JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, dış zar veziküllerinin biyomühendisliğini, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere bir "Tak ve Göster" aşı platformu olarak tanımlamaktadır.

Özet

Bakteri veya virüslerden elde edilen biyomimetik nanopartiküller, aşı araştırma ve geliştirmede büyük ilgi görmüştür. Dış zar vezikülleri (OMV'ler) esas olarak ortalama büyüme sırasında gram-negatif bakteriler tarafından salgılanır, nano boyutlu bir çap ve kendi kendine adjuvan aktivite ile aşı dağıtımı için ideal olabilir. OMV'ler proteinler, nükleik asitler ve küçük moleküller için çok yönlü bir dağıtım sistemi olarak işlev görmüştür. OMV'lerin biyolojik özelliklerinden tam olarak yararlanmak için, biyomühendislik ürünü Escherichia coli türevi OMV'ler bir taşıyıcı olarak ve SARS-CoV-2 reseptör bağlama alanı (RBD) bir "Tak ve Görüntüle" aşı platformu oluşturmak için bir antijen olarak kullanılmıştır. Streptococcus pyogenes'teki SpyCatcher (SC) ve SpyTag (ST) alanları, OMV'leri ve RBD'yi konjuge etmek için uygulandı. Sitolisin A (ClyA) geni, plazmid transfeksiyonundan sonra SC geni ile bir füzyon proteini olarak çevrildi ve OMV'lerin yüzeyinde reaktif bir bölge bıraktı. RBD-ST'yi gece boyunca geleneksel bir tampon sisteminde karıştırdıktan sonra, OMV'ler ve RBD arasında kovalent bağlanma oluştu. Böylece çok değerli gösteren bir OMV aşısı elde edildi. OMV'lerin aşı platformu, çeşitli antijenlerle değiştirilerek, çeşitli heterojenleri verimli bir şekilde görüntüleyebilir ve böylece bulaşıcı hastalık salgınlarını potansiyel olarak hızlı bir şekilde önleyebilir. Bu protokol, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere OMV aşı platformunu oluşturmak için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Giriş

Potansiyel bir aşı platformu olarak, dış zar vezikülleri (OMV'ler) son yıllarda giderek daha fazla dikkat çekmektedir 1,2. Esas olarak gram-negatif bakteri3 tarafından doğal olarak salgılanan OMV'ler, genellikle 20-300 nm4 boyutunda bir lipit çift katmanından oluşan küresel nano ölçekli parçacıklardır. OMV'ler, katı immün güçlendiriciler olarak hizmet veren bakteriyel antijenler ve patojenle ilişkili moleküler paternler (PAMP'ler) dahil olmak üzere çeşitli ebeveyn bakteriyel bileşenleri içerir5. Eşsiz bileşenlerinden, doğal vezikül yapısından ve büyük genetik mühendisliği modifikasyon alanlarından yararlanan OMV'ler, bakteriyel aşılar6, adjuvanlar7, kanser immünoterapi ilaçları8, ilaç dağıtım vektörleri9 ve anti-bakteriyel yapıştırıcılar10 dahil olmak üzere birçok biyomedikal alanda kullanılmak üzere geliştirilmiştir.

2020'den bu yana dünya çapında yayılan SARS-CoV-2 salgını, küresel topluma ağır bir zarar verdi. Spike proteinindeki (S proteini) reseptör bağlayıcı alan (RBD), insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE2) ile bağlanabilir ve bu da virüsünhücre 11,12,13'e girmesine aracılık eder. Bu nedenle, RBD aşı keşfi için birincil hedef gibi görünmektedir14,15,16. Bununla birlikte, monomerik RBD zayıf immünojeniktir ve küçük moleküler ağırlığı bağışıklık sisteminin tanımasını zorlaştırır, bu nedenle adjuvanlara sıklıkla ihtiyaç duyulur17.

RBD'nin immünojenisitesini arttırmak için çok değerli RBD'ler gösteren OMV'ler inşa edildi. RBD'yi görüntülemek için OMV kullanan mevcut çalışmalar genellikle RBD'yi bakteri18'de ifade edilmek üzere OMV ile kaynaştırır. Bununla birlikte, RBD virüs kaynaklı bir proteindir ve prokaryotik ekspresyonun aktivitesini etkilemesi muhtemeldir. Bu sorunu çözmek için, Streptococcus pyogenes'ten türetilen SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) sistemi, geleneksel bir tampon sisteminde OMV ve RBD ile kovalent bir izopeptit oluşturmak için kullanıldı19. SC alanı, biyomühendislik ürünü Escherichia coli tarafından bir füzyon proteini olarak Cytolysin A (ClyA) ile eksprese edildi ve ST, HEK293F hücresel ekspresyon sistemi aracılığıyla RBD ile eksprese edildi. OMV-SC ve RBD-ST gece boyunca karıştırıldı ve inkübe edildi. Ultrasantrifüjleme veya boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırmadan sonra OPV-RBD elde edildi.

Protokol

1. Plazmid yapımı

  1. Daha önce yayınlanan bir rapor20'yi takiben plazmid pThioHisA ClyA-SC'yi oluşturmak için BamH I ve Sal I bölgeleri arasındaki ampisilin dirençli bir pThioHisA-ClyA plazmidine DNA kodlama SpyCatcher dizisini (Ek Dosya 1) yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. Sentezlenmiş SpyTag-RBD-Histag füzyon genini (Ek Dosya 1), daha önce yayınlanmış bir rapor19'u takiben plazmid pcDNA3.1 RBD-ST'yi oluşturmak için BamH I ve EcoR I siteleri arasında bir pcDNA3.1 plazmidine (bakınız Malzeme Tablosu) bağlayın.

2. OMV-SC hazırlığı

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek ClyA-SC dönüşümünü gerçekleştirin.
    1. 50 μL BL21 yetkin gerinimine 5 μL pThioHisA ClyA-SC plazmid çözeltisi (50 ng / μL) ekleyin, hafifçe üfleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde soğumaya bırakın.
    2. 90 s'lik çözeltiyi 42 ° C'deki su banyosuna yerleştirin ve ardından karıştırılmış çözeltiyi hemen 3 dakika boyunca buz üzerine koyun.
    3. Bakteriyel süspansiyona 500 μL LB ortamı ekleyin ve karıştırdıktan sonra 1 saat boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de kültür ekleyin.
    4. Ampisilin (100 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ve kültür içeren bir LB agar plakasına dönüşümü 37 ° C'de gece boyunca plakalayın.
      NOT: Sonraki deneylerde, ampisilin ortamda aynı konsantrasyonda tutuldu. Aksi takdirde, bu bakterilerde plazmid kaybına neden olabilir.
  2. OMV-SC üretimi için aşağıdaki adımları uygulayın.
    1. Tek bir koloniyi, plakadan (adım 2.1.4.) 20 mL LB (ampisilin dirençli) ortama ve kültürden gece boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de izole edin.
    2. Bakteriyel çözeltiyi (adım 2.2.1'den itibaren.) 2 L ortama, 220 rpm'de kültüre, logaritmik büyüme aşamasına kadar 5 saat boyunca 37 ° C'ye (OD600nm, 0.6 ila 0.8 arasındadır) aşılayın.
    3. Bakteriyel çözeltinin 600 nm'sindeki OD 0.6-0.8'e ulaştığında, bakteriyel çözeltinin son konsantrasyonunu 0.5 mM yapmak için izopropil beta-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve daha sonra 25 ° C'de 220 rpm'de gece boyunca kültürleyin.
  3. OMV-SC saflaştırma işlemini gerçekleştirin.
    1. Bakteriyel çözeltiyi 30 dakika boyunca 4 °C'de 7.000 x g'de santrifüj edin.
    2. Süpernatantı 0,22 μm membran filtre ile filtreleyin, ardından 100 kD ultrafiltrasyon membranı veya içi boş fiber kolon kullanarak konsantre edin (bkz.
    3. Konsantreyi 0,22 μm'lik bir membran filtreden süzün, ardından ultrasantrifüj kullanarak 2 saat boyunca 4 °C'de 150.000 x g'de santrifüj yapın (bkz.
    4. Yağışı PBS ile yeniden askıya alın ve -80 ° C'de saklayın. Çözelti -80 ° C'de uzun süreli stabiliteyi koruyabilir.

3. RBD-ST hazırlığı

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek RBD-ST transfeksiyonu gerçekleştirin.
    1. Uygun bir ökaryotik ekspresyon sistemi (örneğin, HEK293F) seçin ve iyileşmeden sonra hücreleri 37 ° C'de 130 rpm'de gece boyunca kültürleyin.
    2. Otomatik hücre sayacına 20 μL HEK293F hücre çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), hücre sayısını kaydedin, konsantrasyonu 1 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın ve ardından hücreleri 4 saat boyunca 37 ° C'de 130 rpm'de kültürleyin.
    3. RBD-ST plazmidini 0,22 μm membran filtreden filtreleyin ve son hacim 10 mL olana kadar hücre kültürü ortamına 300 μg plazmid ekleyin (bkz. 10 s sallayın.
    4. PEI'yi (1 mg/mL, bakınız Malzeme Tablosu) su banyosunda 65 °C'ye ısıtın, 0,7 mL PEI'yi 9,3 mL hücre kültürü ortamı ile karıştırın ve 10 sn boyunca aralıklı olarak çalkalayın.
      NOT: Solüsyonu kuvvetlice sallamayın. Aksi takdirde, ortaya çıkan kabarcıklar transfeksiyon verimliliğini etkileyebilir.
    5. PEI çözeltisine plazmid çözeltisi ekleyin, karışımı 10 s boyunca aralıklı olarak çalkalayın ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    6. Karışımı 280 mL hücre kültürü ortamına ve 5 gün boyunca 37 ° C'de 130 rpm'de kültüre ekleyin.
  2. RBD-ST saflaştırma işlemini gerçekleştirin.
    1. Hücreleri 20 dakika boyunca 25 ° C'de 6.000 x g'da santrifüj edin ve süpernatanı toplamak için bir pipet kullanın.
    2. Sütunu 2 mL Ni-NTA agaroz ile doldurun ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3x PBS ile 3 kat yıkayın.
    3. 20 mM'lik son konsantrasyonu yapmak için hücre süpernatanına imidazol ekleyin (bkz.
    4. Yıkama için 20 mM imidazol içeren 3 sütun hacmi (CV) PBS ekleyin ve yıkama fraksiyonunu toplayın.
    5. Düşük ila yüksek konsantrasyonlarda (örneğin, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M) imidazol içeren 3 CV PBS ile gradyan elütü; Her konsantrasyon için 2x elüt.
    6. Farklı konsantrasyon gradyanlarındaki RBD-ST'yi tanımlamak için SDS-PAGE21'i kullanın.

4. OMV-RBD biyokonjugasyon ve saflaştırma

  1. BCA yöntemi ile protein konsantrasyonunu belirleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
    1. Standart BSA protein çözeltisini 2 mg/mL'den 0,0625 mg/mL'ye kadar seri olarak seyreltin, saflaştırılmış OMV-SC ve RBD-ST 10x'i seyreltin, ardından BCA çalışma çözeltileri A ve B'yi (tahlil kitinde sağlanan) 50:1 (v/v) oranında karıştırın.
    2. Seyreltilmiş protein çözeltisi (25 μL / kuyu) ekleyin ve BCA çalışma çözeltisi (200 μL / kuyu) ile karıştırın; 30 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
    3. Her bir kuyucuğun 562 nm'sinde absorbansı (OD) ölçün ve standart eğri22'den protein konsantrasyonunu hesaplayın.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek OMV-SC ve RBD-ST'nin biyokonjugasyonunu gerçekleştirin.
    1. PBS'de OMV-SC ve RBD-ST'yi 40:1 (w/w) oranında karıştırın.
    2. Karışımı gece boyunca 4 ° C'de 15 rpm'de karıştırmak için dikey olarak döndürün.
      NOT: Farklı antijenler farklı oranlarda reaksiyona girebilir. Antijenin özelliklerine bağlı olarak farklı reaksiyon oranları denenebilir.
  3. Reaksiyon verimliliğini doğrulayın.
    1. 10 μL OMV-SC, RBD-ST ve reaksiyon ürününü hazırlayın (adım 4.2.). 2,5 μL 5x yükleme tamponu ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve numuneleri 100 °C'de 5 dakika ısıtın. Numuneleri jele (10 μL/kuyu) yükleyin. 20 dakika boyunca 60 V'ta elektroforez yapın ve durumu 1 saat boyunca 120 V olarak değiştirin.
    2. Proteini jelden PVDF batı lekeleme membranlarına (bakınız Malzeme Tablosu) 70 dakika boyunca 100 V'ta aktarın.
    3. Membranı %5 yağsız süt / TBST tozuna koyun ve 1 saat çalkalayın. Ardından, çalkalama ile yıkama başına 5 dakika boyunca TBST ile 3x yıkayın.
    4. Membranı% 0.1 His-Tag antikoru / TBST'ye koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 saat çalkalayın, ardından sallama ile yıkama başına 5 dakika boyunca TBST ile 3x yıkayın.
    5. Membranı% 0,02 anti-fare IgG1 antikoru (HRP ) / TBST'ye koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 40 dakika çalkalayın, ardından sallama ile yıkama başına 5 dakika boyunca TBST ile 3x yıkayın.
    6. Gelişmiş kemilüminesans çözeltisi ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve membranı açığa çıkarın.
  4. OMV-RBD'nin saflaştırılmasını gerçekleştirin.
    1. 1 mL reaksiyona giren OMV-RBD çözeltisini 10 mL'ye kadar seyreltin ve seyreltmeyi 2 saat boyunca 4 °C'de 150.000 x g'de santrifüj edin.
    2. Süpernatantı atmak için bir pipet kullanın ve kalıntıyı 10 mL PBS ile askıya alın. Süspansiyonu 2 saat boyunca 4 °C'de 150.000 x g'de santrifüj yapın.
    3. Süpernatantı atın ve kalıntıyı 1 mL PBS ile askıya alın.
      NOT: Antijenin çözünürlüğü çok daha düşükse, aynı ayırma etkisi boyut dışlama kromatografisi19 ile elde edilebilir.

5. Karakterizasyon

  1. Dinamik ışık saçılımı (DLS) gerçekleştirin.
    1. Numuneleri 100 μg/mL konsantrasyonda seyreltin ve numune hücresine 1 mL numune ekleyin.
    2. "Ölçüm tipi" için "Boyut"u, "Numune malzemesi" için "Protein"i, "Dispersan" için "Su"yu, "Sıcaklık" için "25 °C"yi seçin ve ardından numuneleri yükleyip otomatik olarak ölçün23'ü seçin.
  2. İletim elektron mikroskobu (TEM) kullanarak görüntüleri yakalayın.
    1. Numuneleri 100 μg/mL'ye kadar seyreltin. 200 mesh bakır ızgara alın, üzerine 20 μL numune ekleyin ve 10 dakika boyunca emilmesini sağlayın.
    2. Çözeltiyi fitillemek için filtre kağıdı kullanın, destek filmine 20 μL% 3 uranil asetat ekleyin ve 30 saniye boyunca lekeleyin.
    3. Uranil asetat fitilini çekin ve filmi oda sıcaklığında 1 saat boyunca doğal olarak kurutun.
    4. Numuneleri TEM sistemine yükleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve 80 kV'ta görüntü yakalayın.

Sonuçlar

Bu protokolün akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokol, OMV'leri bir aşı platformu olarak kullanmaya yönelik genel bir yaklaşım olabilir; sadece antijenlerin tipine göre uygun ekspresyon sistemlerini seçmek gerekir.

Şekil 2, uygulanabilir bir plazmid tasarım şeması sağlar. SC geni, esnek bir bağlayıcı aracılığıyla ClyA genine bağlanırken, ST, saflaştırma ve doğrulama için RBD geninin 5' termi...

Tartışmalar

Bir "Tak ve Görüntüle" nanopartikül aşı platformu oluşturmak için, SC-kaynaşmış ClyA, protein ekspresyonu24'teki avantajları nedeniyle rekombinant protein üretimi için en yaygın kullanılan modellerden biri olan BL21 (DE3) suşlarında ifade edildi, böylece bakteri çoğalması işlemi sırasında OMV'lerin yüzeyinde yeterli SC fragmanı gösterilecekti. Aynı zamanda, antijenler ve OMV'ler arasındaki kimyasal eşleşme için ST-kaynaşmış bir hedef antijen hazırlandı. Bu den...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı'nın Anahtar Programı tarafından desteklenmiştir (Hayır. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Projesi (No. 31670936, 82041045).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin sodiumSangon BiotechA610028
Automated cell counterCountstarBioTech
BCA protein quantification Kitcwbiocw0014s
ChemiDoc Touching Imaging SystemBio-rad
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatusCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
Goat pAb to mouse IgG1Abcamab97240
High speed freezing centrifugeBioridgeH2500R
His-Tag mouse mAbCell signaling technology2366s
ImidazoleSangon BiotechA600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosideSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Non-fat powdered milkSangon BiotechA600669
OPM-293 cell culture mediumOpm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmidWuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer salineZSGB-bioZLI-9061
Polyethylenimine LinearPolysciences23966-1
Prestained protein ladderThermo26616
pThioHisA ClyA-SC plasmidWuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting MembranesRoche03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x)BeyotimeP0015
Sodium chlorideSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)Thermo34577
Suspension instrumentLife TechnologyHula Mixer
Transmission Electron MicroscopeHitachiHT7800
TryptoneOxoidLP0042B
UltracentrifugeBeckman coulterXPN-100
Ultraviolet spectrophotometerHitachiU-3900
Yeast extractSangon BiotechA610961

Referanslar

  1. Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
  2. Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
  3. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  4. Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
  5. Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
  6. Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
  7. Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
  8. Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
  9. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
  10. Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
  11. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  12. Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
  13. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
  14. Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
  15. Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
  16. Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
  17. Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
  18. Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
  19. Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
  20. Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
  21. Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
  22. Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
  23. Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
  24. Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
  25. Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
  26. Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
  27. Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  28. Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
  29. van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
  30. Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
  31. Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
  32. Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
  33. Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
  34. Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
  35. Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır