JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, BMM'lerin SD sıçanlardan izolasyonu için ikincil aderans yöntemi olarak adlandırılan bir protokol sunuyoruz.

Özet

Kemik mineral yoğunluğunun azalmasıyla, kemiklerin kırılma olasılığı daha yüksektir, bu nedenle hastanın yaşam kalitesini olumsuz yönde etkiler. Kemiklerin büyümesi ve gelişmesi esas olarak osteoblastlar ve osteoklastlar tarafından düzenlenir. Osteoklastların kemik iliği monosit-makrofaj hücrelerinden (BMM'ler) türetildiği yaygın olarak kabul edilmektedir. BMM'ler ve diğer hematopoetik kök hücreler kemik iliği boşluğunda bulunur. Bu nedenle, tek kararlı BMM'leri farklı ve heterojen hücre popülasyonlarından izole etmek büyük bir zorluktur. Burada, BMM'lerin SD sıçanlardan izolasyonu için ikincil aderans yöntemi olarak adlandırılan bir protokol sunuyoruz. Primer kültürde 24-48 saat kültüre alınan yapışık hücreler toplandı. Akım sitometrik analiz, hücrelerin yaklaşık% 37.94'ünün CD11b / c + (monosit-makrofaj yüzey antijeni) olduğunu göstermiştir. Tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) boyama ve batı leke analizi, BMM'lerin in vitro osteoklastlara farklılaşabileceğini göstermiştir. Yukarıdaki bulgular, sekonder aderans hücrelerinin osteoklast farklılaşma araştırması için uygun bir hücresel model olarak düşünülebileceğini düşündürmektedir.

Giriş

Kemik iliğinde bulunan monosit-makrofaj soy hücrelerinin kan monositlerine ve doku makrofajlarına farklılaşabileceği bildirilmiştir 1,2. Kemik büyümesini ve gelişimini dengelemek için osteoklastlara farklılaşabilen yukarıdaki hücreler, in vivo 3,4 osteoklastlarını indüklemek için yaygın olarak bir hücre modeli olarak kullanılır. Kemik iliği, kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri (BMM'ler), hematopoetik kök hücreler, endotel hücreleri ve bağışıklık hücrelerini içeren ancak bunlarla sınırlı olmayan birkaç farklı hücre türü içeren özel bir dokudur. Aslında, önceki birkaç çalışma, uzun kemiğin kemik iliği boşluğundan dışarı fırlayan yapışkan hücrelerin osteoblastlara, osteoklastlara, kondrositlere veya adipositlere 5,6,7,8 olarak farklılaşabileceğini öne sürdü. Farklı homojen hücre popülasyonları üretmek için farklı izolasyon ve kültür yöntemleri kullanılmış olsa da, BMM'leri çeşitli farklı hücre tiplerinden izole etmek ve kültürlemek için hala büyük zorluklar vardır.

Kemik iliği mononükleer makrofajlarını (BMSC'ler) çıkarmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğunluğu karmaşıktır 9,10,11. Örneğin, yoğunluk gradyanı santrifüjleme özel bir kit gerektirir ve işlem zaman alıcı ve hantaldır. Bu yöntem, BMM'lerin yüksek hacimli kan örneklerinden izole edilmesi için uygundur, ancak kemik iliği örneklerinden 9,12,13 için uygun değildir. Ek olarak, kollajenaz sindirimi kullanarak doku örneklerinin çıkarılması karmaşık ve zaman alıcı bir prosedürdür; BMM'lerin kemik iliği örneklerinden izolasyonu için bu yöntem önerilmez14,15. Ek olarak, akış ayrımı yüksek oranda saflaştırılmış monosit/makrofaj popülasyonlarına neden olabilse de, çok büyük numune boyutları ve yüksek cihaz ve ekipman gereksinimleri gerektirir10,16. Ek olarak, mikroboncuk zenginleştirme yöntemi son derece pahalıdır ve genel bir laboratuvarda uygulanabilir değildir17.

Bu nedenle, mevcut çalışmada, mononükleer makrofajların kemik iliğinden izole edilmesi için uygun, hızlı ve ucuz bir yöntem önerilmiştir. Farklı zaman noktaları için yapıştırılan kemik iliği hücreleri, ikincil bir aderans yöntemi kullanılarak BMM'leri izole etmek için kullanıldı. Yukarıdaki yöntemle ekstrakte edilen BMM'ler, in vitro osteoklastların oluşumunu indükleyebilir, böylece in vitro osteoporozun gelecekteki çalışması için basit ve kullanışlı bir hücre modeli sağlayabilir.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm deneyler, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Araştırma Merkezi'nin hayvan deneyi kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Onay No: IACUC-20181029-11).

1. Hücre ekstraksiyonu

  1. Sprague-Dawley sıçanlarını (SD sıçanları, 1-10 günlük, erkek veya dişi) CO2 ile dolu ötenazi kafeslerine% 30-70 konteyner hacmi / dakika arasında dengeli bir oranda koyun. Sıçanlar bilincini kaybettikten sonra (20-60 dakika), ağrısız bir ölüm sağlamak için sıçanı servikal çıkık ile ötenazi yapın.
  2. Sıçanları dezenfeksiyon için 10 dakika boyunca% 75 alkole batırın.
  3. Sıçanın tüm uzuvlarını makas ve forseps ile dikkatlice çıkarın, bir pipet kullanarak PBS ile aspire edin ve uzuvlara yapışan kanı temizleyin.
  4. 500 mL DMEM'e 5 mL penisilin / streptomisin çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. 50 mL'lik steril bir santrifüj tüpü alın, 5 mL FBS ve 45 mL DMEM ortamı ekleyin ve% 1 penisilin / streptomisin çözeltisi içeren% 10'luk bir FBS DMEM elde etmek için iyice karıştırın. Yukarıdaki kültür ortamının 2 mL'sini 5 mL'lik bir tüpe ekleyin.
  5. Uzuv kemiklerini 5 mL tüpe aktarın. Tüpteki uzuv kemiklerini küçük parçalara (1-3 mm) kesmek için makas kullanın ve kemik iliği hücrelerini kültür ortamına yeniden askıya almak için homojenatı karıştırın. Doku parçaları tüpün dibine yerleşene kadar 5 dakika bekletin.
  6. 100 mm'lik bir kültür kabına 10 mL'lik %10 FBS DMEM ekleyin ve ardından süpernatantı kültür kabına aktarın. Süpernatanı aspire ederken, doku kalıntılarını kültür kabına aktarmaktan kaçının.
  7. Yaklaşık 24 saat boyunca 37 °C'de ve %5 CO2'de inkübe edin. Bu kuluçka süresinden sonra, mezenkimal kök hücrelerin çoğunluğu kültür çanak duvarına yapışacak ve yavaş büyürken, çoğu BMM hala kültür ortamında askıya alınacaktır.
  8. 100 mm'lik kültür kabındaki hücre süspansiyonunu yeni bir 25cm2 şişeye aktarın ve hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de ek bir 24 saat boyunca yetiştirmeye devam edin. Eski ortamı dikkatlice çıkarın ve BMM'ler şişe duvarına yapıştıktan sonra taze ortamla değiştirin.
  9. Şişedeki hücreler% 80-90 akıcılığa ulaştığında alt kültür.
    NOT: Tüm hücreler 37 °C ve% 5 CO2'de kültürlendi. Kültür sırasında, hücre morfolojisi yavaş yavaş birleştirildi. Hücreler büyüktü, düzensiz şekilliydi, radyal olarak büyüyordu ve şişeye çoklu çekirdeğin gözlemlenebildiği bir disk şeklinde bağlanmıştı.

2. Hücrenin FACS boyanması

  1. Tripsin, 37 ° C'de 1-2 mL ticari tripsin ve 5 dakika boyunca% 5 CO2 kullanarak sindirilir ve 100.000 / numunelik bir nihai hücre sayımı sağlamak için ikincil yapışkan hücreleri sayın (Neubauer hemositometreli hücreleri sayın).
  2. Hücreleri üç gruba ayırın (500 μL PBS 100.000 hücre içerir): (1) lekesiz hücreler içeren boş kontrol grubu; (2) izotip kontrol grubu; ve (3) deney grubu (CD11b/c boyama).
  3. Birincil antikorları (boş kontrol grubu için antikor yok; izotip kontrol grubu için anti-CD11 izotip kontrolü, 0.6 μL antikor/numune, 1 μg/örnek; deney grubu için anti-CD11b/c, 1 μL antikor/örnek, 1 μg/örnek) 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
  4. 5 dakika boyunca 300-350 x g'de santrifüj yapın, süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL PBS ile yeniden askıya alın. Bağlanmamış birincil antikorların yıkandığından emin olmak için yukarıdaki prosedürü bir kez tekrarlayın.
  5. Karşılık gelen sekonder antikoru (boş kontrol grubu için antikor yok; izotip kontrolü ve deney grupları için keçi anti-tavşan IgG, 0.25 μL antikor / örnek, 1: 2.000) karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.
  6. 5 dakika boyunca 300-350 x g'de santrifüj yapın, süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL PBS ile yeniden askıya alın. Bağlanmamış ikinci antikorların yıkandığından emin olmak için yukarıdaki prosedürü bir kez tekrarlayın.
  7. CD11b/c pozitif hücrelerini akış sitometrisi ile tespit edin (10.000 hücre/örnek) ve verileri yazılımla analiz edin (örneğin, FlowJo 7.5).
    NOT: CD11b/c+ hücrelerinin son yüzdesini elde etmek için aşağıdaki formül kullanılmıştır: Deney grubundaki CD11b / c + hücrelerinin yüzdesi - izotip kontrol grubundaki CD11 + hücrelerinin yüzdesi.

3. Wright-Giemsa boyama

  1. 35mm2 hücre tırmanma tabakalarına (1 × 106 hücre / kuyu) ve kültüre 37 ° C'de ve% 5 CO2'ye 24 saat boyunca üç kez geçirilen yapışkan ikincil hücreleri tohumlayın.
  2. Kültür ortamını atın ve PBS ile üç kez yıkayın.
  3. Wright-Giemsa boya çözeltisini (0,5 mL-0,8 mL) hücre tırmanma tabakasına 1 dakika boyunca ekleyin.
  4. Boyayı damıtılmış suyla (0,5 mL-0,8 mL) pamuklu çubukla karıştırın ve 10 dakika bekletin.
  5. Boya çözeltisini damıtılmış suyla yıkayın ve ardından 1-3 dakika kurutun. Mikroskop altında gözlemleyin.

4. TRAP boyama

  1. 35mm2 hücre tırmanma tabakalarına (1 × 106 hücre / kuyu) ve kültüre 37 ° C'de ve% 5 CO2'ye 24 saat boyunca üç kez geçirilen yapışkan ikincil hücreleri tohumlayın.
  2. Eski ortamı, nükleer faktör-κB ligandının (RANKL) 50 ng / mL reseptör aktivatörü ve 30 ng / mL makrofaj kolonisi uyarıcı faktörü (M-CSF) ve 37 ° C'de kültür ve% 5 CO2 ile desteklenmiş% 10 FBS DMEM veya osteoklast indüksiyon ortamı ile değiştirin.
  3. TRAP boyama kiti ile hücreleri üreticinin protokolüne göre lekeleyin ve mikroskop altında gözlemleyin.
    NOT: TRAP-pozitif hücreler, ışık mikroskobu altında mor olan osteoklastlar olarak tanımlandı. TRAP-pozitif hücrelerin sayısı ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü.

5. Batı lekesi

  1. 35mm2 hücre tırmanma tabakalarına (1 × 106 hücre / kuyu) ve kültüre üç kez geçirilen yapışkan ikincil hücreleri 24 saat boyunca tohumlayın.
  2. Eski ortamı taze% 10 FBS DMEM veya osteoklast indüksiyon ortamı (50 ng / mL RANKL ve 30 ng / mL M-CSF) ve kültür ile 37 ° C'de 7 gün daha ve% 5 CO2 ile değiştirin.
  3. Toplam hücresel proteinleri RIPA tamponu ile ekstrakte edin,% 10 SDS-PAGE ile ayırın ve poliviniliden florür membranlarına aktarın18,19.
  4. 2 saat boyunca% 5 yağsız süt tozu (25 mL) ile bloke edin ve TBS-Tween 20 (TBST) ile her seferinde 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  5. Primer antikorları gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (anti-β-aktin, anti-TRAP ve anti-kathepsin K; tüm primer antikorlar 1:1.000, 10 mL seyreltilmiş antikor / bant olarak seyreltildi) ve TBST ile üç kez yıkayın.
  6. Sekonder antikoru (keçi anti-tavşan IgG, 1:2.000 seyreltme, 10 mL seyreltilmiş antikor/bant) oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin ve TBST ile üç kez yıkayın. Gelişmekte olan bir çözüm kullanarak protein bantlarını görselleştirin.
    NOT: Yukarıdaki proteinlerin ekspresyon seviyeleri β-aktin'e normalleştirildi.

Sonuçlar

İkincil aderans hücre popülasyonu stabil ve tekdüzeydi. Sürekli hücre proliferasyonu ile hücrelerin çoğunluğu düzensiz şekilli olarak daha büyük hale geldi ve radyal yapışkan bir diske dönüştü (Şekil 2C, D). Akım sitometrisi, monosit-makrofaj soy hücrelerinin yüzeyinde moleküler bir belirteç olan CD11b/c'yi eksprese eden hücrelerin yüzdesinin yaklaşık %37.94 olduğunu göstermiştir (Şekil 2...

Tartışmalar

Osteoklastlar, kemik hastalıklarının ortaya çıkmasında ve gelişmesinde rol oynayan en önemli hücre tiplerinden biridir ve kemik hastalığı araştırmalarının birincil hedeflerinden biridir20. Monosit / makrofajlar osteoklastlara farklılaşabilir. Mononükleer makrofajlar (RAW264.7 hücreleri) satın almak için çok pahalı olduğundan ve kültür sırasında kolayca aktive edildiğinden, bu hücre hattını kullanarak in vitro farklılaşma deneyleri yapmak zordur. Kemik il...

Açıklamalar

Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe no. LY19H060001) ve Zhejiang Geleneksel Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (no. 2022ZB093).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm2 cell climbing slicesNEST Biotechnology80102
Anti-cathepsin KAbcamab190271:1,000
Anti-CD11 isotype controlAbcamab1727301 μg/test,1.675 mg/Ml
Anti-CD11b/cAbsinabs124232 1μg/test, 1 mg/mL
Anti-TRAPAbcamab1914061:1,000
Anti-β-actinBeyotime AF50031:1,000
Cell climbing slicesNEST Biotechnology80102
Cell culture dishcorning430167
Cell culture flaskcorning430168
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)GibcoC11995500BT
Fetal bovine serum (FBS)Gibco10099141C
Goat anti-rabbit IgGAbcamab150077for IF, 1:2,000
goat anti-rabbit IgGAbcamab6721for WB, 1:2,000
M-CSFPepro tech400-28
PBSBiosharpBL302A
RANKLPepro tech400-30
SD ratShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd1-10 days old
SDS-PAGE gel preparation kitSolarbioP1200
TRAP/ALP Staining KitWako294-67001
Trypsin-EDTA solutionBiosharpBL512A
Wright-Giemsa solutionKeygen BiotechKGA225-1

Referanslar

  1. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
  2. Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
  3. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  4. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  5. Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
  6. Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
  7. Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
  8. Horowitz, M. C., et al. marrow adipocytes. Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).
  9. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
  10. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
  11. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
  12. Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
  14. Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
  15. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
  16. Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
  17. Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
  18. Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657 (2020).
  19. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759 (2008).
  20. Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550 (2019).
  21. Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
  22. Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 185monosit makrofaj soy h creleridiferansiyel aderansh cre farkl la mas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır