. Diyafram görünene kadar göğüs boşluğunun alt kısmını ortaya çıkarmak için cildi, kas sistemini ve peritonu keserek ksifoid işleminin altında orta hat kesisi yapmak için makas kullanın. Akciğerleri çökertmek için diyaframı delin ve ardından diyaframı kesin.
3. Sağ ve sol taraftaki göğüs kafesini kesin ve ardından ksifoid sürecini yakalamak için bir kanama durdurucu kullanın ve göğüs kafesini yoldan çekerek kalbi ve akciğerleri açığa çıkarın. Makas kullanarak sağ atriyumu kesin.
4. Hayvanı sol ventrikülden 10 mL buz gibi PBS ile perfüze edin ve sağ atriyumdan akan sıvının berraklaştığını ve karaciğerin soluk sarı bir renge döndüğünü doğrulayarak perfüzyonun eksiksizliğini değerlendirin.
5. Trakeayı tanımlayın ve trakeaya paralel tutarak 3 mL% 4 paraformaldehit içeren 22 G'lik bir iğneli şırınga yerleştirin. Akciğerler tamamen şişene kadar çözeltiyi yavaş bir hızda verin. Trakeayı forseps ile iğnenin üzerinde tutun ve geri akışı önlemek için iğneyi yavaşça çıkarın.
   NOT: Fiksatif enjeksiyonundan önce trakeanın altına bir dikiş atılması ve ardından enjeksiyondan sonra sütürün trakea etrafına bağlanması, fiksatifin geri akışını önlemek için başka bir seçenek olabilir.
6. Trakeayı nazikçe tutmaya devam edin, forsepslerin üzerinde makasla kesin ve tüm bağ dokusunu çıkarırken dokuyu dikkatlice kaldırmaya başlayın. Kalbi akciğerlerden uzaklaştırın.
7. Akciğer dokusunu gece boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit içine yerleştirin ve fiksasyon için 4 ° C'de saklayın. Dokuyu uzun süreli depolama için% 0.05 sodyum azid içeren PBS'ye aktarın veya gerektiğinde histolojik analiz için daha fazla işlem yapın.

Sonuçlar

Fare kanseri hücre hatlarının farelerin 4. meme yağ yastığına ortotopik enjeksiyonu, fare primer tümörlerini indüklemek için tekrarlanabilir ve güvenilir bir prosedürdür. Bu protokolde tarif edilen koşullarda lusiferaz ile transdüksiyona tabi tutulan EO771 hücre hattı kullanılarak, primer tümörler palpe edilebilir hale gelir ve enjeksiyondan yaklaşık 7 gün sonra kaliperler kullanılarak ölçülebilir ve ilk enjeksiyondan yaklaşık 14 gün sonra hacim olarak yakl...

Tartışmalar

Metastatik yayılımın erken doğası ve kanserin sistemik etkileri daha yaygın olarak kabul edildikçe, bu kritik faktörlerin her ikisinin de dikkate alındığı modellere duyulan ihtiyaç bir zorunluluk haline gelmektedir. Bu protokol, araştırmacıların, metastatik süreci etkileyen kanserin sistemik etkilerini hesaba katarak, primer meme tümörlerinden kendiliğinden meydana gelen minimal rezidüel hastalığı ve akciğer metastazı büyümesini izlemelerine olanak tanır. Pr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Hyclone	SH30042.01
1.5ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
10% povidone-iodine solution	Medline	MDS093906
15ml centrifuge tubes	VWR	89039-666
1X PBS	Hyclone	SH30256.01
28G 0.5ml U-100 Insulin Syringe	BD Biosciences	329461
Amphotericin B	Gemini Bio-products	400-104
Cautery Kit	Braintree Scientific	DEL2
D-Luciferin Potassium	SydLabs	MB102
Ethanol	Koptec	V1001
Fetal Bovine Serum	R&D Systems	S11150H
Forceps	Fisherbrand	16-100-110
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	354230
Isoflurane	Covetus	29405
IVIS Spectrum 200	Perkin Elmer	124262
Meloxicam (2mg/ml)	Zoopharm LLC	N/A	By veterinary prescription
Penicillin/Streptomycin	Gemini Bio-products	400-109
RPMI1640	Hyclone	SH30027.01
Scissors	Miltex	5-300
Silk sutures	Braintree Scientific	SUT-S 103
Surgical staples	Reflex7	203-1000
Trypan Blue	Gibco	15250-061