Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Burada, BMM'lerin SD sıçanlardan izolasyonu için ikincil aderans yöntemi olarak adlandırılan bir protokol sunuyoruz.
Kemik mineral yoğunluğunun azalmasıyla, kemiklerin kırılma olasılığı daha yüksektir, bu nedenle hastanın yaşam kalitesini olumsuz yönde etkiler. Kemiklerin büyümesi ve gelişmesi esas olarak osteoblastlar ve osteoklastlar tarafından düzenlenir. Osteoklastların kemik iliği monosit-makrofaj hücrelerinden (BMM'ler) türetildiği yaygın olarak kabul edilmektedir. BMM'ler ve diğer hematopoetik kök hücreler kemik iliği boşluğunda bulunur. Bu nedenle, tek kararlı BMM'leri farklı ve heterojen hücre popülasyonlarından izole etmek büyük bir zorluktur. Burada, BMM'lerin SD sıçanlardan izolasyonu için ikincil aderans yöntemi olarak adlandırılan bir protokol sunuyoruz. Primer kültürde 24-48 saat kültüre alınan yapışık hücreler toplandı. Akım sitometrik analiz, hücrelerin yaklaşık% 37.94'ünün CD11b / c + (monosit-makrofaj yüzey antijeni) olduğunu göstermiştir. Tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) boyama ve batı leke analizi, BMM'lerin in vitro osteoklastlara farklılaşabileceğini göstermiştir. Yukarıdaki bulgular, sekonder aderans hücrelerinin osteoklast farklılaşma araştırması için uygun bir hücresel model olarak düşünülebileceğini düşündürmektedir.
Kemik iliğinde bulunan monosit-makrofaj soy hücrelerinin kan monositlerine ve doku makrofajlarına farklılaşabileceği bildirilmiştir 1,2. Kemik büyümesini ve gelişimini dengelemek için osteoklastlara farklılaşabilen yukarıdaki hücreler, in vivo 3,4 osteoklastlarını indüklemek için yaygın olarak bir hücre modeli olarak kullanılır. Kemik iliği, kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri (BMM'ler), hematopoetik kök hücreler, endotel hücreleri ve bağışıklık hücrelerini içeren ancak bunlarla sınırlı olmayan birkaç farklı hücre türü içeren özel bir dokudur. Aslında, önceki birkaç çalışma, uzun kemiğin kemik iliği boşluğundan dışarı fırlayan yapışkan hücrelerin osteoblastlara, osteoklastlara, kondrositlere veya adipositlere 5,6,7,8 olarak farklılaşabileceğini öne sürdü. Farklı homojen hücre popülasyonları üretmek için farklı izolasyon ve kültür yöntemleri kullanılmış olsa da, BMM'leri çeşitli farklı hücre tiplerinden izole etmek ve kültürlemek için hala büyük zorluklar vardır.
Kemik iliği mononükleer makrofajlarını (BMSC'ler) çıkarmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğunluğu karmaşıktır 9,10,11. Örneğin, yoğunluk gradyanı santrifüjleme özel bir kit gerektirir ve işlem zaman alıcı ve hantaldır. Bu yöntem, BMM'lerin yüksek hacimli kan örneklerinden izole edilmesi için uygundur, ancak kemik iliği örneklerinden 9,12,13 için uygun değildir. Ek olarak, kollajenaz sindirimi kullanarak doku örneklerinin çıkarılması karmaşık ve zaman alıcı bir prosedürdür; BMM'lerin kemik iliği örneklerinden izolasyonu için bu yöntem önerilmez14,15. Ek olarak, akış ayrımı yüksek oranda saflaştırılmış monosit/makrofaj popülasyonlarına neden olabilse de, çok büyük numune boyutları ve yüksek cihaz ve ekipman gereksinimleri gerektirir10,16. Ek olarak, mikroboncuk zenginleştirme yöntemi son derece pahalıdır ve genel bir laboratuvarda uygulanabilir değildir17.
Bu nedenle, mevcut çalışmada, mononükleer makrofajların kemik iliğinden izole edilmesi için uygun, hızlı ve ucuz bir yöntem önerilmiştir. Farklı zaman noktaları için yapıştırılan kemik iliği hücreleri, ikincil bir aderans yöntemi kullanılarak BMM'leri izole etmek için kullanıldı. Yukarıdaki yöntemle ekstrakte edilen BMM'ler, in vitro osteoklastların oluşumunu indükleyebilir, böylece in vitro osteoporozun gelecekteki çalışması için basit ve kullanışlı bir hücre modeli sağlayabilir.
Bu çalışmadaki tüm deneyler, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Araştırma Merkezi'nin hayvan deneyi kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Onay No: IACUC-20181029-11).
1. Hücre ekstraksiyonu
2. Hücrenin FACS boyanması
3. Wright-Giemsa boyama
4. TRAP boyama
5. Batı lekesi
İkincil aderans hücre popülasyonu stabil ve tekdüzeydi. Sürekli hücre proliferasyonu ile hücrelerin çoğunluğu düzensiz şekilli olarak daha büyük hale geldi ve radyal yapışkan bir diske dönüştü (Şekil 2C, D). Akım sitometrisi, monosit-makrofaj soy hücrelerinin yüzeyinde moleküler bir belirteç olan CD11b/c'yi eksprese eden hücrelerin yüzdesinin yaklaşık %37.94 olduğunu göstermiştir (Şekil 2...
Osteoklastlar, kemik hastalıklarının ortaya çıkmasında ve gelişmesinde rol oynayan en önemli hücre tiplerinden biridir ve kemik hastalığı araştırmalarının birincil hedeflerinden biridir20. Monosit / makrofajlar osteoklastlara farklılaşabilir. Mononükleer makrofajlar (RAW264.7 hücreleri) satın almak için çok pahalı olduğundan ve kültür sırasında kolayca aktive edildiğinden, bu hücre hattını kullanarak in vitro farklılaşma deneyleri yapmak zordur. Kemik il...
Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.
Bu çalışma Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe no. LY19H060001) ve Zhejiang Geleneksel Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (no. 2022ZB093).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
Cell culture dish | corning | 430167 | |
Cell culture flask | corning | 430168 | |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
PBS | Biosharp | BL302A | |
RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır