JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Monomerik alfa-sinükleinin yapısal topluluğu fizyolojik fonksiyonunu ve fizikokimyasal özelliklerini etkiler. Mevcut protokol, fizyolojik koşullar altında bu içsel olarak düzensiz proteinin monomeri hakkında konformasyonel bilgileri belirlemek için milisaniye hidrojen / döteryum değişim kütle spektrometrisinin ve müteakip veri analizlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Özet

Alfa-sinüklein (aSyn), Parkinson hastalığının ayırt edici özellikleri olan Lewy cisimlerinde ve nöritlerinde fibriller agregaları bol miktarda bulunan, özünde düzensiz bir proteindir. Bununla birlikte, biyolojik aktivitesinin çoğu ve toplanması, proteinin çözünür monomer formunu merkezi olarak içerir. aSyn biyolojisinin ve patofizyolojisinin moleküler mekanizmalarının aydınlatılması, yapısal olarak yüksek oranda çözümlenmiş yöntemler gerektirir ve biyolojik koşullara duyarlıdır. Doğal olarak açılmış, meta-kararlı yapıları, monomerik aSyn'i birçok yapısal biyoloji tekniğine karşı dayanıklı hale getirir. Burada, böyle bir yaklaşımın uygulanması açıklanmaktadır: düşük termodinamik stabiliteye ve aSyn gibi zayıf koruma faktörlerine sahip proteinlerin incelenmesi için milisaniyelik zaman ölçeğinde hidrojen / döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS). Milisaniyelik zaman ölçeğinde, HDX-MS verileri, daha uzun etiketleme sürelerinde kaybolan ve sonuçta amino asit seviyesine kadar yapısal çözünürlük sağlayan aSyn'in çözücü erişilebilirliği ve hidrojene bağlı yapısı hakkında bilgi içerir. Bu nedenle, HDX-MS, konformasyonel dinamikler ve termodinamik, moleküller arası ve moleküller arası etkileşimler ve mutasyonların veya değişikliklerin çevresel koşullara yapısal etkisi hakkında yüksek yapısal ve zamansal çözünürlüklerde bilgi sağlayabilir. Geniş çapta uygulanabilir olsa da, monomerik aSyn'de milisaniye HDX-MS ölçümlerinin nasıl elde edileceği, analiz edileceği ve yorumlanacağı gösterilmiştir.

Giriş

Parkinson hastalığı (PH), dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır1. Beynin substantia nigra pars compacta bölgesinde Lewy cisimleri ve Lewy nöritleri olarak bilinen sitoplazmik inklüzyonların oluşumu ile karakterizedir. Bu sitoplazmik inklüzyonların özünde düzensiz protein aSyn2'nin agregalarını içerdiği bulunmuştur. PD ve diğer sinükleinopatilerde, aSyn çözünür düzensiz bir durumdan çözünmez, yüksek oranda yapılandırılmış hastalıklı bir duruma dönüşür. Doğal formunda, monomerik aSyn, N- ve C-termini arasındaki uzun menzilli elektrostatik etkileşimler ve C-terminus ile amiloid olmayan beta bileşeni (NAC) bölgesi 3,4,5,6 arasındaki hidrofobik etkileşimler ile stabilize edilen çok çeşitli konformasyonları benimser. Mutasyonlar, çeviri sonrası modifikasyonlar ve yerel ortamdaki değişiklikler gibi bu stabilize edici etkileşimlerdeki herhangi bir bozulma, monomerin yanlış katlanmasına yol açabilir ve böylece toplama sürecini tetikleyebilir7.

aSyn 8,9,10,11'in oligomerik ve fibriller formları üzerinde çok sayıda araştırma mevcut olsa da, proteinin monomerik formunu incelemek ve hangi konformatörlerin işlevsel (ve nasıl) olduğunu ve hangilerininagregaya eğilimli olduğunu daha iyi anlamak için çok önemli bir ihtiyaç vardır. . İçsel olarak düzensiz, sadece 14 kDa büyüklüğünde ve kristalleşmesi zor olan aSyn monomeri, çoğu yapısal biyolojik tekniğe uygun değildir. Bununla birlikte, monomerik aSyn'in konformasyonel dinamiklerini ölçebilen bir teknik, son zamanlarda aksi takdirde elde edilmesi zor veya imkansız olacak önemli yapısal gözlemler üreten milisaniye HDX-MS'dir12,13,14. Milisaniye HDX-MS, amid hidrojenlerindeki izotopik değişimi izleyerek, milisaniye zaman ölçeğinde belirli bir protein bölgesinin çözücü erişilebilirliğini ve hidrojen bağlama ağı katılımını göstererek, protein konformasyonel topluluğunun ortalamasını hassas bir şekilde ölçer. HDX-MS'in milisaniyelik yönünü vurgulamak gerekir, çünkü doğal olarak açılmış, meta-kararlı doğası nedeniyle, aSyn, geleneksel HDX-MS sistemlerinin alt sınırının çok altında tezahür eden çok hızlı hidrojen değişim kinetiği sergiler. Örneğin, aSyn molekülünün çoğu, hücre içi koşullar altında 1 saniyeden daha az bir sürede döteryum için hidrojeni tamamen değiştirmiştir. Birkaç laboratuvar şimdi hızlı karıştırma enstrümantasyonu inşa etti; Bu durumda, 50 ms'lik bir ölü zaman ve 1 ms'lik bir zamansal çözünürlük ile HDX-MS'yi gerçekleştirebilen prototip bir hızlı karıştırma söndürme-akışcihazı kullanılır. Milisaniye HDX-MS son zamanlarda aSyn çalışmasında akut olarak önemli olsa da, özünde düzensiz proteinlerin / bölgelerin daha yaygın olarak ve sadece zayıf derecede kararlı olan döngüleri / bölgeleri olan çok sayıda proteinin incelenmesinde değerli olduğu görülmektedir. Örneğin, peptit ilaçları (örneğin, insülin; GLP-1/glukagon ; tirzepatid) ve peptid-füzyon proteinleri (örneğin, HIV inhibitörü FN3-L35-T1144), çözelti fazı yapısal ve stabilite bilgisinin ilaç geliştirme kararları için kritik bir girdi olabileceği başlıca ilaç formatlarıdır ve yine de, peptid moiety genellikle HDX-MS tarafından saniyeler zaman ölçeğinde zayıf bir şekilde stabil ve inatçıdır16,17,18,19,20 saniye zaman çizelgesinde HDX-MS tarafından inatçıdır. . Saniye/dakika alanlarında etiketleme ile ortaya çıkan HDX-MS yöntemlerinin DNA G-dörtlüleri için yapısal bilgi elde ettiği gösterilmiştir, ancak milisaniye HDX-MS21 uygulaması ile bunu daha çeşitli oligonükleotid yapılarına genişletmek mümkün olmalıdır.

HDX-MS deneyleri üç farklı seviyede gerçekleştirilebilir: (1) aşağıdan yukarıya (etiketli proteinin proteolitik olarak sindirildiği), (2) orta-aşağı (etiketli proteinin proteolitik olarak sindirildiği ve elde edilen peptitlerin yumuşak parçalanma teknikleriyle daha da parçalandığı) ve (3) yukarıdan aşağıya (yumuşak parçalanma tekniklerinin etiketli proteini doğrudan parçaladığı)22 . Bu nedenle, alt moleküler HDX-MS verileri, değişim davranışını bir proteinin belirli bölgelerine lokalize etmemize izin verir ve bu tür deneyler için yeterli dizi kapsamına sahip olmayı kritik hale getirir. Herhangi bir HDX-MS deneyinin yapısal çözünürlüğü, sırasıyla sindirim veya yumuşak parçalanma üzerine proteinden türetilen proteolitik peptitlerin veya fragmanların sayısına dayanır. Yukarıda özetlenen üç deney tipinin her birinde, her bir peptit / fragmandaki amid değişimindeki değişim, proteinin lokalize bölgelerinin davranışını belirtmek için proteinin birincil yapısına geri eşlenir. En yüksek yapısal çözünürlük yumuşak parçalanma yoluyla elde edilirken, bu deneylerin tanımı, aSyn monomer konformasyonlarının ölçümüne odaklanan mevcut çalışmanın kapsamı dışındadır. Burada açıklanan yaygın olarak uygulanan "aşağıdan yukarıya" iş akışı ile mükemmel sonuçlar elde edilebilir.

Burada, (1) aSyn örneklerinin ve HDX-MS tamponlarının nasıl hazırlanacağı ve işleneceği, (2) aşağıdan yukarıya HDX-MS deneyi için peptid haritalamanın nasıl gerçekleştirileceği, (3) monomerik aSyn üzerinde HDX-MS verilerinin fizyolojik koşullar altında, özellikle milisaniye zaman alanında nasıl elde edileceği (özel yapım bir cihaz kullanılarak; milisaniye etiketleme için alternatif araçlar da tanımlanmıştır), ve (4) HDX-MS verilerinin nasıl işleneceği ve analiz edileceği. Monomerik aSyn'in fizyolojik pH'ta (7.40) iki çözelti koşulunda kullanıldığı yöntemler burada örneklendirilmiştir. ASIN çalışmasında kritik derecede yararlı olsa da, bu prosedürler herhangi bir proteine uygulanabilir ve özünde düzensiz proteinlerle sınırlı değildir.

Protokol

1. Protein ekspresyonu ve aSyn'in saflaştırılması

  1. Daha önce yayınlanmış bir rapor9'u takiben aSyn'i hazırlayın.
  2. Güvenli bir depolama tamponuna diyaliz yapın (örneğin, Tris, pH 7.2).
  3. Gerekirse, numuneyi konsantre edin (örneğin, yaklaşık 10-30 dakika boyunca 3 kDa MWCO, 14.000 x g kullanarak spin filtre mikrosantrifüj tüpleri, bkz.
    NOT: Aşırı konsantre olunmaması tavsiye edilir. Monomer topluluğunun bütünlüğü 25 μM'nin ötesinde doğrulanmamıştır.
  4. Aliquot ve −80 °C'de saklayın
    NOT: aSyn monomer proteini bu saklama koşullarında 1 yıla kadar stabildir.

2. HDX tampon hazırlama

NOT: Tris yüksek bir sıcaklık katsayısına sahip olduğundan, pH ölçümünün HDX reaksiyonunun yapılacağı sıcaklığa göre ayarlanması gerekir, bu protokolde 20 ° C'dir.

  1. 100 mL LC-MS dereceli suya 0,002 mol Tris tartarak Durum A ve Durum B için denge tamponu hazırlayın. Durum B için, Tris tamponuna 29.8 mg KCl, 14.2 mg MgCl 2, 36.8 g CaCl2 ve 836 mg NaCl ekleyin. PH'ı 7,40 ± 0,05'e ayarlayın.
    NOT: Denge tamponu, aSyn'in çalışılacağı koşulları içermelidir. Bu durumda, pH 7.4 +/− tuzlarında 20 mM Tris'tir.
  2. 100 mL deuterated suya 0,002 mol Tris tartarak Durum A ve Durum B için etiketleme tamponu hazırlayın. Durum B için, Tris etiketleme tamponuna 29.8 mg KCl, 14.2 mg MgCl2, 36.8 g CaCl2 ve 836 mg NaCl ekleyin. Etiketleme tamponunun pD'si, denge tamponunun pH'ına karşılık gelir. pH = pD - 0,41 olduğundan, pH metre 6,99 ± 0,0523,24 okuyacak şekilde ayarlayın.
    NOT: Etiketleme tamponunun, deuterated su kullanılarak hazırlanması dışında, denge tamponu ile aynı bileşenlere sahip olması gerekir.
  3. 0,010 mol Tris ve 0,050 mol üre ağırlığında söndürme tamponu hazırlayın ve LC-MS sınıfı su ile 100 mL'ye kadar yapın. pH değerini 0,5 °C'de 2,50 ± 0,05 olarak ayarlayın.
    NOT: İlgili protein için en iyi söndürme tamponunu belirlemek için HDX deneylerinden önce bir söndürme tamponu ekranı yapılmalıdır. Denatürantların (örneğin, üre ve guanidinyum hidroklorür) ve indirgeyici ajanların (örneğin, tris (2-karboksiyetil) fosfin) farklı konsantrasyonları ve kombinasyonları, sönmüş proteini etkili bir şekilde açmak ve sindirmek için yakalama hacmi ve sıcaklığı gibi fiziksel parametrelerle birlikte taranır. pH 2.50'de 100 mM Tris ve 0.5 M üre içeren bir söndürme tamponu bu çalışma için en uygunudur.
  4. Sindirim kolonu yıkama tamponunu Duran cam şişesine 0,125 mol guanidinyum hidroklorür tartarak hazırlayın. 25 mL metanol ve 250 μL formik asit ekleyin. LC-MS sınıfı su ile 250 mL'ye kadar makyaj yapın.
    NOT: Enzymate BEH pepsin sütunu için ( bkz. Malzeme Tablosu), 0,5 M guanidinyum hidroklorür,% 10 (v / v) metanol ve% 0,1 (v / v) formik asit içeren bir kolon yıkama tamponu kullanın.
  5. Şırınganın zayıf yıkamasını, 0,5 μL formik asidi 249,5 mL LC-MS sınıfı suya pipetleyerek hazırlayın.
  6. Eşit miktarda LC-MS sınıfı su, metanol, asetonitril ve izopropanol karıştırarak şırıngayı güçlü bir şekilde yıkayın. Formik asidi son% 2 (v / v) konsantrasyonuna ekleyin.
    NOT: Çeşitli tamponlar ve protein arasındaki çapraz kontaminasyonu önlemek ve enjeksiyon portunun temizlenmesini sağlamak için, şırınga yıkama çözeltilerinin hazırlanması ve valfe giden akış yolunun (genellikle "yıkama astarı" olarak adlandırılır) tamamen sıvı ile astarlanması kritik öneme sahiptir. Formik asit, şırınganın zayıf yıkanması için isteğe bağlıdır.

3. Peptit haritalama prosedürü

  1. Aşağıdaki adımı izleyerek örneği hazırlayın.
    1. Çözülmüş aSyn protein stoğunu -80 °C dondurucudan 0,22 μm şırınga filtreli filtreleyin. Bira-Lambert yasası ile konsantrasyonu belirlemek için filtrelenmiş stok proteininin 280 nm'deki emiciliğini ölçün. Proteini denge tamponunda 5 μM'lik bir konsantrasyona kadar seyreltin (adım 2.1.).
      NOT: Bira-Lambert yasası: A = εcl, burada A absorbanstır, ε ölçülen dalga boyundaki (burada 280 nm) proteinin yok olma katsayısıdır ve M-1 cm−1 birimleri, c, M'deki protein konsantrasyonudur ve l, cm cinsinden yol uzunluğudur. Vahşi tip aSyn26 için, ε = 5960 M−1 cm−1.
  2. Sıvı kromatografisi yöntemini ayarlayın.
    1. 7000-9000 psi basınçta 3 dakikalık bir yükleme/yakalama süresine sahip bir giriş dosyası oluşturun, ardından 7 dakika içinde% 5 asetonitril'den% 40 asetonitrile bir gradyan, ardından 10 dakika boyunca% 5-95% asetonitril su tekrarlanan yıkama adımları izleyin.
    2. Kilit spreyinin (örneğin, lösin enkefalin, Malzeme Tablosuna bakınız) 2000 psi'de aktığından ve kütle spektrometresinin kaynak kilit sprey probuna bağlandığından emin olun.
  3. Kütle spektrometresi MSE yöntemlerini ayarlayın.
    NOT: MSE , öncü kütle yalıtımı olmayan, geniş bant veriden bağımsız bir toplama yöntemidir. Bu nedenle, seçilen m/z aralığındaki tüm iyonlar, çarpışma kaynaklı ayrışma (CID)27 kullanılarak daha da parçalanır.
    1. MS yöntem dosyasında, MSE Continuum'u seçin ve 2-10 dakika arasında bir edinme süresi, elektrosprey kaynağı ve pozitif çözünürlük modu ayarlayın. MS E'yi 50-2000Da'nın üzerinde edinin ve her 0,3 saniyede bir tarayın.
    2. Fonksiyon 1 (düşük enerji) için, tuzağı kurun ve çarpışma enerjilerini 4 V olarak aktarın. Fonksiyon 2 (yüksek enerji) için, rampa transfer çarpışma enerjisini 4V'ta sabit olacak şekilde ve tuzak çarpışma enerjisini her haritalama enerji seviyesi için Tablo 1'de belirtildiği gibi olacak şekilde ayarlayın.
      NOT: İyon hareketliliği MSE yöntemleri de kullanılabilir. Alternatif haritalama yöntemleri (örneğin, veriye bağımlı edinme veya DDA) kullanıcının takdirine bağlı olarak kullanılabilir.
  4. Otomatik örnekleme robotunu kurun (bkz.
    1. Toplam geri kazanım şişesine 5 μM proteinin 50 μL'sini ekleyin. Şişeyi HDX sağ haznesinde numune konumuna yerleştirin. Bu haznenin 0,5 °C'de olduğundan emin olun.
    2. HDX sol haznesindeki bir, iki ve üç reaktif pozisyonlarına bir denge tamponu şişesi ve iki reaktif şişe etiketleme tamponu ekleyin. Peltier sıcaklık kontrol cihazını ayarlayarak bu haznenin 20 °C'de olduğundan emin olun (bkz. HDX sağ haznesinde bir reaktif pozisyonuna bir reaktif şişesi söndürme tamponu ekleyin.
    3. HDX sol haznesinin reaksiyon pozisyonlarına sekiz toplam geri kazanım şişesi ve HDX sağ haznesinin reaksiyon pozisyonlarına sekiz maksimum geri kazanım şişesi ekleyin.
      NOT: Dağıtılan hacimlerin tam temizliğini ve maksimum tekrarlanabilirliğini sağlamak için, otomatik numune alma şırıngalarında bir şırınga yıkama ve asal yıkama yapılması önerilir. Örneğin, haritalama deneylerine başlamadan önce (1) zayıf yıkama, (2) güçlü yıkama, (3) zayıf yıkama dizisini uygulayın. Bu sekans kapsamlı bir şekilde tekrarlanabilir ve 20x'e kadar veya şırınga tamamen ıslanana kadar yapılması önerilir.
    4. Zamanlama yazılımında uygun LC ve MS yöntemleriyle bir örnek liste oluşturun ve zamanlamayı başlatın.
      NOT: Bu çalışmada çizelgeleme yazılımı olarak Chronos kullanılmaktadır (bkz.
  5. Eşleme verilerini işleyin.
    1. Uygun yazılımı kullanarak haritalama deney dosyalarından peptitleri tanımlayın (bkz.
    2. Aşağıdaki peptid eşik parametrelerini kullanarak peptid tanımlama verilerini DynamX'e aktarın (bkz. Malzeme Tablosu): minimum yoğunluk = 5000, minimum sıra uzunluğu = 0, maksimum sıra uzunluğu = 40, minimum ürünler = 1, amino asit başına minimum ürünler = 0,25, minimum ardışık ürünler = 2, ürünler için minimum toplam yoğunluk = 0, minimum puan = 0 ve maksimum MH+ Hatası (ppm) = 0.
      NOT: Alternatif olarak, önerilen iş akışı28'e göre optimize edilmiş ayarları türetin.
    3. Menüden Veri'yi seçin ve PLGS Sonuçlarını İçe Aktar'a tıklayın. Spektral atama için ilgili veri dosyalarını seçmek üzere Ekle'ye tıklayın. Hepsi eklendiğinde, İleri'ye tıklayın ve yukarıdaki filtre ayarlarını girin. Ardından, Son'a tıklayın.
    4. DynamX'te aSyn'in son peptid kapsama haritasını elde etmek için izotopik atamaları manuel olarak düzenleyin.

4. Milisaniye hidrojen/döteryum değişim çalışması

  1. HDX denemelerine başlamadan önce FastHDX prototip cihazını temizleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Uyumlu HDX yazılımı GUI'sini açın ve sistemin başlatılmasına izin verin.
    2. Numune Odası sıcaklığını 20 °C ve Söndürme Odasına 0,5 °C olarak girin. Yeni sıcaklıkları uygulamak için Ayarla'ya tıklayın.
    3. Santrifüj borularını tüm girişlerde LC-MS sınıfı su ile ayarlayın.
    4. Titratör Sıhhi Tesisat Teslimatı sekmesinde, hem sol hem de sağ şırıngaları kontrol edin ve tüplerdeki gizli hava kabarcıklarını gidermek için Prime'a tıklayın. Tüm kabarcıklar gidene kadar tekrarlayın.
    5. Makrolar sekmesinde, şırıngaların tüm kutularını işaretleyin. Şırıngaların Ev Konumunu Kalibre Et'e tıklayın. Şırınga Yük Döngüsünü Yıka'ya tıklayın. Tüm Karıştırma Döngüsü Hacimlerini Yıka'ya tıklayın.
    6. Adım 4.1.5'i yineleyin. 1x daha fazla.
    7. Tampon şırıngalarda herhangi bir kabarcık belirirse, şırınganın bağlantısını keserek ve kabarcığı dikey olarak çıkararak gazı çözün. Şırıngayı değiştirin ve sıfır konumuna yeniden kalibre edin.
  2. HDX denemeleri için FastHDX prototip cihazını ayarlayın.
    1. Toplam geri kazanım şişesine 500 uL filtrelenmiş 5 μM aSyn ekleyin ve sıcaklığa bağlı oligomerizasyon ve kümelenmeyi önlemek için bir masa üstü buzdolabının içine yerleştirin.
    2. Her tampona 50 mL denge, etiketleme ve söndürme tamponu ekleyin (2. HDX tampon hazırlama adımları 1-3) sol ve sağ bölmelerde giriş.
    3. 50 mL kolon yıkama tamponu ekleyin (2. HDX tampon hazırlama adımı 4) pepsin yıkama girişine.
    4. Protein ve kolon yıkama hatlarını 1x astarlamak için Titratör Sıhhi Tesisat Teslimatı sekmesinde hem sol hem de sağ şırıngaları kontrol edin ve Prime'a bir kez tıklayın.
      NOT: Prime'a daha sonra yapılan herhangi bir tıklama, asal işlemin ek tekrarlarına neden olur ve bu da büyük miktarda protein numunesinin tüketilmesine neden olur. Bir düğmeye tıklama denendikten sonra yazılımda bir gecikme olsa bile, bundan kaçınmaya özen göstermeniz önerilir.
    5. 4.1.5 numaralı adımları yineleyin. 1x.
    6. Manuel Söndürme Akışı sekmesinde, 4.2.7.-4.2.10 adımlarında açıklanan gerekli ayarları girin.
    7. Bir zaman kursu denemesi için, Sembolik noktalar düğmesini kullanarak zamanları milisaniye cinsinden girin. Çoğaltmalar gerekiyorsa, aynı zaman noktasını birden çok kez ekleyin, örneğin, 50 ms'lik bir üçlü için 50 50 50 girilmesi gerekir. Kütle spektrometresi yazılımındaki örnek listesinin (MassLynx burada kullanılır, Malzeme Tablosuna bakın) bu zaman noktalarıyla tam olarak eşleşmesi gerekir.
      NOT: FastHDX yazılım GUI'sine girilenlere karşılık gelen HDX etiketleme sürelerinin kalıcı bir kaydını sağlamak için kütle spektrometresi örnek listesi dosya adları ve/veya örnek metin kullanılmalıdır. Her örnek çalıştırma için etiketleme süreleri başka hiçbir yerde saklanmaz.
    8. Tuzak Süresi'ni (dakika) yakalama süresinin uzunluğu olarak ayarlayın. Burada saat 3.00.
    9. HPLC için Bekle (dakika) = (tuzak süresi + çalışma süresi + 1,5 dakika) öğesini ayarlayın.
      NOT: Örneğin, 3 dakikalık yakalama ve 17 dakikalık gradyan içeren bir deney için bu 21,50 dakika olacaktır.
    10. Yalnızca örnek çalıştırmalar arasında boş denemeler çalıştırılıyorsa Boş Çalıştır kutusunu tıklayın. Evet ise, her örnek çalıştırmadan sonra boş çalıştırma için yazılımda bir giriş (yani, örnek listesinde geçerli bir satır) olduğundan emin olun.
    11. Örnek liste yazılımda hazır olduğunda, uygun girişleri vurgulayın ve yazılımdaki Oynat düğmesine ve FastHDX'e tıklayarak yazılımda çalıştırmayı başlatın.
      NOT: Hidrojen/döteryum karıştırma nedeniyle, yalnızca MS yöntemleri veya yumuşak parçalanma teknikleri (elektron transferi ayrışması, elektron yakalama ayrışması ve ultraviyole foto-ayrışma) yalnızca29 kullanılabilir. 7.40 fizyolojik pH'ında aSyn için, 50 ms ila 300 s arasında değişen zaman noktaları, tüm döteryum alım eğrisi8'i kapsadığı için en uygun olanlardır.

5. Veri işleme

  1. Spektral olarak atanmış peptitlerin dosyasını peptid haritalama deneylerinden yükleyin. Dosya menüsünü açın ve DynamX yazılımında Aç'a tıklayın ( bkz.
  2. Ham dosyaları tercih edilen kütle ölçüm yazılımına (örneğin, DynamX, HDExaminer, vb.) aktarın. "Veri" menüsünü açın ve MS Dosyaları'na tıklayın. İncelenen her protein koşulu için durumlar oluşturmak üzere Yeni Durum'a tıklayın.
    1. Her HDX zaman noktasını eklemek için Yeni Pozlama'ya tıklayın. .raw dosyalarını içe aktarmak için Yeni RAW'a tıklayın. Her .raw dosyasını doğru konuma sürükleyin. İşiniz bittiğinde Tamam'a tıklayın.
  3. Önce izotopları otomatik olarak atayın (bu, yukarıdaki adım 5.2'yi takip eden otomatiktir), ardından yüksek veri kalitesi sağlamak için izotopik atamayı manuel olarak düzenleyin.
  4. Küme verilerini aşağıdaki sırayla sütunlar içeren bir .csv dosyasına aktarın: protein adı, sıra başlangıç numarası, sıra bitiş numarası, sıra, modifikasyon, parça, mümkün olan maksimum alım, monoizotopik türlerin kütlesi, durum adı, maruz kalma süresi, dosya adı, ücret, tutma süresi, yoğunluk ve merkez.
  5. Kütle ölçüm yazılımında Veri menüsünü açın ve Küme Verilerini Dışa Aktar'a tıklayın.

6. Veri analizi

  1. Dışa aktarılan küme verilerini tercih edilen HDX analiz yazılımına yükleyin. Burada, HDfleX30 kullanılır (bkz.
  2. HDX reaksiyonu için gözlemlenen hız sabitlerini elde etmek için uygun geri değişim düzeltme yöntemlerini seçerek tüm peptitler ve durumlar için deneysel verileri uyun.
  3. Tercih edilen yöntemle küresel bir anlamlılık eşiği hesaplayın (HDfleX bunun için çeşitli seçenekleri destekler) ve31,32 ile karşılaştırıldığında eyaletler arasındaki önemli farklılıkları belirlemek için hibrit anlamlılık testi gerçekleştirin.
    NOT: Gözlemlenen fark genel eşikten büyükse ve p değeri seçilen güven düzeyinden düşükse (örneğin, %95), fark anlamlı olarak kabul edilir.

Sonuçlar

İçsel olarak düzensiz doğası nedeniyle, fizyolojik pH'ta aSyn'deki karmaşık yapısal değişiklikleri yakalamak zordur. HDX-MS, omurga amid hidrojenlerindeki izotopik değişimi izler ve protein konformasyonel dinamiklerini ve etkileşimlerini araştırır. Bu bilgiyi yüksek yapısal ve zamansal çözünürlüklerde elde etmek için kullanılan birkaç teknikten biridir. Bu protokol, çok çeşitli proteinlere ve tampon koşullarına geniş çapta uygulanabilir ve bu, aSyn'in değişim kinetiğinin iki farklı ç...

Tartışmalar

Bu makalede, aşağıdaki prosedürler açıklanmaktadır: (1) en yüksek sekans kapsamını elde etmek için monomerik aSyn üzerinde peptid haritalama deneyleri yapmak, (2) fizyolojik koşullar altında monomerik aSyn üzerinde milisaniye HDX-MS verilerinin elde edilmesi ve (3) elde edilen HDX-MS verilerinin veri analizi ve yorumlanması gerçekleştirilmiştir. Sağlanan prosedürlerin uygulanması genellikle basittir, her etiketleme deneyi tipik olarak üç çoğaltma ve sekiz zaman noktası için yalnızca 8 saat s?...

Açıklamalar

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

NS, Üniversite Konseyi Elmas Jübile Bursu tarafından finanse edilmektedir. JJP, UKRI Geleceğin Liderleri Bursu [Hibe numarası: MR/T02223X/1] tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column Waters Corporation186002346Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolvVWR20060.420For LC mobile phases
CaCl2Sigma AldrichC5670Salt for HDX buffers
ChronosAxel Semrau (Purchased from Waters Corporation)667006090Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chlorideGoss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-2-50For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-4Deuterated water
DynamX 3.0Waters Corporation176016027Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin ColumnWaters Corporation186007233Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS GradeFisher Scientific10596814For LC mobile phases
Guanidinium hydrochlorideSigma AldrichRDD001-500GChaotrope/Denaturant
HDfleXUniversity of ExeterN/Ahttps://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KClSigma AldrichP3911Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robotWaters Corporation725000637Autosampler robot
Leucine enkephalinWaters Corporation186006013For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynxWaters Corporation667004007Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vialsWaters Corporation600000670CV100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2Sigma AldrichM8266Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filtersMilliporeN9CA7069BSyringe filters
ms2minApplied Photophysics LtdN/Afast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaClSigma AldrichS9888Salt for HDX buffers
Peltier temperature controllerLEAP Technologies Inc.HP115-COOL/DPeltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0Waters Corporation715001030Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot capsWaters Corporation186004632100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2Waters Corporation186001420100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O)Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)DLM-57For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO)Amicon (Merck Sigma Aldrich)UFC5003Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometerWaters Corporation176850035Mass spectrometer
Total recovery vialsWaters Corporation600000671CV100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HClSigma AldrichT3253-250GBuffer
Trizma baseSigma AldrichT60040-B2005Buffer
UreaSigma AldrichU5378-1KGChaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column Waters Corporation186004623Trap desalting column

Referanslar

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
  3. Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
  4. Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
  5. McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
  6. Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
  7. Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, 240-255 (2015).
  8. Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
  9. Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820 (2020).
  10. Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
  11. Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712 (2018).
  12. Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
  13. Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
  14. Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
  15. Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
  16. El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
  17. Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
  18. Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424 (2022).
  19. Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
  20. Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
  21. Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
  22. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
  23. Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
  24. Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  25. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
  26. Gasteiger, E., et al. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
  27. Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
  28. Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
  29. Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
  30. Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
  31. Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
  32. Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
  33. Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
  34. Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
  35. Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
  36. Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
  37. Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
  38. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
  39. Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
  40. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  41. Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
  42. Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
  43. Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
  44. Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
  45. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
  46. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  47. Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
  48. Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 184Alfa sin kleinintrinsik bozuklukmilisaniye hidrojen d teryum de i im k tle spektrometrisidinamik yap sal biyoloji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır