Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Özet

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Özet

Görsel biyokimya, toplu faz çalışmalarında gerçekleşen ortalamada gizlenen tek enzimlerin veya enzim komplekslerinin stokastik özelliklerini gözlemlemek için güçlü bir tekniktir. Görselleştirmeyi başarmak için, bir tuzağın sabit, diğerinin hareketli olduğu çift optik cımbız, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu sahnesine yerleştirilmiş çok akışlı bir mikroakışkan odanın bir kanalına odaklanır. Optik cımbızlar, floresan olarak etiketlenmiş DNA'nın tek moleküllerini yakalar ve odadan ve sıkışmış boncuklardan geçen sıvı akışı, DNA'yı B formuna (minimum kuvvet altında, yani 0 pN) uzatır ve nükleik asit siyah bir arka plana karşı beyaz bir ip olarak gözlenir. DNA molekülleri, reaksiyonların kontrollü bir şekilde başlatılmasını sağlamak için aşamayı akışa dik olarak çevirerek bir akıştan diğerine taşınır. Başarıya ulaşmak için, optik olarak berrak kanallara sahip mikroakışkan cihazlar, bir şırınga pompasında yerinde tutulan cam şırıngalarla eşleştirilir. Optimum sonuçlar, akış hücresine kalıcı olarak bağlanmış konektörler, mekanik olarak sert ve kimyasal olarak dayanıklı olan ve laminer akışı yasaklayan kabarcıkları ortadan kaldıran anahtarlama valflerine bağlı borular kullanır.

Giriş

Protein-DNA etkileşimlerini tek molekül düzeyinde ve gerçek zamanlı olarak görselleştirme yeteneği, genom stabilitesi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır ^1,2. DNA'nın tek molekülleriyle birer birer çalışmaya ek olarak, yakındaki tek tek moleküller arasındaki işlemleri görüntüleme yeteneği ek içgörü sağlar ^3,4,5. Ek DNA moleküllerinin manipülasyonu hem ek optik tuzaklar hem de yüksek kaliteli, çok kanallı, mikroakışkan akış hücreleri gerektirir⁶.

Birden fazla optik t....

Protokol

1. Lazer tuzak hizalama ve polistiren boncuklarla test

NOT: Kurulum için Şekil 1A,B'ye bakın.

DİKKAT: Deneyci, lazer ışını hizalaması sırasında uygun koruyucu gözlük veya lazer güvenlik gözlüğü takmalıdır. Burada açıklanan optik cımbız sistemi hem HeNe hem de IR ışınlarını kullandığından, iki ayrı lazer güvenlik cam eşyası seti gereklidir.

1. HeNe Kiriş hizalaması
   1. Tüm optik bileşenleri breadboard üzerine yerleştirin. Breadboard'u, mikroskopa göre mümkün olduğunca 90° açıya yakın olacak şekilde hizalayın.
   2. Objektif ve telan len....

Sonuçlar

Tuzak hizalamasının ve mukavemetinin ilk testi 1 μm, floresan olmayan polistiren boncuklarla yapılır. Laboratuvarda yapılan araştırmaların çoğu floresan kullandığından, 1 μm, Dragon yeşil polistiren boncuklar kullanarak tuzak mukavemetini daha da test ediyoruz (Şekil 1D, E). Bundan sonra çalışma, DNA'nın bis-intercalating boya YOYO-1^14,29 ile boyandığı DNA-boncuk komplekslerinin optik yakalama.......

Tartışmalar

Akış sisteminin dikkatli bir şekilde monte edilmesi, deneylerin başarılı bir şekilde sonuçlanması için kritik öneme sahiptir ^4,6. Protokolün en zorlu yönlerinden biri, konektörlerin cam yüzeye tutturulmasıdır. Bunun için aşağıdaki iki yaklaşımı kullanıyoruz: prese uygun boru konektörleri ve nanoport montajları. Prese takılan konektörler cama kolayca yapışır ve ardından PTFE borularının forseps kullanılarak önceden oluşturulmu.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x objective	Leica	506318 or 506038	Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective	Leica	506263	Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads	Bangs Labs	FSDG004	Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads	Bangs Labs	CPO1004	Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective	Leica	506081	Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser	Lumentum	1100 series	10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera	Amscope	MU303	A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software	Hamamatsu	HCImage	Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera	Spot imaging solutions	DE50CMT	Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera			Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing	Grace Bio	46004	PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells	Translume	Custom	Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue	Loctite	233841	Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells	CIDRA Precision services	Custom design	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution	Hamilton	18311	Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software	Media cybernetics	Image Pro Premiere	Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analysis of images and single molecule tracking
Image display card	Melles Griot	06 DLA 001	Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil	Zeiss	444960	Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer	Canadian Photonics labs	IR 3150	Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter	Thor labs		Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe)	Thor labs	LG7 or 8	Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR)	Thor labs	LG11	Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope	Leica	DMIRE2	DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software	UCSF/shareware	uManager	Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly	IDEX	N333	Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support	Thor Labs	PA52502	Active isolation table support
Optics and lenses	Solar TII	Various	Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells	ufluidix	Custom	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing	IDEX	1532	Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors	GraceBio	46003	Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors	GSI Lumonics	VM500	Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves	IDEX	V-101T	Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold	Machine shop	None	Custom built
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes	Hamilton	81320	Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top	Thor Labs	T36H	Optical table top or breadboard
Trapping laser	Newport/Spectra Physics	J-series; BL106C	Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser