Peel-Blot Tekniği: Tek Katmanları Çok Katmanlı veya Konsantre Biyolojik Numunelerden Ayırmak için Bir Cryo-EM Numune Hazırlama Yöntemi

Özet

Soyma-leke tekniği, kalınlığı azaltmak, numune konsantrasyonunu artırmak ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için çok katmanlı ve konsantre biyolojik numunelerin tek katmanlara ayrılmasını sağlayan bir kriyo-EM ızgara hazırlama yöntemidir.

Özet

Soyulmuş leke kriyo-EM ızgara hazırlama tekniği, çok katmanlı numunelerin katmanlarında bir azalma sağlamak amacıyla önemli ölçüde modifiye edilmiş bir geri enjeksiyon yöntemidir. Dalma donmasından önce katmanların bu şekilde çıkarılması, numune kalınlığının kriyo-EM veri toplama için uygun bir seviyeye düşürülmesine, numune düzlüğünün iyileştirilmesine ve görüntü işlemenin kolaylaştırılmasına yardımcı olabilir. Soyma lekesi tekniği, çok katmanlı membranların tek katmanlara, katmanlı 2D kristallerin tek kristallere ve çözünür proteinlerin istiflenmiş, tabaka benzeri yapılarının da aynı şekilde tek katmanlara ayrılmasına izin verir. Bu tür numunelerin yüksek numune kalınlığı, özellikle mikroskop aşamasının veri toplama için eğilmesi gerektiğinde, kriyo-EM veri toplama ve kriyo-EM görüntü işleme için sıklıkla aşılmaz sorunlar ortaya çıkarmaktadır. Ayrıca, bu numunelerden herhangi birinin yüksek konsantrasyonlu ızgaraları, ızgara hazırlamadan önce numune konsantrasyonu artırılabildiğinden ve soyma lekesi tekniği, tek katmanlı numunenin yoğun bir dağılımına neden olacak şekilde ayarlanabildiğinden, verimli veri toplama için hazırlanabilir.

Giriş

Soyma lekesi tekniği, kriyo-EM 2D ve 3D veri toplama için uygun derecede ince numuneler elde etmek ve görüntü işlemeyi kolaylaştırmak için istiflenmiş iki boyutlu membran proteinleri kristallerini tek katmanlara ayırmak için geliştirilmiştir¹. Protokol, diğer çok katmanlı numune tipleri için ve ayrıca Z'deki kalınlığı arttırmadan ızgarada her iki numune tipinin de yüksek numune konsantrasyonlarına ulaşmak için benzer şekilde uygundur.

Numune katmanlarının bir katmana indirgenmesi, kılcal basınç ve kesme kuvvetlerinin bir kombinasyonunun, geri enjeksiyon yöntemi^2'yi önemli ölçüde genişleten ve değiştiren bir protokolde uygulanmasıyla elde edilir. İlk lekeleme adımı, geri enjeksiyon yöntemindeki 20-25μm filtre kağıdı gözenek boyutu yerine mikron altı üzerinde lekeleme sırasında sıkı sandviçleme ve karbon filme ve çok katmanlı numunenin her iki tarafında bir ızgara çubuğuna yapışma ile sonuçlanır. Tek bir tabakanın ayrılması veya soyulması, ızgara bir trehaloz damlasına dikey olarak bastırıldıktan sonra sandviçlenmiş tabakaların ayrılmasının zorlanması üzerine gerçekleşir ve karbon filmi ızgara çubuğundan uzaklaştırır (Şekil 1). Karbon filmin ızgara çubuğu ile orijinal temas noktasından uzağa yeniden konumlandırılması, ızgara bir kez daha mikron altı filtre kağıdı üzerinde lekelendiğinde bir sonraki adımda gerçekleşir. Bu adımların yineleme sayısı belirli örnekler için en iyi duruma getirilebilir. Ayrıca, protokol, Z'de agregasyondan kaçınırken numune konsantrasyonlarını arttırmak için kullanılabilir. ızgara çubuğuna ve karbon filme yapışmanın yanı sıra güçlü ayırmaya bağlı olması nedeniyle, bu yaklaşım bazı hassas ve / veya kararsız proteinler ve protein kompleksleri gibi oldukça kırılgan moleküller için uygun olmayabilir.

Soyma lekesi tekniği ne özel ekipman ne de pahalı malzemeler gerektirir. Bununla birlikte, belirli numunelere uygulanabilirlik, biyolojik parametrelerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirecektir. Düzlüğü sağlamak için karbon filmi gerektiğinden, 2D kristaller için karar daha kolaydır, ancak soyma-leke tekniği ile manipülasyon, numunenin biyolojik bütünlüğünü veya kristalin sırasını etkileyebilir. Soyulma lekesi tekniğinin tek parçacıklara uygunluğu, karbon film gerektiren ve manipülasyona kararlı olanlarla sınırlıdır ve bunlar için test edilebilir. Katmanlar arasında kritik biyolojik etkileşime sahip örnekler, bu tür etkileşimlerin bozulması nedeniyle soyma-leke tekniği yardımıyla karakterizasyon için uygun olmayabilir.

Soyma-leke tekniği ("soyma-leke"), oda sıcaklığında TEM tarafından negatif lekeli veya lekesiz numunelerle test edilerek ve taranarak en hızlı şekilde optimize edilir. Optimum sayıda soyulma-leke yinelemesi belirlendikten sonra, vitrifikasyondan önce kalınlığı kontrol etme süresi belirlenebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Peel-blot tekniği için hazırlık adımları

NOT: Hazırlık, aşağıdaki öğelerin birbirine bitişik olarak yerleştirilmesini gerektirir.

1. İki parça 20-25 μm gözenek boyutunda filtre kağıdı istifleyin (bkz.
2. Filtre kağıdının bitişiğine, kağıt yukarı bakacak şekilde ~8 cm x 10 cm uzunluğunda bir parafin film yerleştirin.
3. İki adet #4 filtre kağıdının üzerine bir parça mikron altı filtre kağıdı yerleştirin (Şekil 1-1).
4. Anti-kılcal forsepsleri, bükülmüş bacak yukarı bakacak ve düz bacak aşağı bakacak şekilde konumlandırın. Ardından, pürüzsüz/parlak tarafı yukarı bakacak şekilde 600 mesh ızgara seçin. Forsepsleri, temiz ızgaranın diğer öğelerle temasını önlemek için bir Petri kabına veya başka bir yükseltilmiş yüzeye yerleştirin.
5. Kağıdı parafin filmden çıkarın ve küçük bir jant oluşturmak için kenarları (~ 5 mm) çekin. Pipet, parafin filmin kısa bir tarafından ~1-2 cm ve parafin filminde ~1 cm arayla% 4 trehaloz çözeltisinin iki 150 μL damlasıdır.
6. Ayrı bir tezgahta veya zeminde, küçük bir polistiren köpük kaba sıvı azot dökün (bkz.
   DİKKAT: Donma ısırmasını önlemek için eldiven ve yüz siperliği kullanarak doğru kullanım için eğitim alın.
7. Sıvı azotun içine küçük bir kriyo-EM ızgara kabı yerleştirin ve polistiren köpük kabı tüy bırakmayan mendillerle örtün.

2. Karbon filmin ızgaraya yerleştirilmesi

1. Trehaloz çözeltisinin damlalarından birinde mikanın bir tarafına aşağı doğru hafif bir açıyla (~ 20 ° -40 °) dokunarak karbon filmini mikadan yüzdürmek için Dumont #5 forseps kullanın (bkz. Karbon film damlacığın yüzeyinde yüzdükten sonra mikayı serbest bırakın.
2. Kırık şeklinde hasarlı karbon kullanmaktan kaçınmak için karbon filmi görsel olarak inceleyin.
3. Anti-kılcal forseps tarafından bir açıyla (~ 20 ° -30 °) tutulan ızgarayı, karbon filme bitişik bir konumda bir trehaloz damlasına yerleştirin ve ardından karbon filmin altında ortalayın. Karbon filmi alın (Şekil 1-2).
4. Izgarayı aynı yönde tutun ve ızgaranın kenarını kaba tarafa sarmış olabilecek gereksiz karbon filmi çıkarmak için damlanın yüzey gerilimini kırmadan ikinci trehaloz damlasının yüzeyine yavaşça indirin.

3. Çok katmanlı 2D kristallerin tek katmanlara ayrılması

1. Anti-kılcal forsepsleri döndürün (bakınız Malzeme Tablosu) ve ızgaranın karbon tarafı aşağı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 1-3).
2. Pipetten 1.3 μL'lik numune ızgaranın üstündeki hafif trehaloz menisküsün içine alınır. Trehaloz ve numuneyi ızgaranın her iki tarafına karıştırmak ve dağıtmak için çözeltiyi ~ 8-10 kez pipetleyin.
3. Çözeltiyi 1 dakika boyunca inkübe ederken, pipet parafin filmine bir veya daha fazla 1.7 μL trehaloz çözeltisi damlatın.
4. Karbon filmi yukarı bakacak şekilde ızgarayı orijinal konumuna geri döndürün.
5. Izgarayı mikron altı filtre kağıdına bastırmak için kılcal forseps kullanın (Şekil 1-4). Çözelti filtre kağıdı tarafından emildikten ve karbon film düz durduğunda, ızgarayı kaldırmadan ve dikey olarak 1.7 μL trehaloz çözeltisi damlasına hareket ettirmeden önce 3 saniye bekleyin (Şekil 1-5).
   NOT: Yüksek oranda yığılmış numuneler için bu adımı birden çok kez yineleyin veya sonraki adımlarda kılavuz vitrifikasyon için hazırlanır.
6. Izgarayı iki filtre kağıdı parçası üzerine dökün ve ardından ızgarayı filtre kağıdından kaldırın (Şekil 1-6). Yaklaşık 13 sn sonra, neme ve numune tamponuna bağlı olarak, ızgarayı küçük strafor kaptaki sıvı azota daldırın ve ızgarayı kriyo-EM ızgara kabına yerleştirin veya kriyo-EM taraması veya veri toplama için doğrudan aktarın.
   NOT: Protokolü hızlı bir şekilde optimize etmek için, soyulmuş lekeli ızgarayı sıvı azota batırmak yerine bu adımda negatif olarak lekeleyin. Izgaraya 3 μL% 1 uranil asetat uygulayarak numuneyi negatif olarak lekeleyin, ızgarayı 30 s boyunca inkübe edin ve yırtık bir parça 20-25 μm gözenek boyutunda filtre kağıdı ile lekeleyin. Trehaloz, tanen veya glikozda vitrifiye edilen 2D kristallerin ızgaraları, trehaloz, tanen ve glikoz, elle daldırma² için kullanılan oranlarda kristalin buz oluşumunu önlediğinden, vitrifikasyon için rutin olarak elle daldırılır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Başarılı bir soyma lekesi deneyi, genellikle yüksek konsantrasyonlarda tek bir numune katmanı ile sonuçlanacaktır. Çoğu ızgara karesindeki bazı bölgelerin, özellikle soyulma lekesi adımlarının daha az sayıda yinelemesinde, hala birden fazla katman içermesi beklenir. Bununla birlikte, ızgara karelerinin çoğunluğu, insan lökotrien_C4 sentazının (Şekil 2) ve lipozomların (adım 3.2, Şekil 3'te eklenmiştir) 2D kristalleri için...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Soyma lekesi, kriyo-EM veri toplama ve görüntü işleme için çok katmanlı 2D kristallerin ve benzeri numunelerin istiflenmesinin ve kalınlığının üstesinden gelmek için güçlü bir yöntemdir. Soyma lekesinin kullanımına ilişkin bir karar, numunenin biyolojik parametrelerine dayanacak ve ayrıca bir 3D kriyo-EM modeli mevcut olduğunda değerlendirme gerektirecektir. Temaslıların biyolojik önemi ve temas bölgelerinin potansiyel esnekliği bu değerlendirmede özellikle önemli olacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.