Özelleştirilmiş Perfüzyon Biyoreaktöründe Domuz Vaskülarize Fleplerinin Tedariği ve Perfüzyon-Desellülarizasyonu

Özet

Protokol, özelleştirilmiş bir perfüzyon biyoreaktöründe flep vaskülatürü boyunca sodyum dodesil sülfat deterjanının perfüzyonu ile vaskülarize domuz fleplerinin cerrahi tedarikini ve ardından desellülarizasyonunu açıklamaktadır.

Özet

Büyük hacimli yumuşak doku defektleri fonksiyonel eksikliklere yol açar ve hastanın yaşam kalitesini büyük ölçüde etkileyebilir. Cerrahi rekonstrüksiyon otolog serbest flep transferi veya vaskülarize kompozit allotransplantasyon (VCA) kullanılarak yapılabilse de, bu tür yöntemlerin dezavantajları da vardır. Donör bölge morbiditesi ve doku mevcudiyeti gibi sorunlar otolog serbest flep transferini sınırlarken, immünsüpresyon VKA'nın önemli bir sınırlamasıdır. Rekonstrüktif cerrahide desellülarizasyon/resellülarizasyon yöntemleri kullanılarak tasarlanmış dokular olası bir çözümü temsil eder. Desellülarize dokular, altta yatan hücre dışı matriks (ECM) mikromimarisini korurken doğal hücresel materyali uzaklaştıran yöntemler kullanılarak üretilir. Bu asellüler iskeleler daha sonra alıcıya özgü hücrelerle yeniden hücreselleştirilebilir.

Bu protokol, bir domuz modelinde asellüler iskeleler elde etmek için kullanılan tedarik ve desellülarizasyon yöntemlerini detaylandırır. Ek olarak, perfüzyon biyoreaktör tasarımının ve kurulumunun bir tanımını da sağlar. Flepler domuz omentumu, tensör fascia lata ve radyal önkolu içerir. Desellülarizasyon, düşük konsantrasyonlu sodyum dodesil sülfat (SDS) deterjanın ex vivo perfüzyonu ile gerçekleştirilir, ardından DNaz enzim tedavisi ve özelleştirilmiş bir perfüzyon biyoreaktöründe perasetik asit sterilizasyonu gerçekleştirilir.

Başarılı doku desellülarizasyonu, makroskopik olarak fleplerin beyaz-opak görünümü ile karakterizedir. Asellüler flepler, histolojik boyamada çekirdek bulunmadığını ve DNA içeriğinde önemli bir azalma olduğunu gösterir. Bu protokol, korunmuş ECM ve vasküler mikromimariye sahip desellülarize yumuşak doku iskeleleri üretmek için verimli bir şekilde kullanılabilir. Bu tür iskeleler daha sonraki resellülarizasyon çalışmalarında kullanılabilir ve rekonstrüktif cerrahide klinik çeviri potansiyeline sahiptir.

Giriş

Travmatik yaralanma ve tümörün çıkarılması büyük ve karmaşık yumuşak doku defektlerine yol açabilir. Bu kusurlar hastanın yaşam kalitesini bozabilir, fonksiyon kaybına neden olabilir ve kalıcı sakatlığa neden olabilir. Otolog doku flebi transferi gibi teknikler yaygın olarak uygulanmakla birlikte, flep mevcudiyeti ve donör bölge morbiditesi ile ilgili sorunlar önemli sınırlamalardır ^1,2,3. Vaskülarize kompozit allotransplantasyon (VCA), kas, deri, vaskülatür gibi kompozit dokuları alıcılara tek bir ünite olarak aktaran umut verici bir alternatiftir. Bununla birlikte, VCA, ilaç toksisitesine, fırsatçı enfeksiyonlara ve malignitelere yol açan uzun süreli immünsüpresyon gerektirir ^4,5,6.

Doku mühendisliği asellüler iskeleler bu sınırlamalara potansiyel bir çözümdür⁷. Asellüler doku iskeleleri, altta yatan hücre dışı matriks (ECM) mikromimarisini korurken hücresel materyali doğal dokulardan uzaklaştıran desellülarizasyon yöntemleri kullanılarak elde edilebilir. Doku mühendisliğinde sentetik malzemelerin kullanılmasının aksine, biyolojik olarak türetilmiş iskelelerin kullanımı, biyouyumluluğa ve klinik translasyon potansiyeline izin veren biyomimetik bir ECM substratı sunmaktadır⁸. Desellülarizasyonu takiben, alıcıya özgü hücrelere sahip iskelelerin daha sonra yeniden hücreselleştirilmesi, daha sonra immünojenisitesi çok az olan veya hiç olmayan işlevsel, vaskülarize dokular üretebilir ^9,10,11. Perfüzyon desellülarizasyon tekniklerini kullanarak asellüler dokuları elde etmek için etkili bir protokol geliştirerek, çok çeşitli doku tipleri tasarlanabilir. Buna karşılık, bu teknik üzerine inşa etmek, daha karmaşık dokulara uygulamaya izin verir. Bugüne kadar, vaskülarize yumuşak dokuların perfüzyon desellülarizasyonu, kemirgen¹², domuz¹³ ve insan modelleri^14'te tam kat fasyokutanöz flep ve domuz rektus abdominis iskelet kası¹⁵ gibi basit vaskülarize dokular kullanılarak araştırılmıştır. Ek olarak, kompleks vaskülarize dokular da domuz ve insan kulağı^16,17 modellerinde ve insan tam yüz grefti modellerinde ¹⁸ gösterildiği gibi perfüzyondan arındırılmıştır.

Burada protokol, biyolojik olarak türetilmiş ECM iskeleleri kullanılarak vaskülarize serbest fleplerin desellülarizasyonunu açıklamaktadır. Klinik olarak ilgili üç flebin desellülarizasyonunu sunuyoruz: 1) omentum, 2) tensor fascia lata ve 3) radyal önkol, hepsi rekonstrüktif cerrahide rutin olarak kullanılan ve doku desellülarizasyonu bağlamında hayvan çalışmalarında daha önce incelenmemiş olan iş gücü fleplerini temsil etmektedir. Bu biyomühendislik ürünü flepler, büyük yumuşak doku defekti onarımı ve rekonstrüksiyonu alanında kullanılmak üzere klinik uygulamalar için potansiyele sahip çok yönlü ve hazır bir platform sunar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan denekleri içeren tüm prosedürler Üniversite Sağlık Ağı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve Üniversite Sağlık Ağı Hayvan Kaynak Merkezi protokolü ve prosedürleri ile Kanada Hayvan Bakım Kılavuzları Konseyi'ne uygun olarak gerçekleştirilmektedir. Tüm deneyler için beş Yorkshire domuzu (35-50 kg; yaş yaklaşık 12 haftalık) kullanıldı.

1. Perfüzyon biyoreaktör imalatı

1. Perfüzyon biyoreaktöründe kullanılan tüm bileşenler için Şekil 1'e bakınız. Doku odasının imalatı için, silikon sızdırmazlık astarı içeren su geçirmez ve hava geçirmez kapaklara sahip, piyasada bulunan polipropilen geçmeli kilitli kaplar kullanın. Konteynerlerin otoklav uyumlu olduğundan emin olun.
2. Kabın kenarları boyunca iki adet 1/4 delik açın ve kısa bir L/S-16 platin kaplı silikon boru segmentini geçirin. Bir boru giriş perfüzyonunu taşıyacak ve diğeri çıkış içindir.
3. Giriş borusu için, doku kanülüne bağlanmak için kullanılacak iç kısma bir erkek Luer konektörü takın. Giriş borusunun dış ucuna, üç yönlü bir durdurma horozuna bağlanmak için kullanılacak dişi bir Luer konektörü takın.
4. Hazne kapağında tek bir 1/4 delik açın ve L/S-16 platin kaplı silikon borunun başka bir kısa segmentini dişleyin. Bu boru havalandırma deliği olarak hizmet edecektir.
5. Giriş ve çıkış borusunu yaklaşık 50 cm L/S-16 platin kaplı silikon boru ölçerek yapın. Perfüzyonu deterjan haznelerinden biyoreaktör odasına taşımak için bir ucunu sarı üç kademeli pompa borusuna, diğer ucunu steril 2 mL serolojik pipete bağlayın.
6. Tüm bileşenleri (hazne ve boru) ayrı ayrı sarılmış steril ambalajlarda otoklav yapın.

Resim 1: Perfüzyon biyoreaktörünün imalatı. Perfüzyon biyoreaktörü, (A) hava ve su geçirmez kapaklı perfüzyon borularını yerleştirmek için yan delikleri açılmış plastik bir polipropilen doku odasından (B) oluşur. (C) Stopcock'lar, deterjan haznesinden desellülarizasyon maddeleri taşıyan perfüzyon borusunun tek geçişli bir şekilde atıklara bağlanmasını sağlamak için boruya bağlanır. (D) Üç kademeli boruyu peristaltik pompaya bağlamak için uyumlu pompa kasetleri kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Desellülarizasyon çözeltilerinin hazırlanması

1. 100 mL normal salin içinde 1.5 mL 1000 I.U./mL heparin stok çözeltisini seyrelterek heparinize normal salin çözeltisi (15 IU/mL) hazırlayın.
2. 18 L otoklavlanmış damıtılmış-deiyonize suya yavaşça 9 g SDS tozu ekleyerek % 0.05 w / v sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi hazırlayın. SDS çözeltisine uyum sağlamak için büyük hacimli bir polipropilen (PP) damacana kullanın. Çözelti tamamen çözündüğünde kullanıma hazırdır. Oda sıcaklığında saklayın.
3. DNase I çalışma çözümünü hazırlayın. İlk olarak, liyofilize DNaz I'i steril_{dH 2}O'da 5 mM CaCl₂ ile 10 mg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden oluşturun. yeniden yapılandırılmış stok DNaz I çözeltisini kullanıma hazır olana kadar -20 ° C'lik bir dondurucuda alikotlar olarak saklayın. Kullanım gününde, DNaz I stoğu 1:100'ü steril_{dH 2}O'da Mg⁺+(1.29 mM) ve Ca⁺⁺(1.98 mM) ile 0.1 mg/mL'lik son konsantrasyona kadar seyreltin.
   NOT: DNase etkinliği, dondurulmuş olarak depolanmadığı sürece bozulur. DNA'nın oda sıcaklığında enzimatik sindirimi için sadece taze çalışan DNaz çözeltisi kullanılmalıdır.
4. Bir PP damacoda 5 L'lik son hacimde steril otoklavlanmış su ile 10x PBS stoğunu 1:10 seyrelterek 1x PBS çözeltisi hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
5. PBS'de% 1 antibiyotik / antimikotik (A / A) hazırlayın. 100x antibiyotik/antimikotik 1:100'ü steril 1x PBS çözeltisi ile 1 L'lik son hacme kadar seyreltin.
6. 3,13 mL PAA + 40 mL %100 etanol + 956 mL steril dH₂O ekleyerek %0,1 (v/v) perasetik asit (PAA)/%4 (v/v) etanol (EtOH) hazırlayın.

3. Domuz kapaklarının temini

NOT: Bu bir terminal yordamıdır. Üç kanadı da tedarik etmek için bir domuz kullanıldı. Tüm kanatların satın alınmasını takiben hayvanı insancıl bir şekilde ötenazi yapın.

1. Ameliyat öncesi bakım
   1. Hızlı domuzlar ameliyattan en az 12 saat önce. Hayvanları ketamin (20 mg / kg kas içi, IM), atropin (0.04 mg / kg IM) ve midazolam (0.3 mg / kg IM) ile sakinleştirin.
   2. Periferik hat yerleştirme ve entübasyon için 22-44 mL/kg/dak akış hızında bir maske vasıtasıyla %5 izofluran solunması ile anesteziyi indükleyin. Anesteziyi %0.5-%2 izofluran ile 22-44 mL/kg/dak'da sürdürün. Hemodinamik stabiliteyi kontrol ederek yeterli anestezi derinliği sağlayın ve uygulanan uygun bir anestezi seviyesini belirtmek için palpebral / pedal çekilme reflekslerinin veya çene kası tonusunun bulunmadığını not edin. Analjezi cerrahisi sırasında intravenöz remifentanil (10-20 μg / kg / h) sürekli hızlı infüzyon uygulayın.
   3. Domuzu uygun bir endotrakeal tüp (7-8 mm) ile entübe edin ve tüpü 8 mL / kg gelgit hacmine, PEEP'i 5 cm H₂0, FiO₂ 0.5'e ve solunum hızına 14 ayarlanmış bir ventilatöre bağlayın.
   4. Kulak damarına 22 G anjiyokatat kateter yerleştirin. İntravenöz (IV) erişim sağlandıktan sonra, ortalama arteriyel basıncı 60 mmHg ile 90 mmHg arasında tutmak için prosedür boyunca 5-10 mL / kg / s'de ılık% 0.9 normal salin infüze edin.
   5. Kalp atış hızını, nabız oksimetresini ve gelgit sonu CO_2'yi sürekli izleyin. Her 5 dakikada bir kan basıncını ve vücut ısısını değerlendirin.
   6. Anestezi altındayken oküler kuruluğu önlemek için göz merhemi uygulayın. Tüm cerrahi alanı povidon-iyot ile hazırlayın. Cerrahi alanı steril havlularla örtün.
2. Omental flep
   1. Domuzu sırtüstü pozisyona yerleştirin ve ksifo-göbek laparotomi yapın.
   2. Karın içine girdikten sonra, daha büyük omentumu görselleştirmek için mide sefaladını harekete geçirin. Omentumu dikkatlice ameliyat alanına yerleştirin ve midenin daha büyük eğriliği boyunca uzanan gastro-epiploik damarları tanımlayın (Şekil 2A).
   3. Sol gastro-epiploik arterin dalak arterine katıldığı daha büyük eğriliğin sol tarafından başlayın. Düz Stevens tenotomi makası kullanarak, hem sol gastro-epiploik arteri hem de damarı iskeletleştirin. Ligat daha sonra cerrahi bağlar veya klipsler kullanarak her ikisini de ayrı ayrı böler.
   4. Midenin daha büyük eğriliği boyunca soldan sağa doğru ilerleyin. Midenin daha büyük eğriliğini sağlayan omentumdan kaynaklanan kısa vasküler dalları bağlayın ve bölün. Bu adımda omentumun ana gastroepiploik pedikülüne zarar vermemeye dikkat edin.
   5. Sağ gastro-epiploik damarların ve gastroduodenal arterin birleşmesiyle karşılaşılana kadar büyük omentumun mobilizasyonuna devam edin. Klipsler veya bağlarla, ligate daha sonra omental flebi serbest bırakmak için sağ gastroepiploik arteri ve damarları ayrı ayrı bölün.
   6. Serbest bırakıldıktan sonra, omentum orta boyunca iki yarıya bölünebilir, her yarısına ilgili gastro-epiploik arter ve ven eşlik eder. Bu, bir hayvan operasyonundan iki omental serbest flebin tedarik edilmesini sağlar. Gastro-epiploik damarları 20-22 G kanül ile ayrı ayrı kanüle edin, ardından 3-0 ipek bağlarla sabitleyin.
   7. Heparinize salini (15 I.U./mL) berrak bir venöz çıkış gözlenene kadar gastro-epiploik arteriyel kanüle boşaltın.
3. Tensor fascia lata flep
   NOT: Protokol, Haughey ve ^ark.19 tarafından domuz tensör fascia lata flebinin önceki bir açıklamasına dayanmaktadır. Tensor fascia lata flebinin sadece fasyal kısmını izole etmek için modifikasyon yapılır.
   1. Domuzu lateral decubitus pozisyonuna yerleştirin ve tüm üst arka bacağı iki taraflı olarak tıraş edin. Her zamanki steril prosedürleri kullanarak hazırlayın ve örtün.
   2. Flebin ön sınırını, anterior superior iliak omurgadan (ASIS) lateral patellaya doğru uzanan bir çizgi ile işaretleyin. Pedikülün yeri bu hat boyunca ASIS'ten yaklaşık 6-8 cm'dir.
   3. Flebin genişliğini dahil etmek için femur ekseni boyunca anterior insizyondan yaklaşık 8 cm ila 10 cm arasında paralel bir posterior çizgiyi işaretleyin. Flebin distal kenarını lateral patellada işaretleyin.
   4. Diseksiyona patelladaki distal sınırda, neşter kullanarak cildin keskin bir kesisi ile başlayın. Rektus femorisin üzerinde yer alan fasyaya rastlanana kadar deri altı dokusundan koter ile cilt insizyonunu derinleştirin.
   5. Yukarıda tarif edilen belirgin ön ve arka sınırlar boyunca ASIS'e doğru cilt kesiklerine devam edin. Fasyal flebi tek başına izole etmek için, üstteki cilt bileşenini altta yatan fasyal tabakadan çıkarın. Herhangi bir küçük perforatör damarı cilde bağlayın veya koterize edin.
   6. Flebin distal sınırına geri dönün ve altta yatan vastus lateralis kasının mobilizasyonuna izin vermek için derin fasyayı kesin. Fasyayı ASIS'e doğru harekete geçirin.
   7. Mobilizasyon sırasında vastus lateralis ve rektus femoris kasları arasından çıkan vasküler pedikülü tanımlayın (Şekil 2B). Pedikül damarlarına zarar vermemek için aşırı çekişten kaçınmaya özen gösterin.
   8. Vasküler pedikülü korurken proksimal yönü ASIS'ten diseke edin. Flep pedikülü hakkında yeterince harekete geçirilene kadar disseke edin.
   9. Pedikülü derin femoral damarlara doğru izleyin. Hem lateral circumflex femoral arteri hem de fasyal flebi besleyen veni iskeletleştirir. Ligat daha sonra her iki damarı da derin femoral damarlara katıldıkları yerde yakınsak olarak böler.
   10. Pedikül damarlarını 20 G ila 24 G anjiyokateterlerle ayrı ayrı kanüle edin, 3-0 ipek bağları ile sabitlenin. Heparinize salini (15 I.U./mL) net bir venöz çıkış gözlenene kadar flep arteriyel kanülüne yıkayın.
4. Radyal önkol flebi
   NOT: Aşağıdaki protokol, Khachatryan ve ^ark.20 tarafından domuz radyal önkol flep modelinin yayınlanmış bir açıklamasına dayanmaktadır.
   1. Domuzu ameliyat masasına lateral decubitus pozisyonunda yerleştirin. Bağımlı ön ayağı ameliyat alanı içinde konumlandırın.
   2. Radyal önkol üzerinde yaklaşık 3 cm x 3 cm cilt flebi karesini işaretleyin. Radyal arter pedikülünün yaklaşık seyrini belirtmek için proksimal flep marjının orta noktası ile antekübital fossa arasında bir çizgi çizin. Palpasyonla arteriyel seyri onaylayın.
      NOT: Domuz modelinde, radyal damarlar insanlardan nispeten daha derin bulunur. Konumları fleksör carpi radialis ve brakioradialis arasındadır.
   3. Distal açıdan antebrakiyal fasyaya kadar bir derinliğe sahip bir neşter kullanarak cildi kesin. Tenotomi makası ile distal radial arter ve iki venae komitantı ile karşılaşılıncaya kadar künt diseksiyon. Arter ve damarları cerrahi bağlarla ayrı ayrı bağlayın ve bölün.
   4. İşaretli cilt karesinin radyal ve ulnar kenarlarındaki cilt kesilerine devam edin. Radyalden ulnar yöne doğru ilerleyen cerrahi bir bıçakla altta yatan radyal kemikten flebi harekete geçirin ve aynı zamanda deri flebini antekübital fossa'ya doğru proksimal olarak kaldırın.
      NOT: Radyal arter pedikülünün üstteki kutanöz tabaka ile ilişkili kalmasını sağlamak için subfasiyal diseksiyon düzlemini koruyun.
   5. Proksimal kenar boşluğunda, proksimal radial arteri ve venae komitantlarını açığa çıkarmak için brakioradialis ve fleksör carpi radialis arasındaki boşluğu, kendiliğinden tutucu bir retraktör ile geri çekin (Şekil 2C).
   6. Tenotomi makası kullanarak, radyal arteri ve venae komitantlarını, sırasıyla brakiyal arter ve damarlara katıldıkları antekübital fossada proksimal olarak iskeletleştirin. Yaklaşık 5-6 cm'lik yeterli bir pedikül uzunluğu elde etmek için damarları çevreleyen fibroyağ dokularından disseke edin. Radyal önkol flebini serbest bırakmak için arter ve venayı ayrı ayrı bağlayın ve bölün.
   7. Pedikül damarlarını 20 G ila 24 G anjiyokateterlerle kanüle edin, 3-0 ipek bağları ile sabitlenin. Heparinize salini (15 IU/mL) net bir venöz çıkış gözlenene kadar flep arteriyel kanülüne boşaltın.
   8. Flep tedarikini takiben, flepleri desellülarizasyona hazır olana kadar 4 ° C'de soğuk salin içinde tutun. Derin izofluran anestezisi altında, intravenöz potasyum klorür enjeksiyonu (100 mg / kg IV) ile hayvanları ötenazi yapın. Hayati belirtilerin yokluğunda ölümü onaylayın.

Şekil 2: Üç adet domuz vaskülarize flebinin temini . (A) Omentum. Omental flepte sağ (i) ve sol (ii) gastroepiploik arterler kanüle edilir (iii). (B) Tensör fascia lata. Flebin pedikülü (iv), lateral femoral circumflex arterin (v) yükselen dalıdır. (C) Radyal önkol kapağı. Radyal önkol flebinin (vi) tedariki, vasküler pedikül olarak radyal arter ve vena komitantlarına (vii) dayanır (NOT: Perdeler gösterim amacıyla çıkarılmıştır). Ölçek çubukları: 3 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Decellularizasyon sisteminin kurulumu

1. Doku odasını steril koşullar altında kanatlarla laminer akışlı bir biyogüvenlik kabininde monte edin.
2. Biyoreaktörün hem giriş hem de çıkış portlarına üç yönlü bir stopcock takın. Doku haznesi kapağındaki havalandırma portuna 0,2 μm'lik bir filtre takın. Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için giriş borusunu steril heparinize tuzlu su ile astarlayın.
3. Kapakları odaya yerleştirin. Steril hemostatlar kullanarak, erkek Luer konektörünü kullanarak kanatları giriş borusuna bağlayın. Her bir kapağın ilgili arteriyel kanülünü erkek Luer'e vidalayın ve sıkı bir sızdırmazlık sağlayın.
4. Luer bağlantısının sızıntısız olduğunu ve kanatların venöz çıkış kanıtı ile perfüze edilebileceğini kontrol etmek için heparinize salini stopcock'tan yıkayın. Doku odası kapağını kapatın.
5. Giriş borusunu sarı üç kademeli pompa borusu ile doku odasının giriş durdurucusuna bağlayın. Ayrıca, perfüzyon basıncının izlenmesine izin vermek için giriş yönündeki üç yönlü durdurma horozuna bir hat içi basınç sensörü transdüseri takın.
6. Giriş peristaltik pompasını açın. Başlangıç ekranında, boru kimliğini 1,85 mm olarak ayarlamak için ok tuşunu kullanarak üçüncü sekmeye geçin. Ardından, perfüzyon oranını ayarlamak için ikinci sekmeye geçin. Giriş hızı teslimat şekli olarak ve 2 mL/dk olarak ayarlayın. Akış yönünün ekranda görüntülendiği gibi doğru olduğundan emin olun. Üç kademeli pompa borusunu uyumlu bir kasetle peristaltik pompaya yükleyin.
7. Yukarıdakine benzer çıkış peristaltik pompası için prosedürü tekrarlayın. Çıkış pompası ayarını 4 mL/dak hıza ayarlayın. Çıkış borusunu sarı üç kademeli pompa borusu ile doku odasının çıkış durdurucusuna bağlayın. Üç kademeli pompa borusunu uyumlu bir kasetle peristaltik pompaya yükleyin. Güç düğmesine basarak her iki pompanın akışını başlatın.
   NOT: Çıkış pompasının daha yüksek hızı, doku odasının taşmasını önlemek için çok önemli bir güvenlik önlemidir ve oda çıkışının hücreselleştirme sırasında her zaman girişi aşmasını sağlar. Birleştirilmiş desellülarizasyon kurulumunun tamamı Şekil 3'te gösterilmiştir.

Resim 3: Birleştirilmiş perfüzyon desellülarizasyon sistemi. (A) Perfüzyon desellülarizasyon sisteminin şeması. Giriş borusu, basınç sensörü izleme ile deterjan haznesinden doku odasına tek geçişli bir şekilde perfüzyon taşır. Çıkış borusu, doku odasından atık kabına aktif olarak nüfuz eder. Siyah oklar perfüzyon akışının yönünü gösterir. Girişi kontrol etmek için sol pompa ile birlikte peristaltik bir pompa kullanılır. Çıkış, ilgili borudan ikinci bir peristaltik pompa kullanılarak aktif olarak giderilir. BioRender.com ile oluşturulan figür. (B) Doku odalarına bağlı giriş peristaltik pompası (i) ve ardından çıkış peristaltik pompası (iii) ile tezgah üstüne monte edilmiş perfüzyon desellülarizasyon sisteminin fotoğrafı. Giriş defüzyon basıncı, doku odasına girmeden önce bir sıralı basınç sensörü (iv) ile izlenir. Burada, üç flep paralel olarak desellülarize edilir. Hem deterjan hem de atık hazneleri tezgahın altındadır ve fotoğraflanmamıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Domuz fleplerinin desellülarizasyonu

1. Oda sıcaklığında perfüzyon desellülarizasyonu için aşağıdaki adımların tümünü uygulayın. Perfüzyon oranlarının ve sürelerinin bir özeti için Tablo 1'e bakınız. Peristaltik bir pompa kullanarak heparinize salinin perfüzyonuna 2 mL / dak'da başlayın ve tutulan kan pıhtılarını çıkarmak için flepleri doku odasında heparinize salin ile 15 dakika boyunca perfüze edin.
2. Heparinize salin perfüzyonunun tamamlanmasından sonra, doku odasında rezidüel salini aspire edin. Kapağı yeterince suya batırmak için doku odasını yaklaşık 500 mL SDS desellülarizasyon çözeltisi ile doldurun.
3. Giriş borusunu SDS desellülarizasyon çözeltisine aktarın ve dokuyu 2 mL / dak'da perfüze edin. Perfüzyon süresi flepe bağlı olarak değişir; SDS'yi omentum için 2 gün, tensör fasyası için 3 gün ve radyal önkol fasyo-kutanöz flep için 5 gün perfüze edin.
4. SDS desellülarizasyonunun tamamlanmasından sonra, doku odasında bulunan mevcut SDS perfüzyonatını aspire edin. Giriş borusunu 1x PBS çözeltisine aktarın ve kapakları 1 gün boyunca 2 mL / dak'da perfüze edin.
5. Önceki PBS çözümünü çıkarın ve giriş borusunu DNase çalışma çözümüne aktarın. 2 mL/dk'da 2 saat perfüze edin. DNaz çözeltisini doku odasından çıkarın ve giriş borusunu 1x PBS çözeltisine yerleştirin. Dokuları haznede 1x PBS çözeltisi ile daldırın ve 1x PBS çözeltisini 1 gün boyunca 2 mL / dak'da perfüze edin.
6. Kapakları PAA/EtOH çözeltisi ile sterilize edin. Giriş borusunu dH₂O çözeltisinde PAA / EtOH'ye aktarın ve dokuları aynı çözeltiye batırın. PAA/EtOH'yi 3 saat boyunca 2 mL/dak'da perfüze edin. PAA/EtOH sterilizasyonu tamamlandıktan sonra, boruyu üç yönlü durduruculardan ayırın.
7. Aseptik teknik kullanarak flepleri çıkarın ve steril aletleri %1 antibiyotik/antimikotik (A/A) içeren PBS'ye yerleştirin. Artık asidi tamamen nötralize etmek için kapakları PBS + %1 A/A ile 15 dakika boyunca iki ayrı yıkamaya daldırın. Kapakları PBS + %1 A/A içinde 4 °C'de hücreselleştirmeye hazır olana kadar tutun.
8. Agar plakaları üzerinde bir çubuk kültürü uygulayarak iskelelerin sterilitesini doğrulayın ve mikrobiyal büyümeyi inceleyin. Agar plakalarını her flep yüzeyinden alınan çubuklarla aşılayın. Agar plakalarını 2 haftaya kadar 37 ° C'de kültürleyin. Sterilite, mikrobiyal koloni büyümesinin yokluğu ile gösterilir.

Tablo 1: Perfüzyon-desellülarizasyon protokolü parametrelerinin özeti. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

6. Desellülarizasyonun değerlendirilmesi

1. Bir punch biyopsisi kullanarak, kapaklardan 3 mm ila 10 mm kalınlığında numuneler alın.
2. Histoloji için, histolojik kasetlerdeki biyopsileri oda sıcaklığında 24 saat boyunca normal tamponlu formalinde sabitleyin.
3. Biyopsi kasetlerini 15 dakika boyunca suda veya PBS'de yıkayın, ardından doku işlemeye hazır olana kadar% 70 etanol içine yerleştirin. Kasetleri standart protokollere göre bir doku işlemcisinde işleyin.
4. Biyopsileri parafine yerleştirin, balmumunun soğuk bir plaka üzerinde 10-15 dakika boyunca katılaşmasına izin verin. Bölüm parafin, bir mikrotom üzerinde 5 μm kalınlığa kadar bloklar. Slaytları standart protokollere göre hematoksilin ve eozin (H&E) ile sabitleyin. Işık mikroskobu ile doku slaytlarını görüntüleyin.
5. DNA içeriği ölçümü için, 60 ° C'de bir fırında gece boyunca kurutulan dokuyu takiben doku biyopsilerinin kuru ağırlığını elde edin. Numuneleri gece boyunca 65 ° C'de bir papain ekstraksiyon tamponunda sindirin. Sindirilmiş numuneleri 10.000 x g'da santrifüj yapın ve süpernatantı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. DNA içeriğini, üreticinin talimatlarına göre ticari bir DNA ekstraksiyon kiti ile test edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Vaskülarize domuz fleplerini desellülarize etmek için kullanılan bu protokol, özelleştirilmiş bir perfüzyon biyoreaktöründe flep vaskülatürü yoluyla iyonik bazlı bir deterjan olan SDS'nin perfüzyonuna dayanır. Desellülarizasyondan önce, bir domuz modelinde üç vaskülarize flep tedarik edildi ve ana tedarik damarlarına göre kanüle edildi. Flepler, başarılı bir desellülarizasyona izin vermek için patentli, perfüze edilebilir bir vaskülatürü korumak için tedarikten hemen sonra yıkandı. Hav...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Önerilen protokol, bir dizi domuz kaynaklı flebi hücresellikten arındırmak için düşük konsantrasyonlu SDS'nin perfüzyonunu kullanır. Bu prosedürle, asellüler omentum, tensör fasya lata ve radyal önkol flepleri, düşük konsantrasyonlu SDS'yi destekleyen bir protokol kullanılarak başarılı bir şekilde hücreselden arındırılabilir. Ön optimizasyon deneyleri, 2 gün ila 5 gün arasında düşük konsantrasyonda (%0.05) SDS'nin, histolojik tekniklerle analiz edildiğinde omentum, tensör fasyası lata...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm pore Acrodisk Filter	VWR	CA28143-310
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)	Baxter	JF7123
20 L Polypropylene Carboy	Cole-Parmer	RK-62507-20
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie	Covidien	LS639
3-way Stopcock	Cole-Parmer	UZ-30600-04
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X	Wisent	450-115-EL
Atropine Sulphate 15 mg/30ml	Rafter 8 Products	238481
BD Angiocath 20-Gauge	VWR	BD381134
BD Angiocath 22-Gauge	VWR	BD381123
BD Angiocath 24-Gauge	VWR	BD381112
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901	DNAse Co-factor
DNase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)	Invitrogen	P7589
DPBS, 10X	Wisent	311-415-CL	without Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	13008-12
Heparin, 1000 I.U./mL	Leo Pharma A/S	453811
Ketamine Hydrochloride  5000 mg/50 ml	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	612316
Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing	Cole-Parmer	RK-96450-40	Internal Diameter:  1.85 mm
Ismatec REGLO 4-Channel Pump	Cole-Parmer	78001-78
Ismatec Tubing Cassettes	Cole-Parmer	RK-78016-98
Isoflurane 99.9%, 250 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2231929
LB Agar Lennox	Bioshop Canada	LBL406.500	Sterility testing agar plates
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	DNAse Co-factor
Masterflex L/S 16 Tubing	Cole-Parmer	RK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2242905
Monopolar Cautery Pencil	Valleylab	E2100
Normal Buffered Formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
N°11 scalpel blade	Swann Morton	303
Papain from papaya latex	Sigma-Aldrich	P3125
Peracetic Acid	Sigma-Aldrich	269336
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID	McMaster-Carr	5117K61
Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors	McMaster-Carr	5117K76
Plastic Quick-Turn Tube Plugs	McMaster-Carr	51525K143	Male Luer
Plastic Quick-Turn Tube Sockets	McMaster-Carr	51525K293	Female Luer
Punch Biopsy Tool	Integra Miltex	3332
Potassium Chloride 40 mEq/20 ml	Hospira Healthcare Corporation	37869
Povidone-Iodine, 10%	Rougier	833133
Serological Pipet, 2mL	Fisher Science	13-678-27D
Snap Lid Airtight Containers	SnapLock	142-3941-4
Sodium Dodecyl Sulfate Powder	Sigma-Aldrich	L4509
Surgical Metal Ligation Clips, Small	Teleflex	001200
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight	B. Braun	BC004R
TruWave Pressure Monitoring Set	Edwards Lifesciences	PX260