Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

Özet

Burada, primer domuz retinal pigment epitel hücrelerinin in vitro olarak kültürlenmesi için takip edilmesi kolay bir yöntem sunulmaktadır.

Özet

Retina pigment epiteli (RPE), retinadaki koroid ve nöroretina arasında yer alan polarize pigmentli epitel hücrelerinin tek katmanıdır. Fagositoz, besin / metabolit taşınması, A vitamini metabolizması vb. dahil olmak üzere birçok fonksiyon RPE tarafından günlük olarak gerçekleştirilir. RPE hücreleri, rejeneratif kapasitesi çok az olan veya hiç olmayan terminal olarak farklılaşmış epitel hücreleridir. RPE hücrelerinin kaybı, yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi görme bozukluğuna yol açan çoklu göz hastalıklarına neden olur. Bu nedenle, RPE'ye hücre hatlarından daha çok benzeyen primer RPE hücrelerinin in vitro kültür modelinin oluşturulması, RPE hücrelerinin karakteristik ve mekanik çalışmaları için kritik öneme sahiptir. İnsan gözbebeklerinin kaynağının sınırlı olduğu gerçeğini göz önünde bulundurarak, birincil domuz RPE hücrelerini kültürlemek için bir protokol oluşturuyoruz. Bu protokolü kullanarak, RPE hücreleri yetişkin domuz gözbebeklerinden kolayca ayrılabilir. Daha sonra, bu ayrışmış hücreler kültür tabaklarına / eklerine bağlanır, akıcı bir tek katman oluşturmak için çoğalır ve epitel dokusunun temel özelliklerini in vivo olarak 2 wks içinde hızla yeniden oluşturur. qRT-PCR ile, birincil domuz RPE hücrelerinin doğal RPE dokusu ile karşılaştırılabilir seviyelerde çoklu imza genleri eksprese ettiği, bu genlerin çoğunun ekspresyonlarının insan RPE benzeri hücrelerde, ARPE-19'da kaybolduğu / yüksek oranda azaldığı gösterilmiştir. Ayrıca, immünofloresan boyama, sıkı birleşme, doku polaritesi ve sitoiskelet proteinlerinin dağılımını ve ayrıca kültürlenmiş primer hücrelerde A vitamini metabolizması için kritik bir izomeraz olan RPE65'in varlığını gösterir. Toplamda, RPE fizyolojisini anlamak, hücre toksisitelerini incelemek ve ilaç taramalarını kolaylaştırmak için iyi bir model olarak hizmet edebilecek yüksek saflıkta ve doğal RPE özelliklerine sahip birincil domuz RPE hücrelerinin kültürüne takip edilmesi kolay bir yaklaşım geliştirdik.

Giriş

Retinal pigment epiteli (RPE), retina^1'in dış tabakasındaki fotoreseptörler ve koryokapillaris arasında bulunur ve kan-retinal bariyerin oluşturulması, besin maddelerinin ve retinal metabolitlerin taşınması ve değişimi, normal bir görme döngüsünü sürdürmek için A vitamininin geri dönüşümü ve fagositoz ve dökülen fotoreseptör dış segmentlerinin (POS'lar) temizlenmesi gibi birçok fonksiyona ^sahiptir2,3 . POS'lar görme üretmek için sürekli kendini yenilemeyi gerektirdiğinden, RPE hücrelerinin retinal homeostazı korumak için sürekli olarak ayrılmış POS'ları yutması gerekir⁴. Bu nedenle, RPE disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)⁴, retinitis pigmentosa (RP)⁵, Leber konjenital amaurozus⁶, diyabetik retinopati⁷ gibi birçok kör edici göz hastalığına neden olur. Şimdiye kadar, bu hastalıkların çoğunun kesin patogenezi belirsizliğini korumaktadır. Sonuç olarak, RPE hücre biyolojisini, patolojik değişiklikleri ve altta yatan mekanizmaları incelemek için RPE hücre kültürü kurulmuştur.

Hücre biyolojisini incelemek için en basit model olarak, RPE hücrelerinin kültürü 1920'lerin^8'i kadar erken bir tarihte başlatıldı. ARPE-19, RPE hücreleri olarak yaygın olarak kullanılmasına rağmen, pigmentasyon kaybı, parke taşı morfolojisi ve özellikle bu hücre hattındaki bariyer fonksiyonları birçok endişeyi gündeme getirmektedir⁹. Buna karşılık, birincil insan RPE hücrelerinin kültürü, fizyolojik ve patolojik çalışmalar için daha gerçekçi bir senaryo sunmaktadır⁹. Bununla birlikte, nispeten sınırlı kullanılabilirlik kullanımlarını kısıtlar ve etik sorunlar her zaman mevcuttur. Ek olarak, birkaç grup RPE hücrelerini kültürlemek için fare modellerini kullandı. Bununla birlikte, fare gözünün boyutu küçüktür ve tek bir kültür genellikle uygun olmayan birçok fare gerektirir⁹. Son zamanlarda, bilim adamları insan embriyonik kök hücrelerini kullanmak için yeni yöntemler geliştirdiler veya RPE hücrelerini türetmek için pluripotent kök hücreleri indüklediler. Bu teknik kalıtsal RPE bozukluklarının tedavisi için özel bir potansiyele sahip olmasına rağmen, zaman alıcıdır ve olgun RPE hücrelerinin üretilmesi genellikle birkaç ay gerektirir¹⁰. Bu sorunların üstesinden gelmek için, burada laboratuvarda rutin olarak yüksek saflıkta RPE hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için takip edilmesi kolay bir protokol sunuyoruz. Uygun kültür koşulları altında, bu hücreler tipik RPE fonksiyonları gösterebilir ve tipik RPE morfolojileri sergileyebilir. Bu nedenle, bu kültür yöntemi RPE fizyolojisini anlamak, sitotoksisiteyi incelemek, ilgili oküler hastalıkların patolojik mekanizmalarını araştırmak ve ilaç taramaları yapmak için iyi bir model sağlayabilir.

Protokol

Deney hayvanlarının kullanımı, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) düzenlemelerine uygun ve Xiamen Üniversitesi Deneysel Hayvan Yönetimi Etik Kurulu tarafından onaylandı.

1. Deneysel cerrahi cihazların, doku sindirim enziminin ve hücre kültürü tamponunun hazırlanması

1. Göz küresi diseksiyonundan bir gün önce iki çift oftalmik cerrahi makas ve forseps temizleyerek ve otoklavlayarak ve daha sonra kutuyu gece boyunca 65 ° C'de genel protokollü bir fırında cerrahi cihazlarla kurutarak deneysel cerrahi cihazları hazırlayın.
2. Kültür medyası hazırlama.
   1. % 10 (v / v) fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin ve% 1 (v / v) penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (100 U / mL) ile desteklenmiş DMEM / Temel ortam hazırlayın.
   2. % 1 (v / v) FBS ve% 1 (v / v) penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (100 U / mL) ile desteklenmiş DMEM / F12 ortamını hazırlayın.
   3. MEM alfayı 2 mM L-glutamin,% 1 FBS,% 1 (v / v) penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (100 U / mL), 0.1 mM NEAA,%¹ (v / v) N1 takviyesi, taurin (0.25 mg / mL), hidrokortizon (20 ng / mL), triiodo-tironin (0.013 ng / mL) ve 10 mM nikotinamid ile destekleyerek MEM-Nic 11'i hazırlayın.
      NOT: Hücre canlılığını ve çoğalmasını iyileştirmek için, sindirim enzimlerini nötralize etmek ve ayrışmış hücreleri tohumlamak için FBS yüzdesi% 20'ye yükseltilebilir. Uzun süreli hücre kültürü için, FBS yüzdesi% 1 kadar düşük bir seviyeye ^{düşürülebilir12}.
3. Deney sırasında doku sindirim enzimi aliquot'u (0.91 mM EDTA ile desteklenmiş% 0.25 (w / v) Tripsin / EDTA çözeltisi, bundan böyle Tripsin / EDTA çözeltisi olarak anılacaktır) çözün.
   NOT: Optimum sonuçlar elde etmek için her seferinde taze Tripsin/EDTA çözeltisi kullanılmalıdır. Her 15 mL steril santrifüj tüpüne 10 mL taze Tripsin/EDTA çözeltisi verin ve alikotları -20 °C buzdolabında kullanıma kadar dondurun.
4. Diseksiyon çözümü.
   1. %2 (v/v) penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 U/mL) ile desteklenmiş 1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Sürün (PBS) (pH 7.2) çözeltiyi 0,22 μm şırınga filtre ünitesinden filtreleyerek sterilize edin.
5. Kültür plakalarını ve transwell eklerini kaplayın.
   1. Kuyucukları ve transwell uçlarını 1x PBS ile yıkayın. PBS'yi bir pipetle kuyucuklardan ve transwelllerden çıkarın ve ardından alt odaya 1 mL taze 1x PBS ve üst odaya 600 μL 10 μg / mL laminin çözeltisi ekleyin.
   2. Hücre kültürü inkübatöründeki plakaları/transwell eklerini gece boyunca 37 °C ve %5 CO_{2'de inkübe edin}. Laminin çözeltisini üst odadan çıkarın ve hücreleri tohumlamadan önce iki kez 1 mL soğuk 1x PBS ile yıkayın.

2. Domuz göz küresi RPE hücrelerinin diseksiyonu

1. Aletlerin hazırlanması.
   1. Laminer davlumbaz %75 etanol ve UV ışığı ile temizleyin. ~25 mL %75 etanol içeren üç adet 50 mL steril santrifüj tüpü, ~25 mL 1x PBS içeren üç adet 50 mL steril santrifüj tüpü ve ~15 mL 1x PBS içeren üç adet 10 cm'lik steril hücre kültürü kabı hazırlayın.
      NOT: Bu ayarlar genellikle dört domuz gözbebeğini diseke etmek için kullanılır. Lütfen daha fazla göz küresi kullanıldığında ölçeği artırın. Hücre canlılığını artırmak için, buz üzerinde 1x PBS tamponunu en az 30 dakika önceden soğutun. Deneysel aletlerin ve hücrelerin kirlenmemesini sağlamak için hem %75 etanol hem de UV ışığı gereklidir. Tüm ameliyat masasını en az 15 dakika sterilize etmek için UV lambasını önceden açın.
2. Domuz gözbebeklerini temizleyin.
   1. Bir mezbahadan taze göz küreleri alın ve diseksiyona kadar buz üzerinde tutun. Dört domuz gözküresini 10 cm'lik bir Petri kabında ~ 15 mL% 75 etanol içine batırın ve tüm artık bağ dokularını ve kaslarını kesmek için bir çift makas ve forseps kullanın.
      NOT: Kontaminasyonları azaltmak için skleranın dışından mümkün olduğunca fazla doku çıkarın. Dekontaminasyon ve yıkama adımı sırasında göz kürelerinin transferini kolaylaştırmak için optik siniri şu anda kesmeyin. Bu adımdan sonra, tüm prosedürler laminer bir akış başlığında yapılmalıdır.
3. Domuz göz kürelerini, dört domuz gözbebeğini% 75 etanol ile doldurulmuş üç adet 50 mL steril santrifüj tüpünde sıralı bir şekilde ıslatarak ve yıkayarak dekontamine edin; Her göz küresi, her tüpte en az 5 dakika boyunca daldırılır. Daha sonra, domuz gözbebeklerini 1x PBS ile doldurulmuş üç adet 50 mL steril santrifüj tüpünde sıralı bir şekilde yıkayın; Her bir göz küresini her tüpte en az 5 dakika yıkayın (Şekil 1A). Göz kürelerini iyice yıkamak için tüpleri her dakika ters çevirin.
4. Domuz gözbebeklerinin diseksiyonu.
   1. Dört domuz gözbebeğini 1x PBS içeren 10 cm'lik steril bir hücre kültürü kabına taşıyın. Optik siniri ve küçük kalıntıları çıkarmak için her bir göz küresinin dış yüzeyini tekrar kesin (Şekil 1B). Limbus ve skleranın kesiştiği noktada küçük bir kesim yapmak için makas kullanın ve ardından kornea, iris, lens, vitreus gövdesi ve nöral retinayı çıkarın (bu dokuların ayrıntılı yapıları için lütfen Şekil 1'e bakın).
   2. RPE-choroid-sklera kompleksini yeni bir 10 cm'lik hücre kültürü kabına aktarın ve vizör kapağını dört yapraklı yonca şeklinde düzleştirmek için dört kesim yapın (Şekil 1C).
5. Dört RPE-koroid-sklera kompleksini 10 cm'lik yeni bir kaba yerleştirerek Tripsin/EDTA çözeltisi sindirimini gerçekleştirin. RPE-koroid-sklera komplekslerini birleştirmek için 20 mL taze Tripsin / EDTA çözeltisi dökün ve çanağı ~ 30 dakika boyunca 37 ° C'de hücre kültürü inkübatörüne koyun.
   NOT: RPE hücrelerini ayırmak için taze Tripsin/EDTA çözeltisi kullanın. Tripsin / EDTA çözeltisinin sindirim süresini dikkatlice kontrol edin, çünkü daha uzun bir inkübasyon süresi (30 dakikadan fazla) diğer hücre türlerinin kontaminasyonunu artırabilir.

3. Domuz göz küresi RPE hücrelerinin izolasyonu ve kültürü

1. RPE ayrışması.
   1. Tripsin / EDTA çözeltisi ile 30 dakikalık inkübasyondan sonra kabı inkübatörden çıkarın ve Tripsin / EDTA çözeltisini nötralize etmek için kaba 20 mL önceden ısıtılmış kültür ortamı (% 10 FBS ile) ekleyin.
      NOT: Bu adımda, yalnızca DMEM/Basic ortamı kullanılır. Hücreler akıcılığa ulaştığında, deneysel koşullara bağlı olarak üç kültür ortamı kullanılabilir: DMEM / Temel ortam, DMEM / F12 ortamı ve MEM-Nic ortamı.
   2. RPE hücrelerini birkaç kez hafifçe pipetle çekerek ayırmak için 5 mL'lik bir aktarım pipeti kullanın. Hücre süspansiyonlarını 15 mL santrifüj tüplerine toplayın. Mümkün olduğunca çok RPE hücresi elde etmek için hafifçe pipetleme yaparak çanak üzerindeki RPE-koroid-sklera komplekslerini yıkamak için başka bir 10 mL taze kültür ortamı (%10 FBS) kullanın.
      NOT: Hücreleri çok kuvvetli bir şekilde tritüre etmeyin. Pipetin yaklaşık 3 mL/s oranında doldurulup boşaltıldığından emin olun. Hücre süspansiyonunu köpürtmekten kaçının.
2. Tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ederek RPE hücrelerini toplayın. Bir pipet kullanarak süpernatantı aspire edin ve hücreleri yeniden askıya almak ve 5 dakika daha 200 x g'de santrifüj yapmak için 5 mL kültür ortamı (% 10 FBS) ekleyin. Süpernatantı boşaltın ve hücreleri 12 mL kültür ortamı ile yeniden askıya alın.
   NOT: Süpernatanı aspire ederken, hücre kümelerinin kırılmasını önlemek için yaklaşık 1 mL ortam bırakın.
3. RPE hücrelerinin tohumlanması.
   1. Tohum ~ 1-2 x 10⁵ hücre / kuyu 12 delikli kültür plakalarına veya transwell eklerine. Genellikle, dört domuz göz küresinden yaklaşık 1.5 x 10⁶ RPE hücresi elde edilir. Kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin ve hücreler kuyucukların / eklerin yüzeyini tamamen kapladığında serum konsantrasyonunu% 1'e düşürün.
      NOT: Hücreler kültür kabına/eklerine yapışmadan önce hücre kültürü çanağını çok sık hareket ettirmeyin.
4. Hücreler toplanana kadar kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin.
   NOT: FBS konsantrasyonu, hücreler akıcılığa ulaştıktan sonra azaltılabilir ve hücreler tam farklılaşma ve olgunlaşmaya izin vermek için birkaç aya kadar kültürlenebilir.

4. Primer domuz RPE hücrelerinin karakterizasyonu

1. Hücreleri 1 veya 2 wks için akıcılıkta kültürleyin ve daha sonra daha fazla analiz için hücreleri toplayın.
2. Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) analizi için hücreleri toplayın.
   1. Kültür ortamını çıkarın, hücreleri 1 mL soğuk 1x PBS ile yıkayın ve ardından yaklaşık 1 x 10⁶ hücreden hücre lizatı toplamak için her bir oyuğa 500 μL RNA ekstraksiyon çözeltisi ekleyin.
   2. mRNA^13'ü ekstrakte edin; Her numuneden yaklaşık 4 μg RNA ekstrakte edilir. Ters transkripsiyon¹⁴ gerçekleştirmek için 100 ng mRNA kullanın; kantitatif gerçek zamanlı PCR analizi için cDNA'yı 40 kat seyreltin. Astarlar Tablo 1'de listelenmiştir.
3. İmmünofloresan boyama için hasat hücreleri.
   1. Kültür ortamını çıkarın, hücreleri 1 mL soğuk 1x PBS ile yıkayın ve daha sonra hücreleri (yaklaşık 1 x 10⁶ hücre / kuyu) oda sıcaklığında 30 dakika sabitlemek için 1x PBS'ye 500 μL% 4 (w / v) paraformaldehit ekleyin. Daha sonra, hücreleri iki kez 1x PBS ile yıkayın ve gece boyunca 4 ° C'de birincil antikorlarla (% 1 (w / v) sığır serum albümini ile desteklenmiş 1x PBS'de 1: 100) ve ikincil antikorlarla (% 1 (w / v) sığır serum albümini ile desteklenmiş 1x PBS'de 1: 200) immünofloresan boyama işlemini gerçekleştirin ve çevrimiçi protokollere göre 2 saat oda sıcaklığında 2 saat boyunca ikincil antikorlar (¹: 200 % (w / v) sığır serum albümini ile desteklenmiştir).
   2. İmmünofloresan görüntüler, çevrimiçi kılavuz^16'yı takip eden bir konfokal mikroskop ile elde edilir.
4. Batı leke analizi için hasat hücreleri.
   1. Kültür ortamını çıkarın, hücreleri iki kez soğuk 1x PBS ile yıkayın ve ardından her bir oyuğa 80 μL RIPA tamponu (1x Proteaz inhibitörü ile) ekleyin ve bulaşıklardan / eklerden yaklaşık 1 x 10⁶ hücre çizmek için hücre kazıyıcıları kullanın.
   2. Hücre lizatını her bir kuyucuktan / ekten 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Hücre lizatlarını 10 dakika kaynatın ve ardından BCA kitlerini kullanarak protein konsantrasyonlarını ölçün; Her numunenin protein konsantrasyonu yaklaşık 2 mg / mL'dir. Çevrimiçi protokoller^17'ye göre Western leke analizi için her numunenin 25 μg proteinini kullanın.
   3. Western blot için, membranları dönen çok amaçlı bir çalkalayıcıda gece boyunca 4 °C'de 5 mL birincil antikor çözeltisinde (1x TBST çözeltisinde 1:1.000 primer antikorların seyreltilmesi,% 5 (w / v) sığır serum albümini ile desteklenmiş) inkübe edin.
   4. Daha sonra, membranı, kullanılan birincil antikor kaynağına göre, bir orbital çalkalayıcıda 2 saat boyunca oda sıcaklığında% 5 (w / v) yağsız süt ile desteklenmiş 1x TBST çözeltisinde 1: 5.000 ikincil antikor çözeltisinde yaklaşık 15 mL anti-tavşan veya fare karşıtı ikincil antikor çözeltisi (1: 5.000 seyreltilmesi) ile inkübe edin.
5. Transepitelyal direnç (TER) ölçümü.
   1. Çubuk elektrotları %70 etanol ve steril 1x PBS ile sıralı bir şekilde yıkayın. Daha sonra elektrotun kısa ucunu üst bölmeye ve daha uzun ucunu transwell eklerinin alt odasına yerleştirin ve ölçümler için epitel voltmetresindeki düğmeye tıklayın. Her bir kuyucuğun TER ölçümlerini üçlü olarak kaydedin.

Sonuçlar

Primer porsin RPE (pRPE) hücreleri DMEM/Basic ortamında %10 FBS ile kültürlendi ve ışık mikroskobu altında hücre morfolojisi tohumlamadan sonra 2 gün (Şekil 2A), 6 gün (Şekil 2B) ve 10 günde (Şekil 2C) fotoğraflandı. 1 wk'dan sonra, parke taşı morfolojileri olan pigmentli pRPE hücrelerinin birleşik bir tek katmanı gözlendi.

Primer pRPE hücrelerini daha iyi karakterize etmek için, ...

Tartışmalar

Burada, RPE hücrelerinin domuz gözbebeklerinden izolasyonu, kültürü ve karakterizasyonu için ayrıntılı ve optimize edilmiş bir protokol, RPE hücrelerinin in vitro karakterizasyonu ve RPE ile ilişkili bozukluk çalışmaları için iyi bir model oluşturmaktadır. RPE'nin insan, fare ve sıçan gözlerinden izole edilmesi için yöntemler daha önce ^23,24,25 olarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bazı ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARPE-19 cells	CCTCC	GDC0323
Bovine serum albumin	Yeasen	36101ES60
Confocal microscopy	Zeiss	LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch	Bio-Rad	1708370
Cell scraper	Sangon	F619301
10 cm culture dish	NEST	121621EH01
12-well culture plate	NEST	29821075P
DMEM F12 Medium	Gibco	C11330500BT
DMEM basic Medium	Gibco	C11995500BT
EVOM2	World Precision Instruments	EVOM2	For TER measurement
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	5196-2504
hydrocortisone	MCE	HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)	ThermoFisher Scientific	62249
LightCycler 96 Instrument	Roche	5815916001
Liothyronine	MCE	HY-A0070A/CS-4141
laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium	Gibco	10566-016
MEM NEAA(100X)	Gibco	11140-050
Millex-GP syringe filter unit	Millipore	SLGPR33RB
N1	Sigma-Aldrich	SLCF4683
NcmECL Ultra	New Cell&Molecular Biotech	P10300
Non-fat Powdered Milk	Solarbio	D8340
Nicotinamide	SparkJade	SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody	Abcam	ab76020	Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)	Epizyme	PG112
primary Human RPE cells	-	-	Generous gift from Shoubi Wang lab
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Prism	GraphPad by Dotmatics	version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails	APExBIO	K1024
PRE65 antibody	Proteintech	17939-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-390172	Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)	RARBIO	RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	Toyobo	FSQ-201
RIPA buffer	ThermoFisher Scientific	89900
15 mL sterile centrifuge tubes	NEST	601052
50 mL sterile centrifuge tubes	NEST	602052
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Taurine	Damas-beta	107-35-7
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR430A
12-well transwell inserts	Labselect	14212
VEGF antibody	Proteintech	19003-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit	Novusbio	VAL106
ZO-1 antibody	ABclonal	A0659	Recognize both human and porcine proteins