JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Hücresel membranlar, biyomoleküler reaksiyonlar ve sinyalizasyon için oldukça kalabalık ortamlardır. Bununla birlikte, lipitlerle protein etkileşimini araştıran çoğu in vitro deney, çıplak çift katmanlı membranlar kullanır. Bu tür sistemler, membrana gömülü proteinler ve glikanlar tarafından kalabalıklaşmanın karmaşıklığından yoksundur ve hücresel membran yüzeylerinde karşılaşılan ilişkili hacim etkilerini dışlar. Ayrıca, lipit çift katmanlarının oluştuğu negatif yüklü cam yüzey, transmembran biyomoleküllerinin serbest difüzyonunu önler. Burada, kalabalık lipid membranları için bir mimik olarak iyi karakterize edilmiş bir polimer-lipid membranı sunuyoruz. Bu protokol, polietilen glikol (PEG) konjuge lipitleri, crowder'ları desteklenen lipit çift katmanına (SLB) dahil etmek için genelleştirilmiş bir yaklaşım olarak kullanır. İlk olarak, tek moleküllü deneyler yapmak için mikroskobik slaytların ve örtülerin temizleme prosedürü sunulmuştur. Daha sonra, PEG-SLB'leri karakterize etme ve tek moleküllü izleme ve fotobeyazlatma kullanarak biyomoleküllerin bağlanması, difüzyonu ve montajının tek moleküllü deneylerini gerçekleştirme yöntemleri tartışılmaktadır. Son olarak, bu protokol, tek moleküllü fotobeyazlatma analizi ile kalabalık lipit membranları üzerinde bakteriyel gözenek oluşturan toksin Sitolisin A'nın (ClyA) nanopore montajının nasıl izleneceğini göstermektedir. Örnek veri kümelerine sahip MATLAB kodları, parçacık izleme, difüzyon davranışını ayıklama ve alt birim sayımı gibi bazı yaygın analizleri gerçekleştirmek için de dahil edilmiştir.

Giriş

Hücresel membranlar oldukça kalabalık ve karmaşık sistemlerdir1. Moleküler kalabalıklaşma, protein ve lipitler gibi membrana bağlı varlıkların difüzyonu üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir 2,3,4. Benzer şekilde, reseptör dimerizasyonu veya membran komplekslerinin oligomerizasyonu gibi lipit membranlar üzerindeki bimoleküler reaksiyonlar 5,6,7 kalabalığından etkilenir. Kalabalıkların doğası, konfigürasyonu ve konsantrasyonu, membran bağlanmasını, difüzyonunu ve protein-protein etkileşimini çeşitli şekillerde yönetebilir 8,9. Hücresel membranlar üzerindeki membran kalabalığını kontrol etmek ve gömülü biyomoleküller üzerindeki etkisini yorumlamak zor olduğundan, araştırmacılar alternatif in vitro sistemler kurmaya çalışmışlardır10.

Yapay kalabalık membranlar için popüler bir yaklaşım, çift katmanlı membranların polimer (polietilen glikol, PEG gibi) aşılanmış lipitlerle dopinglenmesidir11,12. Desteklenen lipit çift katmanları (SLB'ler) üzerindeki protein ve lipit dinamiklerinin görselleştirilmesi sırasında, bu polimerler ayrıca membrana gömülü bileşenleri, çift katmanı altta yatan destekten etkili bir şekilde kaldırarak altta yatan negatif yüklü substrattan (cam gibi) korur. Polimerin boyutunu ve konsantrasyonunu değiştirerek, moleküler kalabalıklaşmanın derecesini ve altta yatan katı destekten ayrılmasını kontrol edebilir13,14. Bu, polimer yastıkları olmayan katı substratlar üzerinde desteklenen lipit çift katmanlıtabakalara göre açıkça bir avantajdır 15,16, transmembran biyomolekülleri aktivitelerini kaybedebilir17,18,19. Daha da önemlisi, birçok membran işlemi için kritik olan hücre zarının kalabalık ortamını in vitro olarak özetlememizi sağlar.

Membranlar üzerindeki yüzey aşılı polimerler de aşılama yoğunluklarına bağlı olarak konfigürasyonlarında değişikliklere uğrar12. Düşük konsantrasyonlarda, membran yüzeyinin üzerinde, mantar olarak bilinen entropik olarak sarılmış bir konfigürasyonda kalırlar. Artan konsantrasyonla, etkileşime girmeye başlarlar ve açılma ve genişleme eğilimindedirler, sonunda membran21 üzerinde yoğun bir fırça benzeri oluşum sağlarlar. Mantardan fırça rejimine geçiş oldukça heterojen olduğundan ve polimerin kötü karakterize edilmiş koşullarında ortaya çıktığından, polimer aşılı membranlarda kalabalıklaşma için iyi karakterize edilmiş koşulların kullanılması önemlidir. Yakın tarihli bir çalışma20 ile karşılaştırıldığında, transmembran biyomoleküllerinin difüzif taşınımını ve aktivitesini koruyan kalabalık membran bileşimlerini tanımlamakta ve raporlamaktayız.

Bu protokolde, PEGile lipid membranlarının nasıl üretileceğini tartışıyoruz ve iki farklı polimer konfigürasyon rejiminde (yani, mantar ve fırça) kalabalığı taklit eden PEG yoğunlukları için önerilerde bulunuyoruz. Protokol ayrıca bu kalabalık membranlara gömülü moleküller için tek moleküllü bağlanma, parçacık izleme ve fotobeyazlatma veri toplama ve analizini de açıklar. İlk olarak, kapsamlı temizleme adımlarını, görüntüleme odasının montajını ve PEG-SLB'lerin oluşumunu açıklıyoruz. İkincisi, tek moleküllü bağlama, parçacık izleme ve fotobeyazlatma deneyleri için ayrıntılar sağlıyoruz. Üçüncüsü, i) nispi bağlanma afinitelerinin çıkarılmasını, ii) moleküler difüzyonun karakterize edilmesini ve iii) membran üzerindeki tek moleküllerin filmlerinden bir protein grubundaki alt birimlerin sayılmasını tartışıyoruz.

Bu sistemi tek moleküllü görüntüleme ile karakterize etmemize rağmen, protokol, kalabalıklaşmanın lipit membranları üzerindeki biyomoleküler reaksiyonlar üzerindeki etkisini anlamak isteyen tüm membran biyofizikçileri için yararlıdır. Genel olarak, kalabalık ve desteklenen lipit çift katmanları yapmak için sağlam bir boru hattı, bunlar üzerinde yürütülen çeşitli tek moleküllü testler ve ilgili analiz rutinleri sunuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Tek moleküllü deneyler için sürgü ve kapak kaymasının temizlenmesi

