Aort Duvarındaki Biyomekanik Suşu Özetlemek İçin İnsan Aort Düz Kas Hücresi Organ-On-A-Chip Modelinin Yapımı

Özet

Burada, insan aort duvarındaki düz kas hücrelerinin in vivo biyomekanik suşunu çoğaltmak için bir insan aort düz kas hücresi organı-on-a-chip modeli geliştirdik.

Özet

İnsan torasik aort anevrizması ve diseksiyonu (TAAD) çalışmasında geleneksel iki boyutlu hücre kültürü teknikleri ve hayvan modelleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, insan TAAD bazen hayvan modelleri ile karakterize edilemez. Klinik insan çalışmaları ile hayvan deneyleri arasında, terapötik ilaçların keşfini engelleyebilecek belirgin bir tür boşluğu vardır. Buna karşılık, geleneksel hücre kültürü modeli in vivo biyomekanik uyaranları simüle edemez. Bu amaçla, mikrofabrikasyon ve mikroakışkan teknikler son yıllarda büyük ölçüde gelişmiş ve biyomekanik mikro çevreyi kopyalayan çip üzerinde organoidler modelleri oluşturmak için yeni teknikler sağlamıştır. Bu çalışmada, TAAD'da hayati bir rol oynayan insan aort düz kas hücrelerinin (HASMC'ler) yaşadığı siklik suşun genliği ve sıklığı da dahil olmak üzere aort biyomekaniğinin patofizyolojik parametrelerini simüle etmek için bir insan aort düz kas hücresi organı-on-a-chip (HASMC-OOC) modeli geliştirilmiştir. Bu modelde, HASMC'lerin morfolojisi şekil olarak uzamış, gerinim yönüne dik olarak hizalanmış ve gerinim koşulları altında statik konvansiyonel koşullara göre daha kasılı bir fenotip sunmuştur. Bu, doğal insan aort duvarlarındaki hücre oryantasyonu ve fenotipi ile tutarlıydı. Ek olarak, biküspid aort kapağı ile ilişkili TAAD (BAV-TAAD) ve triküspid aort kapağı ile ilişkili TAAD (TAV-TAAD) hasta kaynaklı primer HASMC'leri kullanarak, TAAD'da HASMC özelliklerini kopyalayan BAV-TAAD ve TAV-TAAD hastalık modellerini kurduk. HASMC-OOC modeli, TAAD'ın patogenezini daha fazla araştırmak ve terapötik hedefleri keşfetmek için hayvan modellerini tamamlayan yeni bir in vitro platform sunmaktadır.

Giriş

Torasik aort anevrizması ve diseksiyonu (TAAD), yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkili olan aort duvarının lokalize dilatasyonu veya delaminasyonudur¹. İnsan aort düz kas hücreleri (HASMC'ler) TAAD'ın patogenezinde hayati bir rol oynamaktadır. HASMC'ler ölümcül olarak farklılaşmış hücreler değildir ve HASMC'ler yüksek plastisiteyi koruyarak farklı uyaranlara yanıt olarak fenotipleri değiştirmelerine izin verir². HASMC'ler esas olarak in vivo ritmik gerilme suşuna maruz kalırlar ve bu düz kas morfolojik değişikliklerini, farklılaşmasını ve fizyolojik fonksiyonlarını düzenleyen anahtar faktörlerden biridir ^3,4. Bu nedenle, HASMC'lerin çalışmasında siklik suşun rolü göz ardı edilemez. Bununla birlikte, geleneksel 2D hücre kültürleri, HASMC'lerin in vivo olarak yaşadığı siklik suşun biyomekanik stimülasyonunu çoğaltamaz. Ek olarak, bir hayvan TAAD modelinin yapımı, biküspid aort kapağı (BAV) ile ilişkili TAAD gibi bazı TAAD türleri için uygun değildir. Dahası, klinik insan çalışmaları ile hayvan deneyleri arasındaki tür farkı göz ardı edilemez. Klinik pratikte farmasötik translasyonu engellemektedir. Bu nedenle, aort hastalıklarının araştırılmasında in vivo biyomekanik ortamı simüle etmek için daha karmaşık ve fizyolojik sistemlere acil bir ihtiyaç vardır.

Biyomedikal araştırma ve ilaç geliştirmede kullanılan hayvan deneyleri maliyetli, zaman alıcı ve etik olarak sorgulanabilir. Ek olarak, hayvan çalışmalarından elde edilen sonuçlar sıklıkla insan klinik çalışmalarında elde edilen sonuçları tahmin edememektedir ^5,6. İnsan preklinik modellerinin eksikliği ve klinik çalışmalardaki yüksek başarısızlık oranı, klinik için az sayıda etkili ilaçla sonuçlanmış ve bu da sağlık bakım maliyetlerini artırmıştır⁷. Bu nedenle, hayvan modellerini tamamlamak için başka deneysel modeller bulmak acildir. Mikrofabrikasyon ve mikroakışkan teknikler son yıllarda büyük ölçüde gelişmiştir ve geleneksel 2D hücre kültürü tekniklerinin dezavantajlarını gideren ve fizyolojik çalışmalar ve ilaç geliştirme için daha gerçekçi, düşük maliyetli ve verimli bir in vitro model oluşturan çip üzerinde organoidler modelleri oluşturmak için yeni teknikler sağlamıştır. Mikroakışkan cihazlar kullanılarak, bir doku veya organın temel işlevlerini çoğaltmak için farklı uyaranlara sahip mikrometre büyüklüğündeki odalarda canlı hücreleri kültürlemek için çip üzerindeki organlar kurulur. Sistem, tek veya çoklu mikroakışkan mikrokanallardan oluşur; ya bir doku tipinin işlevlerini çoğaltan perfüze edilmiş bir odada kültürlenmiş bir tür hücre ya da farklı dokular arasındaki arayüzleri yeniden oluşturmak için gözenekli membranlar üzerinde kültürlenmiş farklı hücre tipleri. Hasta kaynaklı hücrelerle birleştirilen mikroakışkan bazlı organoidler, fare ve insan hastalığı modelleri arasındaki büyük tür farkını köprüleme ve hastalık mekanizması araştırması ve ilaç keşfi için geleneksel 2D hücre kültürünün dezavantajlarının üstesinden gelme konusunda benzersiz bir avantaja sahiptir. Son birkaç yılda mikroakışkanların hızlı bir şekilde gelişmesiyle birlikte, araştırmacılar kompleks in vivo biyolojik parametreleri kopyalayan in vitro çip üzerinde organ (OOC) modellerinin yararlılığını fark etmişlerdir⁸. Bu mikroakışkan organoidler, siklik gerinim, kesme gerilmesi ve sıvı basıncı gibi in vitro biyomekanik ortamları simüle ederek üç boyutlu (3B) bir hücre kültürü ortamı sağlar. Bugüne kadar, akciğer⁹, böbrek 10^{, karaciğer 11}, bağırsak¹² ve kalp¹³ gibi organlarda biyomekanik uyaranları simüle etmek için çeşitli OOC modelleri kurulmuştur^, ancak bunlar insan aort hastalığının incelenmesine yaygın olarak uygulanmamıştır.

Bu çalışmada, TAAD hasta kaynaklı primer HASMC'lere uygulanan biyomimetik mekanik kuvvetleri ve ritimleri kontrol edebilen bir insan aort düz kas hücre organı-on-a-chip (HASMC-OOC) modeli sunulmuştur. Çip, kanallarla kazınmış üç katmanlı kalın polidimetilsiloksan (PDMS) plakalarından ve ticarileştirilmiş iki yüksek esnekliğe sahip PDMS membranından oluşur. HASMC'ler PDMS membranları üzerinde kültürlenir. Çipin ortasındaki kanal, hücre kültürü için bir kültür ortamı ile doldurulur. Çipin üst ve alt kanalları, PDMS membranlarının mekanik çekme geriniminin ritmini ve frekansını kontrol edebilen bir vakum basıncı besleme sistemine bağlanır. HASMC'lerin yaşadığı ritmik gerinim, HASMC-OOC'de simüle edilebilir ve geleneksel 2D kültür sistemleriyle işlevsel olarak elde edilemeyen doku veya organın biyomekanik mikro ortamını çoğaltır. Yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görüntüleme ve biyomekanik mikroçevre avantajı ile canlı hücrelerin biyokimyasal, genetik ve metabolik aktiviteleri doku gelişimi, organ fizyolojisi, hastalık etiyolojisi, moleküler mekanizmalar ve biyobelirteç tanımlama, kardiyovasküler hastalık ve aort hastalığı açısından incelenebilir. Dokuya özgü ve hasta hücreleri ile birleştirilen bu sistem, ilaç taraması, kişiselleştirilmiş tıp ve toksisite testi için kullanılabilir. Bu HASMC-OOC modeli, aort hastalığının patogenezini incelemek için yeni bir in vitro platform sunmaktadır.

Protokol

İnsan aort örnekleri, Zhongshan Hastanesi, Fudan Üniversitesi Etik Komitesi'nin onayı altında birincil HASMC izolasyonu için kullanılmıştır (NO. B2020-158). Fudan Üniversitesi, Zhongshan Hastanesi'nde asendan aort cerrahisi geçiren hastalardan aort örnekleri toplandı. Katılım öncesinde tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Birincil insan aort düz kas hücresi izolasyonu

1. Yükselen aortun sağ lateral bölgesini steril PBS, 1x-2x ile yıkayın.
2. Dokunun intima ve adventitia katmanlarını iki oftalmik forseps ile çıkarın ve hücreleri toplamak için medya tabakasını koruyun.
3. Medya tabakasını 10 cm'lik bir kültür kabına yerleştirin ve makasla küçük parçalara (2-3 mm) kesin. % 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren 5 mL düz kas hücre kültürü ortamı (SMCM) ekleyin.
4. Küçük dokuyu steril bir damlalıkla kültür şişesine taşıyın ve dokuyu eşit şekilde yayın. Kültür ortamını mümkün olduğunca atın, ardından şişeyi baş aşağı çevirin.
5. Ters çevrilmiş kültür şişesine 2 mL SMCM ekleyin ve 1-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübatöre (% 5 CO 2) yerleştirin, ardından yavaşça sağa doğru çevirin ve₂ mL SMCM daha ekleyin.
6. 5-7 günlük inkübasyondan sonra, SMCM'yi 4 mL taze SMCM ile değiştirin. Genel olarak, sporadik düz kas hücreleri yaklaşık 2 hafta içinde dışarı çıkar.
7. SMCM'yi yavaşça atın ve ortamı değiştirirken yavaşça ekleyin. Bir mikroskop istasyonuna giderken kültür şişesini yavaşça taşıyın; aksi takdirde, dokular yüzer ve hücreler yavaşça büyür.
8. Hücreler yaklaşık% 80 akıcılığa ulaştığında, 2 mL PBS ile yıkayın, 2 mL% 0.25 tripsin ile sindirin ve bunları 4 mL taze SMCM ile iki yeni kültür şişesine bölün.
9. Düz kas hücreleri için dört farklı spesifik belirtecin immünofloresan analizi yoluyla hücreleri tanımlayın (CNN1, SM22)¹⁴.

2. PDMS çipinin hazırlanması

1. PDMS'yi polimerize etmek için, baza (A bileşeni) A: B = 10: 1 w / w ağırlık oranında kürleme maddesi (B bileşeni) ekleyin ve kompleksi 5 dakika boyunca tamamen karıştırın; hacim çalışmanın ihtiyacına bağlıdır.
2. Hazırlanan PDMS jelini 30-60 dakika boyunca bir vakum ekstraksiyon tankına yerleştirin ve basıncı -0,8 mPa'nın altında tutun.
   NOT: Yüksek basınç, PDMS jeli içindeki küçük kabarcıkların yetersiz ekstraksiyonuna yol açacak ve bu da talaş üretiminin bir sonraki adımını etkileyecektir.
3. Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımını kullanarak, kalıbı 100 mm × 40 mm × 8 mm dış çerçeve yapısı ve 70 mm × 6 mm × 4 mm kanal ile tasarlayın.
4. Özel, yüksek hassasiyetli bir bilgisayar sayısal kontrol gravür makinesi kullanarak üç katmanın kalıplarını yapın. Polimetil metakrilat (PMMA) plakaları kullanarak kalıpların ve mikro kanalların çerçevesini oyun ve ardından bunları başka bir PMMA plakasına yapıştırın.
5. Hazırlanan PDMS jelini 100 mm × 40 mm × 6 mm dış çerçeveye ve 70 mm × 6 mm × 4 mm kanala sahip bir kalıba dökün ve ardından 1-2 saat boyunca 70 °C'de çapraz bağlayın.
6. Çapraz bağlı PDMS plakalarını kalıptan çıkarın ve ticarileştirilmiş PDMS membranlarını 100 mm × 40 mm kesitler halinde kesin.
7. PDMS yüzey aktivasyonu için hazırlanan üç PDMS levhasını ve iki PDMS membranını 5 dakika boyunca oksijen plazma ile tedavi edin. Aşağıdaki özel ayarları uygulayın: proses gazı olarak oda havası; basınç -100 kPa'ya ayarlanmış; akım 180--200 Ma olarak ayarlanmış; voltaj 200 V'a ayarlanmış; işlem süresi 5 dakikaya kadardır.
8. PDMS çipi üzerindeki hava ve orta mikro kanalların giriş ve çıkışını yapmak için 1 mm'lik bir delik delici kullanarak üç PDMS plakası üzerindeki delikleri delin.
9. Üç PDMS levhayı ve iki PDMS membranını sırayla birbirine bağlayın: hava kanalı PDMS levha (üst katman) - PDMS membran - orta kanallı PDMS levha (orta katman) - PDMS membran - hava kanalı PDMS levha (alt katman). Hava mikro kanallarını orta mikrokanallarla tamamen üst üste bindirmek için bu adımı stereoskopik mikroskop altında 4x'te gerçekleştirin.
10. Monte edilen PDMS çipini 1 saat boyunca 70 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
11. Birkaç adet 1 mm iç çap ve 3 cm uzunluğunda lateks hortum hazırlayın. Hazırlanan hortumun bir ucuna 1 mm dış çap ve 1 cm uzunluğunda paslanmaz çelik bir iğne yerleştirin ve ardından PDMS çipinin havasına ve orta mikro kanallarına bağlı tüpü oluşturmak için hortumun diğer ucuna bir Luer yerleştirin.
12. Hazırlanan tüpleri PDMS çipi üzerindeki hava ve orta mikro kanalların çıkışlarına ve girişlerine yerleştirin.

3. PDMS çip yüzey işleme ve sterilizasyon

1. 2 mL'lik bir şırınga kullanarak PDMS çipinin orta mikro kanalına 2 mL 80 mg/mL fare kolajeni enjekte edin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
2. Kuluçkadan sonra, kollajeni kanaldan çıkarın ve 2 mL'lik bir şırınga ile hatırlayın. Kollajen kaplı PDMS yongalarını gece boyunca 60 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
3. PDMS yongalarını UV sterilizatörüne 1 saatten fazla yerleştirin. Sterilize edilmiş PDMS çiplerini, hücre deneyine hazırlık olarak ultra temiz bir tezgaha yerleştirin.

4. PDMS çipi üzerinde hücre tohumlama ve hücre germe işlemi

1. Kültür 4 x 10³⁷ ° C'de% 5 CO₂ inkübatöründe% 2 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren düz kas hücresi ortamı (SMCM) kullanan hastalardan 5 primer insan düz kas hücresi hücresi hücresi (HASMC'ler).
2. HASMC yoğunluğu% 80'e ulaştığında, SMCM'yi atın ve hücreleri 2 mL PBS ile yıkayın.
3. Hücreleri 2 dakika boyunca 1 mL% 0.25 tripsin kullanarak ve 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj kullanarak sindirin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 1 mL taze SMCM'de yeniden askıya alın. Hücreleri 10 cm'lik bir kültür kabı üzerinde kültürlemek için 8 mL SMCM kullanın.
4. Bir sitometre kullanarak hücre sayısını hesaplayın ve hücreleri 2 x 10⁵ hücre / mL'lik son konsantrasyonda kullanın.
5. Kollajen kaplı ve sterilize edilmiş PDMS çip ortamı mikro kanalına yavaşça 2 mL PBS dökün ve daha sonra 2 mL'lik bir şırınga kullanarak atın.
6. 2 mL'lik bir şırınga kullanarak PDMS çipinin orta mikrokanalına toplam 2 mL 2 x 10⁵ hücre/mL HASMC süspansiyonunu yavaşça dökün. Ardından, PDMS yongasının giriş ve çıkışındaki Luer'i kapatın. PDMS çipini 1 gün boyunca 37 °C'de bir inkübatöre (%5 CO₂) yerleştirin.
7. Hücreler PDMS çipindeki PDMS membranına bağlandıktan sonra, yaklaşık 24 saat sonra, PDMS çipi üzerindeki hava mikrokanalının çıkışını vakum kontrol sistemine bağlayın. Hücre bağlandığında, mikroskop altında, asılı yuvarlak hücrelerle tezat oluşturan uzun, normal bir hücresel form görülebilir.
8. Solenoid valfi ve vakum pompasını açın. Vakum regülatörünü açın ve basınç seviyesini 7,18 ±% 0,44 gerinim için 10 kPa'ya ve 17,28 ±% 0,91 gerinim için 15 kPa'ya ayarlayın.
9. Kontrol sisteminin parametreleri ayarlandıktan sonra, PDMS yongalarını 37 ° C'de bir inkübatöre (% 5 CO₂) yerleştirin ve 24 saat boyunca gerin.

5. Mekanik kontrol sisteminin hazırlanması

1. Birkaç solenoid valf, vakum filtreleri, vakum regülatörleri, bir vakum pompası, bir peristaltik pompa ve solenoid valfi kontrol eden programlanabilir bir mantık kontrolörü (PLC) hazırlayın.
2. PLC kontrolörünü programlayın ve açma/kapama zaman aralığını 1 Hz'e ayarlayın.
3. Vakum pompasının girişini vakum filtrelerine bağlayın ve ardından vakum filtrelerinin çıkışını vakum regülatörlerine bağlayın. Vakum regülatörlerinin çıkışını solenoid valflere bağlayın ve son olarak, solenoid valflerin çıkışını PDMS yongalarının hava mikrokanallarının çıkışlarına bağlayın.
4. Kültür ortamı değişimi ve ilaç kullanımı için peristaltik pompanın çıkışını PDMS çipinin orta mikrokanalının girişine ve peristaltik pompanın girişini orta mikrokanal PDMS çipinin çıkışına bağlayın.
5. Gerinimin genliğini regülatör tarafından ve gerinim frekansını mikrodenetleyici ile ayarlayın.

Sonuçlar

HASMC-OOC modeli, bir vakum kontrol sistemi, bir dolaşım sistemi ve PDMS yongalarından ve HASMC-OOC modelinin şematik tasarımından oluşur (Şekil 1). Vakum kontrol sistemi bir vakum pompası, solenoid valfler ve bir PLC kontrolöründen oluşur. Dolaşım sistemi olarak hareket etmek için, hücre kültürü ortamını yenilemek ve ilaç eklemek için peristaltik bir pompa kullanıldı. PDMS çipi, hücre büyümesi için iki vakum odasından ve SMCM ile doldurulmuş bir orta odadan o...

Tartışmalar

Mikroakışkan teknolojisinin hızla gelişmesiyle birlikte, biyoloji, tıp ve farmakoloji uygulamaları için son yıllarda bir veya daha fazla organın biyolojik fonksiyonunu ve yapısını in vitro olarak kopyalayabilen OOC modelleri ortaya çıkmıştır¹⁵. OOC, hastalık mekanizmalarını araştırmak ve klinik öncesi ilaç translasyonunu teşvik etmek için gerekli olan insan fizyolojik mikro çevresinin temel işlevlerini simüle edebilir ^8,16

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0099-100ml	Used for cell immobilization
Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0408	Antibodies used for immunostaining
Bovine serum albumin	Beyotime	ST025-20g
Calcium AM/PI	Invitrogen	L3224
Cell culture flask	Corning	430639
CNN1	Abcam	Ab46794
Commercial flexible PDMS membrane	Hangzhou Bald Advanced Materials	KYQ-200
F-actin	Invitrogen	R415
FBS	Sigma	M8318
Hoses	Runze Fluid	96410	1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com
Human aortic smooth muscle cell line CRL1999	ATCC	Lot Number:70019189
Image J	Imagej.net/fiji/downloads	Free Download: https://fiji.sc	Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity
Incubator	Thermo Fisher Scientific		Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment.
Luer	Runze Fluid	RH-M016	Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.
Microscope	Olympus
mouse collagen	Sigma	C7661
Oxygen plasma	Changzhou Hongming Instrument	HM-Plasma5L
Pasteur pipette	Biologix	30-0138A1
PBS	Beyotime	C0221A
Pen-Strep	Sigma	P4458-100ml	Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture.
peristaltic pump	Kamoer	F01A-STP-B046
Petri dish	Corning	430167
PLC controller	Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory	BR010-11T8X2M	The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net
polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
SM22	Abcam	ab14106
SMCM	ScienCell	Cat 1101
solenoid valve	SMC (China)	VQZ300
Syringe	Becton,Dickinson and Company	300841
Triton-X 100	Beyotime	ST795	To penetrate cell membranes
Trizol	Invitrogen	10296010	Used for RNA extraction
trypsin	Sigma	15400054
vacuum filter	SMC (China)	ZFC5-6	Official website address: https://www.smc.com.cn
vacuum pump	Kamoer	KVP15-KL-S
vacuum regulator	AirTAC	GVR-200-06
Primers
Primer Name	Forward (5’ to 3’)	Reverse (5’ to 3’)
SM22	CCGTGGAGATCCCAACTGG	CCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1	CTCCATTGACTCGAACGACTC	CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA