Nakavt farelerde kardiyak onarım ve yeniden şekillenmeyi incelemek için deneysel bir miyokard enfarktüsü modeli

Özet

Burada, deneysel bir miyokard enfarktüsü modelini, kardiyak yeniden şekillenme ve fonksiyonu incelemek için bir ekokardiyografi prosedürünü ve pikrosirius kırmızı lekeli ve rodamin lekeli bölümlerde fibroz ve hipertrofiyi ölçme prosedürlerini ve ayrıca Masson'un trikrom ile boyanmış dilimlerde enfarktüs boyutunu ve genleşme indeksini açıklıyoruz.

Özet

Kardiyovasküler hastalık, Batı ülkelerinde en yaygın ölüm nedenidir ve akut miyokard enfarktüsü (MI) en yaygın formdur. Bu makale, galektin 3'ün (Gal-3) bir deney hayvanı MI modelinde kardiyak iyileşmenin zamansal evrimi ve yeniden şekillenmesindeki rolünü incelemek için bir protokolü açıklamaktadır.

Açıklanan prosedürler arasında, erkek C57BL / 6J (kontrol) ve Gal-3 nakavt (KO) farelerinde kalıcı bir koroner ligatür ile deneysel bir MI modeli, in vivo kardiyak yeniden şekillenme ve sistolik fonksiyonu incelemek için bir ekokardiyografi prosedürü, enine kesit alanı (MCSA) ile miyosit hipertrofisinin incelenmesi için pikrosirius kırmızı lekeli ve rodamin konjuge lektin lekeli kesitler ile interstisyel miyokard fibrozunun histolojik bir değerlendirmesi, ve Masson'un trikrom ve trifenil tetrazolyum klorür ile boyanmış dilimlerde planimetri ile enfarktüs boyutunun ve kardiyak yeniden şekillenmenin (yara inceli, septum kalınlığı ve genleşme indeksi) nicelleştirilmesi. Dört-3 MI'lı KO fareleri, kardiyak yeniden şekillenme bozukluğu ve yara izi incelme oranında ve genişleme indeksinde bir artış gösterdi. MI'nın başlangıcında, miyokard fonksiyonu ve kardiyak yeniden şekillenme de ciddi şekilde etkilendi. MI'dan 4 hafta sonra, enfarktüslü Gal-3 KO farelerinde fibrozun doğal evrimi de etkilenmiştir.

Özetle, MI'nın deneysel modeli, Gal-3 ve diğer hayvan modellerinin genetik delesyonu ile farelerde kardiyak onarımın ve yeniden şekillenmenin zamansal evrimini incelemek için uygun bir modeldir. Gal-3 eksikliği, kardiyak onarımın dinamiklerini etkiler ve MI'dan sonra kardiyak yeniden şekillenme ve fonksiyonun evrimini bozar.

Giriş

Miyokard enfarktüsü (MI), kardiyovasküler hastalıkların en yaygın şeklidir. MI'dan sonra miyokard, MI enfarktüs bölgesinin iyileşmesi, ventriküler yeniden şekillenme (VR) ve miyokard disfonksiyonu¹ dahil olmak üzere seri morfolojik ve fonksiyonel değişikliklere uğrar. MI'nın iyileşmesi, fibrotik bir skar oluşumu ile sonuçlanan derin inflamatuar infiltrasyon ile ilişkili dinamik ve iyi düzenlenmiş bir süreçtir ^2,3. Farelerde MI'nın deneysel modeli şu anda patolojik koşullar ^4,5 altında kardiyak yeniden şekillenmeyi incelemek için kullanılmaktadır ve kalıcı bir koroner ligatürü indüklemek için tekrarlanabilir ve etkili bir prosedür geliştirmek için kesin cerrahi protokolün farkındalığı esastır. Bu yöntem, MI'nın iyileşmesini ve sol ventrikül yeniden şekillenmesinin (LVR) zamansal evrimi ve MI ile ilişkili kardiyak disfonksiyondaki önemini incelemek için gereklidir.

Galektinler, hücre içi ligandlarda, zar reseptörlerinde ve hücre dışı glikoproteinlerde spesifik karbonhidratları tanıyan bir lektin grubudur. Galectin 3 (Gal-3), hücre yüzeyindeki glikokonjugatlardaki N- ve O-glikanların tanınması ve çapraz bağlanması yoluyla etki eden bu ailenin bir üyesidir ve bağışıklık sistemi^6'da yaygın olarak eksprese edilir. Önceki çalışmalar, Gal-3'ün kardiyovasküler hastalıklarda inflamasyon ve fibrozun düzenleyicisi olarak rolünü araştırmıştır 7,8,9,10,11,12. İyileşme sırasında inflamasyonun düzenleyici faktörlerini hedeflemek son derece önemlidir, çünkü inflamasyon yeniden şekillenmenin evrimini önemli ölçüde etkileyebilir, MI sonrası ventriküler yeniden şekillenmenin zamansal evrimini incelemek için bir protokol tanımlamayı amaçladık ve Gal-3'ün genetik mutasyonunun MI'da iyileşmenin zamansal evrimini nasıl değiştirdiğini ve farelerde kardiyak yeniden şekillenmeyi ve işlevi nasıl etkilediğini belirlemek için adımlar ve yöntemler.

Protokol

NOT: Bu protokolde açıklanan tüm deneyler, Buenos Aires Üniversitesi Hayvan Bakım ve Araştırma Komitesi (CICUAL) tarafından, Ulusal Araştırma Konseyi (ABD) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzunun Güncellenmesi Komitesi ile uyumlu olarak onaylanmıştır¹³. Deneyler için, ameliyat için daha iyi manipülasyona izin veren 30-35 g ağırlığında erkek, yaşa uygun C57BL / 6J ve Gal-3 KO fareleri (8-10 haftalık) kullanın. Hayvanların suya ve yiyeceğe erişmesine izin verin ad libitum. Gal-3 KO fareleri, kontrol C57BL / 6J fareleri ile aynı biyokaynak tesislerinde bir C57BL / 6J arka planı üzerinde yetiştirildi.

1. Cerrahi alan ve aletler

1. Ameliyata başlamadan önce ventilatörün bir güç kaynağına takılı olduğunu ve doğru çalıştığını doğrulayın. Yeterli anestezik solüsyon olduğunu onaylayın. Ameliyat günü kullanılacak hayvan sayısını hesaplayarak solüsyonu hazırlayın.
2. Paslanmaz makas, mikro makas, büyük ve küçük iğneler için iğne tutucular, ekartörler, ekstra keskin, kavisli forsepsler, tırtıklı forsepsler ve doku forsepsleri dahil olmak üzere tüm cerrahi aletlerin sterilize edildiğini onaylayın. Çalışma alanını %70 etanol ile temizleyin.
3. Herhangi bir olası kanamanın derhal koterizasyonu için küçük pamuk topları, çördükler ve gazlı bezlerin mevcudiyetini sağlayın.
4. Sol inen koroner arter (LDA) ligatürü için silikon kaplı, örgülü ipek dikişleri, toraks kapanışı için naylon iplikleri ve cildi kapatmak için keten ipliği hazır bulundurun.

2. Anestezi ve entübasyon

1. Anestezi dozunu belirlemek için fareleri tartın.
2. Strafor tabanla çevrili bir ısıtma yastığını 40 °C'ye kadar önceden ısıtın.
3. Ketamin (65 mg / kg), ksilazin (13 mg / kg) ve asepromazin (1.5 mg / kg) içeren bir çözeltinin vücut ağırlığının 0.1 mL / 10 g intramüsküler uygulaması ile fareleri uyuşturun.
4. Fare uyuşturulduktan sonra ve cerrahi işleme başlamadan önce, ayaklara parmaklarla bastırmak gibi hafif ağrılı bir uyaran indükleyerek anestezik derinliği kontrol edin. Hayvan uyarana cevap verirse, anestezik derinliği ayarlayın.
5. Fareyi dorsal dekübitusa yerleştirin ve bacaklarını ısıtma yastığının üzerindeki çalışma tabanına bantlayın ve dürbün stereo mikroskop altına yerleştirin. Çalışma tabanına bağlı maksiller dişleri tutan bir iplikle boynu aşırı uzatın.
6. Daha sonra, entübasyon kısmı için, trakea halkalarını boyundaki minimal bir kesiden açığa çıkarın ve daha önce tarif edildiği gibi 34-38 döngü / dk'lık bir solunum frekansında bir kemirgen ventilatörüne (tidal hacim: 250 mL / strok) bağlı 20 G'lik bir intravenöz kateter ile içinden kanal açın¹⁴.
7. Dördüncü veya beşinci interkostal boşlukta sol lateral torakotomiyi gerçekleştirmek için hayvanı lateral dekübite yerleştirin. Hayvanın derisinde bir kesi yapın; Aşağıdaki kasları gözlemleyin ve interkostal boşluğu net bir şekilde görmek için göğüs duvarından ayırmak için dikkatlice yayın. Bu noktada, hayvanın ventilatöre düzgün şekilde bağlandığından emin olun; Ardından, ekstra keskin forsepslerle bir delik açarak interkostal boşluğu açın.
   NOT: LDA, yukarıda belirtilen interkostal boşluklarda serbest sol ventrikül (LV) duvarı boyunca tanımlanabilir olmalıdır.
8. Perikardiyektomiyi gerçekleştirin ve koroner arterleri koroner venlerle ve sol kulak kepçesinin altındaki LDA dallanmasıyla karşılaştırarak LDA'yı tanımlayın. Ardından, 8-0'ı kullanarak LDA'nın ligatürünü gerçekleştirin. kulak kepçesinin kenarından ~ 2 mm ipek iplik. Son olarak, 6-0 ipek ipliği kullanarak göğüs kafesini katmanlar halinde kapatın - kaburgaları kapatın, içeride pnömotoraks olmadığından emin olun (bunu ventilatörle akciğerleri genişlemeye zorlayarak dikkatlice yapın) ve kaslara yaklaşın veya cildi kapatmadan önce onları dikin.
9. Cilt kapandıktan sonra, ventral dekübitte fareyi ventilatörden yavaşça ayırın ve solunum frekansı geri geldiğinde endotrakeal tüpü çıkarın. Hayvanın anesteziden sessiz bir ortamda ve tercihen 27 ° C'de sabit bir oda sıcaklığında iyileşmesine izin verin.
10. Hayvanların anesteziden sonra iyileşmesini, uzuvlarını hareket ettirmeye başlamasını ve normal solunum frekanslarının eski haline gelmesini bekleyin. Ardından, protokolün sonuna kadar onları ayrı kafeslerde tutun.
11. Aynı prosedürü kontrol veya sahte olarak çalıştırılan hayvanlar üzerinde de gerçekleştirin, ancak LDA'nın ligatürü olmadan.

3. Çalışma tasarımı

1. MI'dan sonra iyileşmenin ve ventriküler yeniden şekillenmenin zamansal evrimini test etmek için, fareleri aşağıdaki gruplara randomize edin:
   1. 1 haftalık MI evriminden sonra ventriküler yeniden şekillenmenin erken aşamasını incelemek için, fareleri aşağıdaki gruplara atayın: 1) C57 Sham (1 hafta); 2) Gal-3 KO Sham (1 hafta); 3) C57 MI (1 hafta); 4) Gal-3 KO MI (1 hafta).
   2. MI'nın 4 haftasında ventriküler yeniden şekillenmenin geç fazını incelemek için, fareleri aşağıdaki gruplara atayın: 5) C57 Sham (4 hafta); 6) Gal-3 KO Şam (4 hafta); 7) C57 MI (4 hafta); 8) Gal-3 KO MI (4 hafta).

4. Ekokardiyografi

NOT: Fare ekokardiyogramları için, duvar çaplarının ve boşluk boyutlarının uygun şekilde görselleştirilmesi için 10 MHz'in üzerindeki doğrusal dönüştürücüler kullanılmalıdır. Bu işlem anestezi altında 1.15 mL/kg intraperitoneal (IP) avertin ile veya bilinçli hayvanlarda yapılabilir. Bununla birlikte, ikincisi, manipülasyonun neden olduğu stres ve kaygı nedeniyle MI'lı farelerde kafa karıştırıcı sonuçlara yol açabilir.

1. Bir fareyi uyuşturmak için onu alın, sırtı avuç içine doğru tutun ve karın yüzeyine ulaşmak için ters çevirin. Bu pozisyonda, IP anestezisini hayvan ile deri altı iğne arasına 45 ° 'lik bir açıyla enjekte edin.
2. Fare uyuşturulduktan sonra, göğsünü tıraş edin ve fareyi dorsal dekübit pozisyonunda önceden ısıtılmış bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Parasternal uzun eksen ve kısa eksen görünümleri elde etmek için dönüştürücüyü 90° hareket ettirin. Doğru eksen görünümü elde edildikten sonra, imleci papiller kas seviyesine getirin, görüntüleri yakalamak için 2-D M modu tuşuna basın ve aşağıdaki parametreleri ölçmek için görüntü analiz yazılımını kullanın:
   1. Duvar kalınlığı (LVWT), hem sistol (S) hem de diyastoldeki (D) LV alanları ve sol ventrikül diyastolik alanı (LVDA) ve sol ventrikül sistolik alanı (LVSA) dahil olmak üzere LV boyutlarını en az üç vuruşta ölçün.
   2. Ek olarak, ventriküler fonksiyonu ejeksiyon fraksiyonu (EF, %), kısalma fraksiyonu (SF, %) ve kardiyak kütle (düzeltilmemiş bir küp varsayalım) ile denklem (1), denklem (2) ve denklem (3) kullanarak hesaplayın¹⁵.
      SF (%) = ([LVEDD - LVEDD]/LVEDD) × 100 (1)
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
      AG kütlesi = 1.055 × ([IVST + LVEDD + PWT]³− [LVEDD]³) (3)
      LVEDD sol ventrikül diyastol sonu çapı, LVESD sol ventrikül sonu sistolik çapı, IVST intraventriküler kalınlık ve PWT arka duvar kalınlığıdır.

5. Histoloji değerlendirmesi

1. Nekropsi sırasında, göğüs kafesi bir yandan diğer yana açarak ve onu çevreleyen tüm yapıları keserek kalbi hayvandan çıkarın. Kağıt mendil kullanarak hafif bir baskı uygulayarak boşlukların içindeki kan pıhtısını temizleyin.
2. Kalbi hasat edin ve laboratuvar hassasiyet ölçeğinde tartın. Oda sıcaklığında en az 72 saat boyunca% 10 formaldehit içine daldırın. Kalbi bir bıçak kullanarak 1 mm kalınlığında enine dilimler halinde tepeden tabana doğru manuel olarak kesin ve dilimleri parafine gömerek işleyin. Parafine gömülü 5 μm kalınlığındaki bölümlere mikrotom ile seri kesimler yapın.
3. Her bölümü slaytlar arasına yerleştirin ve hematoksilen ve eozin (H & E), Masson'un trikrom, rodamin konjuge lektin lekeli bölümleri veya Picrosirius kırmızısı^15,16 ile boyayın.
   1. Uygun bir fotomikroskop kullanarak, morfometri, fibroz ve MCSA miktar tayini için 400x'te dijitalleştirilmiş görüntüler alın. Mikroskobun bir dijital kameraya bağlı olduğunu ve görüntü analiz yazılımı olan bir bilgisayara bağlı olduğunu doğrulayın. Her morfometrik analiz için, görüntülerin aynı alanlarda, bölüm başına 400x'te (septum, enfarktüslü bölge ve uzak bölge) en az 10 yüksek güç alanıyla ve alanlarla örtüşmeden olduğundan emin olun.
      1. MCSA'yı ölçmek için, kardiyak miyositlerin konumlarının farkında olun ve yalnızca enine dilimlenmiş ve en az üç yakın kılcal damar ile çevrili miositleri sayın.
      2. Picrosirius kırmızı lekeli dilimlerde, skar ve septum alanlarını tanımlayın ve her iki bölgedeki interstisyel kollajeni görüntüleyin. Görüntüleri analiz yazılımına yükleyin ve tüm pozitif ve negatif kollajen alanlarını vurgulamak için eşik sekmesini açın Verileri elde etmek için ölçüm sekmesine basın ve sonuçları kaydedin. Bölge başına kollajen yüzdesinin hesaplanması için, denklem (4)'ü kullanın ve kollajen pozitif bölgeleri ekleyin ve bunları, başka bir yerde açıklandığı gibi kollajen pozitif alanlar da dahil olmak üzere toplam dokuya bölün^15,16.
         Kollajen (%) = Picrosirius kırmızı alanı/Toplam doku alanı (4)
      3. Parafine gömülü numunelerin rodamin konjuge lektin lekeli bölümlerinden elde edilen dijitalleştirilmiş görüntülerden MCSA'yı ölçün. Doğru görüntüyü elde etmek için, hücre zarlarını çevreleyen miyositlerin kırmızı ana hatlarını izlemek için görüntü analiz yazılımı kullanın. Alan sekmesini seçin, ana hatları izleyin ve ölçü sekmesi işlevine basın. Son olarak, hücre alanlarından elde edilen sonuçları^{kaydedin 16}.

6. Kardiyak yeniden şekillenmeyi değerlendirmek için enfarktüs boyutunun ve planimetrinin kantitatif olarak belirlenmesi

1. Işık mikroskobu (4x) ve uygun yazılım ile elde edilen Masson'un trikrom lekeli kesitlerinin histolojik görüntülerinden planimetri kullanarak miyokard enfarktüsü boyutunu, duvar kalınlığını ve endokardiyal ve epikardiyal çevrelerin uzunluğunu ölçün.
   1. Enfarktüs boyutunun ölçülmesi için, enfarktüs bölgesini (mavi) ve uzak bölgeyi (kırmızı) tanımlayın. Enfarktüs bölgesinin ve endokardiyal ve epikardiyal taraflardaki uzak bölgenin toplam uzunluğunu izleyin ve ölçün. Endokardiyal ve epikardiyal izlemelerin ortalamasını toplam LV çevresinin yüzdesi olarak hesaplayın¹⁷.
   2. Benzer şekilde, kalbin orta bölümündeki yara kalınlığını (beş eşit uzaklıktaki ölçümün ortalaması) ve septum kalınlığını (üç eşit uzaklıktaki ölçümün ortalaması) ölçün ve bu ölçümleri yara kalınlığı oranını (denklem [5]) ve genişleme indeksini (denklem [6]¹⁸) belirlemek için kullanın.
      NOT: Tüm değerler bir elektronik tabloya kaydedilebilir.
      Skar kalınlığı oranı = Skar kalınlığı/Septum kalınlığı (5)
      Genleşme indeksi = (LV boşluk alanı/toplam LV alanı) × (septum kalınlığı/skar kalınlığı) (6)
      NOT: Yeniden modelleme, genişlemeyi değiştirerek enfarktüs boyutunun hafife alınmasına veya fazla tahmin edilmesine neden olabileceğinden, enfarktüs boyutunu 24 saatte ölçmek için bir pilot deney yapmak ve ardından ötenazi yapmak için biraz zamana ihtiyaç duyulabilir. Bu durumda, hayvanı MI prosedürü için kullanılan aynı IP anestezik solüsyonu ile uyuşturun.
2. Hayvanı dorsal dekübite yerleştirin ve daha önce tarif edildiği gibi entübe edin. Hayvan uyuşturulduktan sonra, ksifoid apofizden aksiller oyuğa kadar cilde, kaslara ve kostal kemiklere ulaşan derin bir çapraz kesi yapın.
3. Aort arkını izole edin, çıkan aortta küçük bir delik açın ve kalbi Evan'ın mavisi ile perfüze etmek için bir kateter yerleştirin. Ardından, lekeli kalbi hayvandan manuel olarak çıkarın ve keskin bir bıçakla tepeden tabana doğru kesin. Kalp dilimlerini izotonik fosfat tamponunda (pH 7.4) %1 trifenil tetrazolyum klorür (TTC) içine yerleştirin ve hayvanların enfarktüs boyutu açısından karşılaştırılabilir olduğunu doğrulamak için 37 ° C'de 30 dakika ⁴ inkübe edin.

Sonuçlar

MI sonrası sağkalım ve nekropsi
4 haftalık takip boyunca, C57 farelerinin% 17'si (4/23) ve Gal-3 KO farelerinin% 40'ı (8/20) ölü bulundu. Nekropsi yapıldı; ölü Gal-3 KO fareleri, C57 farelerinden daha büyük kalpler gösterdi (Şekil 1) ve C57 farelerinin% 38'i, Gal-3 KO farelerinin% 32'si ile karşılaştırıldığında, doğrudan kalp yırtılması ile ilişkili makroskopik göğüs pıhtılarına...

Tartışmalar

Kalıcı koroner arter ligatürü ile MI'nın deneysel modeli, kardiyak onarımın çok çeşitli patofizyolojik mekanizmalarını incelemek ve yeniden modellemek için kullanılır ^5,14,17. Bu makale, kardiyak onarımın zamansal evrimini ve bunun MI sonrası ventriküler yeniden şekillenme üzerindeki etkilerini incelemek için şu anda bu laboratuvarda kullanılan farklı yöntemleri özetle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-0 silk suture	Ethicon
C57BL/6J mice	Department of Bioresources of the Faculty of Veterinary of the University of Buenos Aires, Argentina
Forceps
Hardvard 386 respirator	Hardvard company
Heating pad			maintain animal's temperature during surgery
Image Pro-Plus 6.0	Media Cybernetics		Image Analysis Software
Ketamine	Holiday
Masson Trichrome	BIOPUR
Picrosirius red	BIOPUR
Retractors
Rodent Ventilator Model 683	Harvard Apparatus		Mechanical ventilator
Scissors
Stereoscopic magnifying glass	Arcano
Vivid 7 machine (General Electric Medical Systems, Horten, Norway)	General Electric		Any tracking software can be utilized with this protocol
WGA no. RL-1022, Vector Laboratories, Burlingame	Vector Laboratories
Xylazine	Pro-Ser