  1. Görüntüleme odasının montajından önce, hem kapak kapaklarını hem de slaytları temizleyin ve hazırlayın. Elmas kaplı matkap uçlarına (0,5-1 mm çapında) sahip bir delme makinesi kullanarak cam kızaklar üzerinde birden fazla delik çifti açın. Akrilik levhalar kullanılıyorsa, Şekil 1'de gösterildiği gibi hassas delikler (0,5 mm) yapmak için bir lazer kesici kullanın.
    NOT: Her bir delik çifti, bireysel bir mikroakışkan odası için akış değişimi için bir giriş ve çıkış görevi görecektir. Akrilik slayttaki delikler için temsili bir CAD dosyası Ek Kodlama Dosyası 1'de mevcuttur. Cam kızaklara açılan delikler genellikle matkap ucu boyutundan 1,5x-2 kat daha büyüktür.
  2. Slaytları ve kapak kapaklarını deterjanla temizleyin. Deiyonize su ile iyice durulayın. Slaytları ve kapak kapaklarını suyla ayrı bir slayt boyama (Coplin) kavanozuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca bir banyo sonikatöründe sonikasyon yapın. Tüm sonication adımları için, bir 70 W güç ayarı kullanın.
  3. Suyu çıkarın ve cam slaytları ve kapakları içeren Coplin kavanozunu ağzına kadar asetonla doldurun (kavanoz hacmine bağlı olarak 50-100 mL). Akrilik levhalar söz konusu olduğunda, aynı hacimde önceden karıştırılmış% 50 (v / v) aseton çözeltisi kullanın, aksi takdirde slaytlar donar. Tüm slaytların ve kapakların çözeltiye tamamen daldırıldığından emin olmak için Coplin kavanozunu sallayın ve 30 dakika boyunca bir banyo sonikatöründe sonikasyon yapın.
  4. Asetonu çıkarın ve bir atık kabına atın, metanolü Coplin kavanozlarına dökün (% 50, akrilik slaytlar için v / v) ve 30 dakika boyunca sonikat yapın. Hem aseton hem de metanolü, slaytlardaki organik parçacıkları uzaklaştırmak için kullanılır.
  5. Slaytları ve örtüleri bol miktarda tip 1 su ile durulayın ve bir cam Coplin kavanozuna yerleştirin. Kavanozun içine 1 M KOH çözeltisi dökün ve 1 saat boyunca sonikleştirin. Akrilik kızaklar için 0,5 M KOH kullanın.
  6. KOH'yi inorganik bir atık kabına atın. Kavanozu bol suyla durulayın ve Coplin kavanozlarını piranha tedavisi için bir duman başlığına yerleştirin. Akrilik slaytlar için piranha tedavisi yapmayın; doğrudan adım 1.9'a geçin.
    DİKKAT: Piranha tedavisi, uygun eldivenler, güvenlik gözlükleri ve asitleri işlemek için bir önlük bulunan bir duman başlığında yapılmalıdır. Piranha çözeltisi güçlü bir oksitleyici ajandır ve artık organik parçacıkları slaytlardan ve kapaklardan uzaklaştırır.
  7. Piranha çözeltisini hazırlamak için, bir cam kabın içine yavaşça 2/3 hacimli sülfürik asit (% 98, v / v) dökün ve geri kalanını hidrojen peroksit (% 30, v / v) ile doldurun. Çözeltiyi dikkatlice bir cam çubukla karıştırın, Coplin kavanozuna dökün ve Coplin kavanozunu duman davlumbazında en az 1 saat bekletin.
  8. Piranha çözeltisini Coplin kavanozundan duman davlumbazının içinde tutulan asit atıkları için bir atma kabında boşaltın. Coplin kavanozunu bol miktarda tip 1 su ile durulayın.
  9. Kızakları ve örtüleri yumuşak bir azot gazı akışında kurutun ve temiz bir Coplin kavanozuna yerleştirin. Kurutulmuş slaytlar ve örtüler artık plazma tedavisi için hazırdır. Bir çift slayt ve kapak kapağı alın ve bunları plazma makinesine yerleştirin.
  10. Odada bir vakum oluşturun. Odada plazma üretmek için düğmeyi 8-12 MHz radyo frekansına çevirin. Odanın içindeki mor bir parıltı, odada bir plazma oluşumunu gösterecektir.
  11. Plazma tedavisini 8-10 dakika boyunca gerçekleştirin. Plazmayı kapattıktan sonra vakumu yavaşça serbest bırakın ve mikroakışkan görüntüleme odasını monte etmek için adım 2'ye geçin.

2. Mikroakışkan odanın montajı

NOT: Görüntüleme odası, çift taraflı bandın önceden temizlenmiş bir kapak kayması arasına sıkıştırılması ve aşağıda açıklandığı gibi önceki adımdan kaydırılmasıyla oluşturulur.

  1. Şekil 1'de gösterildiği gibi plazma işleminden sonra slaytları ve örtüleri birleştirin. Cam slaytı temiz bir kağıt mendil üzerine yerleştirin. Çift taraflı bandı ~ 2-3 mm genişliğinde şeritler halinde kesin ve cam slayttaki bir çift deliğin her iki tarafına yerleştirin. Bandı düzleştirmek için pipet ucu kullanın, aksi takdirde bir kanaldan diğerine sızıntıya neden olur.
    NOT: Alternatif olarak, lazer veya otomatik çizici kesici kullanarak tüm slayt için bandı kesin (Şekil 1).
  2. Odayı kapatmak için plazma ile işlenmiş kapak kapağını bantlı slaytın üzerine yerleştirin. Kanalı su geçirmez hale getirmek için kapak kaymasını bantlı bölgelere hafifçe bastırmak için bir pipet ucu kullanın.
  3. Cam slaytlar kullanıyorsanız, epoksi reçine kullanarak kenarları kapatın. Son olarak, bir slayt ve kapak kaymasından yapılan her görüntüleme odasının boyutu 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (uzunluk x genişlik x derinlik). Hazırlanan mikroakışkan görüntüleme odalarını kurumuş koşullarda (tercihen 10-25 °C arasında) 1-2 hafta saklayınız.
    NOT: Akrilik kızaklarla kullanılan lazer kesim bantlar için, bant kenarları sızdırmazlık sızdırmaz sıkı bir sızdırmazlık oluşturduğundan epoksi kullanmak gerekli değildir.

3. Vezikül füzyonu ile cam substrat üzerinde desteklenen çift katmanlı yapım

NOT: Görüntüleme odasının duvarlarında, katkılı PEG-lipidlerle hazırlanan lipid veziküllerinin füzyonu ile kalabalık destekli lipid çift tabakaları üretilir.

  1. Temiz bir cam şişe alın, tercihen piranha çözeltisi kullanılarak önceden temizlenir. PEG2000 lipitlerinin istenen mol fraksiyonuna 1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin (POPC) ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polietilen glikol)-2000] (DOPE-PEG2000) kloroform çözeltisini ekleyin, böylece tampon eklendikten sonra son konsantrasyon adım 3.4'te 3 mM lipit olacaktır. Lipitlerin diğer membran bileşimlerini benzer şekilde hazırlayın.
  2. Kloroformu şişeden küçük bir girdap ile yumuşak bir azot akışı kullanarak kurutun, böylece kurutulmuş lipitler şişenin yüzeyinde düzgün bir şekilde kaplanır. Şişeyi 1 saat boyunca vakumlu bir kurutucuya koyun. Bu, cam şişedeki kalıntı kloroformu ortadan kaldıracaktır. 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Aşağıda açıklandığı gibi küçük unilamellar veziküller (SUV'lar) hazırlayın.
    1. Çözelti bulanık ve sütlü hale gelene kadar gece boyunca inkübasyondan sonra 1-2 dakika boyunca yavaşça vorteks.
    2. Bu çözeltinin 100 μL'sini küçük bir 500 μL santrifüj tüpünde alın ve bir banyo sonikatöründe yaklaşık 1 saat boyunca sonikasyon yapın (70 W güç ayarında ayarlayın). Çözüm netleşecek; değilse, o zaman ek bir 30 dakika daha sonikasyon. Bu adım, 50-100 nm çapında SUV'lar üretecek.
      NOT: İlk kez hazırlanıyorsanız, SUV'ları dinamik ışık saçılımı22,23 (DLS) veya eşdeğer bir yöntem kullanarak karakterize edin.
  4. Soniklenmiş veziküllere kalsiyum klorür (CaCl 2, 3 M stok) ekleyin, böylece nihai konsantrasyonu lipit çözeltisinde 30 mM olur.
  5. Numune çözeltisini enjekte etmek için bir mikropipet ucunu deliğe sıkıca oturacak şekilde kesin. Lipit çözeltisini karıştırın ve adım 2'de yapılan görüntüleme odasındaki deliklerden birinden enjekte edin. Bitişik kanalların kirlenmesini önlemek için odadan çıkıştan çıkan fazla çözeltiyi temiz bir doku ile silin.
  6. Bu tertibatı nemlendirilmiş bir odada 90 dakika bekletin. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün sonuna ıslak bir doku yerleştirerek bir nemlendirme odası hazırlayın. Sürgüyü, tüp kapakları kapalıyken tüpün içine yana doğru yerleştirin. Veziküller kaynaşacak ve cam yüzeyinde düzgün bir çift katman oluşturacaktır.
  7. Odayı bol miktarda PBS tamponu ile iyice yıkayın (görüntüleme odasının hacminin yaklaşık 5 katı). Yıkama sırasında hava kabarcıklarının odaya girmesini önleyin, çünkü bu membranda kusurlara neden olabilir.

4. Mikroskop kurulumu ve tek parçacıklı görüntüleme ölçümleri

NOT: Tek moleküllü deneyler objektif tabanlı toplam iç yansıma floresan24,25,26 (TIRF) mikroskop kurulumu üzerinde gerçekleştirilmektedir (Şekil 2). TIRF görüntüleme, tek moleküllü görüntüleme için daha iyi bir sinyal-gürültü oranı sağlar, ancak epi-floresan mikroskoplar belirli koşullar altında da kullanılabilir (özellikle floresan biyomolekülleri yıkanarak toplu çözeltiden çıkarılabildiğinde). Prizma tipi TIRF kullanılabilir, ancak mikroakışkanların kurulma kolaylığı için objektif tip tercih edilir27. Hedef tipi TIRF için, yüksek sayısal diyaframlı bir hedef (100x büyütme, genellikle ticari olarak TIRF hedefi olarak temin edilebilir) önerilir.

  1. Hareketlilik ve montaj konusunda herhangi bir deney yapmadan önce, kaçış alanının aydınlatması nedeniyle optimum sinyal-gürültü oranını sağlamak için TIRF mikroskobunu hizalayın. Hizalama sırasında, lazer gücünü 100 μW ile 1 mW arasında düşük tutun.
    DİKKAT: Lazer ışınının hizalanması sırasında lazer güvenlik gözlükleri kullanılmalıdır.
    1. Mikroskobu hizalamak için, mikroakışkan kanala düşük konsantrasyonlarda (~ 100 pM'de) ekleyerek bir floresan boncuk örneği hazırlayın, böylece tek boncuklardan floresan lekeler görüntülerde üst üste binmez.
    2. İlk olarak, boncukları epifloresan modunda görselleştirin. Aydınlatma epifloresan modundayken, M5 ayna çeviri aşamasını (lazeri dikroiğe yansıtan ayna) objektiften çıkan ışın sonunda toplam iç yansıma konfigürasyonuna girene kadar bükülecek şekilde hareket ettirin.
    3. TIR aydınlatmasının sağlanıp sağlanmadığını doğrulayın. TIR kaçış alanı boncuk numunesini aydınlatırken, yalnızca yüzeydeki boncukların görünür olduğunu ve yüzeyden uzakta serbest yüzen boncukların gözlenmediğini kontrol edin.
  2. Deneyin başlangıcında, floroforların foto-tahribatını (fotobeyazlatma) önlemek için lazer gücünü objektif arka odak düzleminde 5-10 mW'a ayarlayın.
  3. Slaytı mikroskop aşamasında tutun ve önce çıplak membrana (florofor olmadan) odaklanın. Genellikle, lipit membranlarındaki küçük safsızlık izleri bunu yapmak için yeterlidir. İsteğe bağlı: Adım 3.1 sırasında az sayıda floresan boncuk veya kuantum noktası (alt pikomolar aralık) ekleyin, böylece doğru odağın tanımlanmasını kolaylaştırmak için görüş alanında yalnızca iki ila beş floresan parçacık bulunur.
  4. Adım 3.7'de yapılan PEG-SLB kaplı görüntüleme odasına bir mikropipet kullanarak numuneyi (membran-proteinler vb.) enjekte edin.
  5. Tek moleküllü bağlanma kinetiğini ölçmek için, etiketli biyomolekülleri giriş deliklerinden mikroakışkan odasına akıtmak için bir şırınga pompası kullanın (Şekil 3). 50-500 μL/dak akış hızı kullanın.
    1. Çözümü görüntüleme odasına eklemeden önce film alımına başlayın. Membran yüzeyinde yeni noktaların görünümünde daha fazla artış olmayıncaya kadar sürekli akış altında 25-50 kare/sn kare hızında 5.000 kare > elde edin (Video 1). Bağlanma kinetik analizi için, 6.1'deki adımları izleyin.
  6. Tek parçacık izleme için, etiketli biyomolekülleri düşük konsantrasyonlarda (bağlanma sabitine kıyasla) bir mikropipet kullanarak kanala ekleyin. Konsantrasyonu <0,1 partikül/μm2 yoğunluğa optimize edin, böylece tek tek parçacıklar nadiren yolları kesişir (Video 2). Bu, veri kümelerinden kurtarılan parçaların yüksek doğrulukta olmasını sağlar. Gerekirse nemlendirici bir ortamda (biyomoleküller tarafından zayıf membran bağlanması durumunda, ~ 10 dakika) inkübe edin ve odayı tamponla yıkayın.
    NOT: Membran üzerindeki bağlanmanın zayıf olması ve floresan moleküllerinin çoğunun çözelti içinde kalması durumunda yıkama gereklidir. Aksi takdirde, bu durum görüntülemeyi engelleyebilir ve sinyal-gürültü oranının düşük olmasına neden olabilir.
  7. Tek parçacıklı yörünge analizi için, 10-100 kare / s'de 200-500 kare elde edin. Objektif lensin çift katmanlı düzleme odaklanmasını ve edinme aralığı boyunca minimum aşama kayması ile koruyun.

5. Bir protein düzeneğindeki alt birimleri saymak için görüntü toplama

NOT: Stokiyometriyi tahmin etmek için görüntü elde etmek, floroforların sürekli ağartılmasını ve daha fazla florofor floresan yaymayana kadar adım sayısının tespit edilmesini gerektirir.

  1. Alt birimleri ölçmek için, etiketli biyomoleküllerin ilgili konsantrasyonunu ekleyin (örnek: sonuçlara bakın; ClyA, mikroakışkan görüntüleme odasına 25 nM konsantrasyonunda eklendi ve inkübe edildi (gerekirse yıkayın). Slaytı nemlendirme odasındaki bir nemlendirme odasında istenen süre boyunca gerekli süre boyunca inkübe edin (örneğin: ClyA'nın montajı için 37 °C ve 60 dakika).
  2. Aşağıda açıklandığı gibi tek moleküllü fotobeyazlatma için görüntü yakalama gerçekleştirin.
    1. Görüntülemeden önce görüntüleme odasını bir tamponla yıkayın (gerekirse). Slaytı mikroskopa yerleştirin ve etiketli molekülleri görselleştirmek için odağı ayarlayın.
    2. Lazer gücünü, floroforun ağartılmasının kademeli olarak (~ 1-5 dakika) gerçekleştiği bir seviyeye ayarlayın. İdeal olarak, monte edilen her biyomolekül için, fotobeyazlatma adım hızını >10-20 görüntüleme çerçevelerini ayrı tutun. Tüm moleküller tamamen fotobeyazlatılana kadar görüntüleri elde edin (Video 3).
      NOT: Gerekli fotobeyazlatma yörüngesinin toplam süresini belirlemek için, tek tek noktaların ortalama yoğunluğunu görüntüleme karelerinin sayısıyla çizin ve üstel bir bozunma fonksiyonu takarak zaman sabitini belirleyin. Satın almanın toplam süresi, zaman sabitinin 5-10 katına ayarlanabilir.
  3. Numune hazneye girer girmez film alımını başlatarak ve PEG-SLB'nin farklı segmentlerinden membran bağlandıktan sonra sabit zaman aralıklarında yeni fotobeyazlatma filmleri elde ederek zamana bağlı bir montaj ölçümü gerçekleştirin.

6. Görüntü ve veri analizi

  1. Aşağıda açıklandığı gibi tek parçacık bağlama ve izleme gerçekleştirin.
    1. Şekil 4'te gösterildiği gibi, yukarıda edinilen filmlerden tek parçacıklı yörüngeleri çıkarın. Tek parçacıkları algılamak ve izlemek için MATLAB paketini, u-track28'i veya ImageJ'deki bir eklenti olan ve aynı zamanda sağlam bir tek parçacık izleme algoritması sağlayan Trackmate29'u kullanın. Ek Dosya 1'de gösterildiği gibi u-track analizini ayarlama adımlarını izleyin.
      NOT: Tek parçacık izleme için kritik parametreler, parçacık boyutunun standart sapması (piksel cinsinden) ve boşluk kapatma uzunluğudur. İzleme için en katı ölçütler olarak bu parametreler için sırasıyla 1 ve 0 kullanın.
    2. Bağlanma hızı sabitlerini hesaplamak için, önce zaman içinde membran yüzeyine bağlanan parçacıkların sayısını tahmin edin. Adım 6.1'den elde edilen membranda görünen parçacık sayısını tanımlamak ve çizmek için u-track çıktı klasörüyle birlikte MATLAB dosya binding_SPT (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanın. Gözlemlenen kinetiği uygun kinetik modellere sığdırın (örneğin: zaman sabitini belirlemek için tek üstel uyum, tersi görünür oran sabitine atanabilir)30 hız sabitlerini çıkarmak için (bkz. sonuçlar, Şekil 5).
    3. Difüzyon parçacıklarının ortalama kareli yer değiştirmesi (MSD) (PEG-SLB'lerdeki DNA izleyici gibi, Şekil 6) difüzyonun doğasını gösterir. MSD grafiğini gecikme süresinin bir fonksiyonu olarak elde etmek için u-track çıktı klasörüyle birlikte MATLAB paket MSD_ISD (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanın (Şekil 6B).
    4. Heterojen difüzyon türlerini tanımlamak için, Şekil 6C'de gösterildiği gibi anlık kareli yer değiştirme (ISD) dağılımlarını hesaplayın. (Xt+τ - X t)2 + (Yt+τ− Yt)2 olarak tanımlanan ISD2, burada gecikme süresi, τ = 2, gürültüyü azalttığı için tercih edilir. Gürültüyü azaltmak için üçten az kareye sahip kısa yörüngeleri filtreleyin.
    5. İzlenen parçacıkların ISD'lerini çizmek için u-track çıktısıyla MATLAB'da ISD_analyzer (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanın (Şekil 6C).
  2. Aşağıda açıklandığı gibi tek moleküllü fotobeyazlatma analizi yapın.
    1. Membran komplekslerinin stokiyometrisini tahmin etmek için, floresan komplekslerinin zamana bağlı yoğunlukları üzerinde bir fotobeyazlatma analizi yapın (Video 3). Bunun için, çeviri sürüklenmesini ayıklamak üzere film karelerinin otokorelasyonuna dayalı bir sapma düzeltme algoritması (drift_correct_images, Ek Kodlama Dosyası 2) uygulayın. Bu, monte edilen yapıların görüntü yakalama sırasında büyük ölçüde hareketsiz olduğunu varsayar. Filmlerden partikül yoğunluğu zaman izlerini algılamak için MATLAB paket Extract_traces_1C (Ek Kodlama Dosyası 2) çalıştırın.
    2. Yoğunluk zaman izlemeleri için adım algılamasını gerçekleştirmek üzere MATLAB kod Stepcount_immobile (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanın. Parçacıkların hareketsiz olmaması durumunda, hareketli parçacıkların yerini çıkarmak için u-track paketini kullanın. Bu xy koordinatları seti, membran üzerinde yanal olarak yayılırken hareket eden parçacığın yoğunluk değerlerini çıkarmak için ham filmlerle eşlenebilir. Bu seçenek için u-track analizinden elde edilen çıktıyla utrack_Int (Ek Kodlama Dosyası 2) MATLAB paketini kullanın.
    3. Doğru protein kompleksi stokiyometrisini tahmin etmek için biyomoleküllerin florofor etiketleriyle eksik etiketlenmesi için bir düzeltme yapın. Konsantrasyonu tahmin etmek için boya ve protein emilimini ölçer ölçerek bir UV-VIS spektrofotometresi ile etiketleme verimliliğini belirleyin. Etiketleme verimliliğini, boyanın proteine molar oranı olarak hesaplayın.
      NOT: Bazı boyalar ayrıca 280 nm'ye yakın dalga boylarında da emilir ve bu nedenle, boyanın bu absorpsiyon katkısı konsantrasyon hesaplaması sırasında hesaba katılmalıdır.
    4. Adım 6.2.2'deki adım sayımından elde edilen verilerle MATLAB kod Step_correction (Ek Kodlama Dosyası 2) kullanarak floroforun eksik etiketleme verimliliğini aşağıdaki şekilde hesaba katmak için bir binom düzeltmesi gerçekleştirin. Örneğin, dodecamerik halka benzeri bir yapı oluşturan Cytolysin A gibi gözenek oluşturan bir toksin için, aşağıdaki formülü kullanarak bir binom düzeltmesi uygulayın:
      nkfigure-protocol-19100
      burada figure-protocol-19199 = etiketleme verimliliği, n = fotobeyazlatma adımlarının sayısı ve s = gerçek sayımlar. Düzeltilmiş oligomerik türleri kurtarmak için MATLAB rutin Stepcount_immobile kullanın. Oligomerlerin (si) frekansını kütle fraksiyonlarına dönüştürün (Şekil 7C; Ek Kodlama Dosyası 2).
      NOT: İzlediğiniz çözümlenmiş dosyalar kümesi Ek Kodlama Dosyası 3'te bulunur. Ek Kodlama Dosyası 2'deki MATLAB kodları bu veri kümeleriyle çalıştırılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

ClyA proteininin PEGile membranlara bağlanmasının izlenmesi
Adım 4.5'ten sonra, bağlanma kinetiği, zaman içinde membran yüzeyine bağlanan parçacıkların sayısını çizerek tahmin edilir (Video 1). ClyA proteini% 5 mol% PEG2000 lipitli bir zara bağlandığında, parçacık yoğunluğu artar ve doygunluğa ulaşır (Şekil 5). Bağlı parçacıklara (camgöbeği daireleri) uyan üstel bir bozunum, membran bağlanması için zaman sabitini (τ<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, membrana gömülü biyomoleküller için kalabalık bir ortam ortaya koyan desteklenen lipit çift katmanları (SLB'ler) üzerinde tek moleküllü deneyler gösteriyoruz. Kalabalık ortam, dışlanmış bir hacim etkisi yaratır ve biyomoleküler reaksiyonlarınartmasına yol açar 1,2,39,40. Polimerin öncelikle çift katmanın dışındaki hacmi kapladığı PEG-lipid sistemi için, b...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, ClyA proteini için plazmid ekspresyonunu paylaştığı için Prof. Benjamin Schuler'e teşekkür ediyor. Bu çalışma Human Frontier Science Program (RGP0047-2020) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5 ml SyringesHMD HealthcareDispo Van, 2.5 ml TuberculinPlastic syringe
AcetoneFinar Chemicals10020LL025
Acrylic Sheet2 mm thick
Acrylic SheetBigiMall2 mm, Clear
Bath SonicatorBransonCPX-1800
Calcium Chloride
ChloroformSigma528730 HPLC grade
CholesterolAvanti700100
Coplin JarDuran Wheaton KimbleS60168 Slide Jar with Glass Cover
CoverslipsVWR631-157424 mm X 50 mm
Cy3-DNA StrandIDTGCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3)Cytiva Life SciencesPA23001
DiIInvitrogenD3911Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1Sigma AldrichGCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2Sigma AldrichCGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol StrandBiomersToco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000Avanti8801301,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape3MLF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated)0.5 - 1 mm
Drilling MachineDremel220Workstation
EMCCDAndorDU-897U-CS0-#BV
Fluorescence BeadsInvitrogenF10720
Glass SlidesBlue StarMicro Slides, PIC-1
Glass VialsSigma854190
Hydrogen PeroxideLobachemie0018230% Solution, AR Grade
LaboleneThermo-Fischer Scientific Detergent
Laser 532 nmCoherentSapphire
Laser CutterUniversal Laser SystemsILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPEAvanti8101501,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
MethanolFinar Chemicals30932LL025
MicroscopeOlympusIX81
Phosphate Buffer Saline (PBS)1X
Plasma CleanerHarrick Plasma IncPDC-002
POPCAvanti8504571-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe PumpNew Era Pump SystemsNE1010High Pressure Syringe Pump
PTFE CapsSigma27141
PTFE TubingCole-ParmerWW-06417-21Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric AcidSD Fine Chemicals98%, AR Grade
TIRF ObjectiveOlympusUPLAPO100XOHR
Vacuum DesiccatorTarsons
Vortex MixerTarsons

Referanslar

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006(2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908(2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708(2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264(2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722(2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031(2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047(2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475(2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır