Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Özet

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Özet

Hücrelerin dış sinyallere cevap verme yeteneği, hücresel gelişim, büyüme ve hayatta kalma için gereklidir. Ortamdan gelen bir sinyale yanıt vermek için, bir hücre onu tanıyabilmeli ve işleyebilmelidir. Bu görev esas olarak, rolü sinyalleri hücrenin biyokimyasal diline dönüştürmek olan membran reseptörlerinin işlevine dayanır. G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), insanlarda membran reseptör proteinlerinin en büyük ailesini oluşturur. GPCR'ler arasında, metabotropik glutamat reseptörleri (mGluR'ler), zorunlu dimerler olarak işlev gören ve ligand bağlanma bölgesini içeren geniş bir hücre dışı alana sahip benzersiz bir alt sınıftır. mGluR'lerin yapısal çalışmalarındaki son gelişmeler, aktivasyon süreçlerinin anlaşılmasını geliştirmiştir. Bununla birlikte, aktivasyon ve modülasyon sırasında mGluR'ler yoluyla büyük ölçekli konformasyonel değişikliklerin yayılması tam olarak anlaşılamamıştır. Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET), biyomoleküllerin yapısal dinamiklerini tek protein seviyesinde görselleştirmek ve ölçmek için güçlü bir tekniktir. mGluR2 aktivasyonunun dinamik sürecini görselleştirmek için, reseptörlerin doğal yapısını bozmadan bölgeye özgü protein etiketlemesine izin veren doğal olmayan amino asit (UAA) entegrasyonuna dayanan floresan konformasyonel sensörler geliştirilmiştir. Burada açıklanan protokol, yeni UAA etiketleme yaklaşımı, numune hazırlama ve smFRET veri toplama ve analizi dahil olmak üzere bu deneylerin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır. Bu stratejiler genelleştirilebilir ve çeşitli membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini araştırmak için genişletilebilir.

Giriş

Plazma zarı boyunca bilgi aktarımı büyük ölçüde membran reseptörlerinin işlevine bağlıdır¹. Bir reseptöre bağlanan ligand, konformasyonel bir değişikliğe ve reseptör aktivasyonuna yol açar. Bu süreç genellikle doğada allosteriktir². 800'den fazla üyesi olan G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), insanlarda membran reseptörlerinin en büyük ailesidir³. Neredeyse tüm hücresel süreçlerdeki rolleri nedeniyle, GPCR'ler terapötik gelişim için önemli hedefler haline gelmiştir. GPCR sinyallemesinin kanonik modelinde, agonist aktivasyonu, daha sonra G_α nükleotid bağlanma cebinde GTP için GDP ....

Protokol

Protokolün genel iş akışı Şekil 1'de açıklanmıştır.

1. Numune odasının hazırlanması

1. Sürgü ve kapak kayması temizliği
   NOT: Bu adımlar, kızakların yüzeylerini ve kapak kaymalarını temizlemeyi ve bunları aminosilanizasyona hazırlamayı amaçlamaktadır. Yüzeye bağlı moleküller üzerinde tek moleküllü floresan deneyleri yapmak için kritik bir gereklilik, pasifleştirilmiş bir yüzeydir. En güvenilir ve tekrarlanabilir pasivasyon tekniği, inert polimer zincirlerinin cam yüzeye yoğun bir tabaka olarak kovalent olarak tutturulmasını içerir. Polietilen glikol (PEG), yüzey pasivasyonu için kullanılan en verim....

Sonuçlar

UAA tabanlı FRET sensörünün ekspresyon ve floresan etiketlemesi
Burada, mGluR2 (548UAA) CRD'si içinde bir UAA'nın (AZP) yerleştirilmesi ve floresan etiketlemesinin örnek sonuçları tartışılmıştır¹¹. Daha önce de belirtildiği gibi, AZP'yi mGluR2'ye yerleştirmek için, modifiye edilmiş bir tRNA sentetaz ve tamamlayıcı tRNA (pIRE4-Azi) içeren mühendislik translasyonel makinesinin ve mutagenez kullanılarak oluşturulan 548 pozisyonunda bir amber kodon içere.......

Tartışmalar

GPCR'ler, sinyal iletimini başlatmak için hücre zarı üzerinde çalışan proteinlerdir. Birçok GPCR, birden fazla alandan oluşur ve sinyalleme, etki alanları arasındaki işbirlikçi etkileşime bağlıdır. Bu membran reseptörlerinin özelliklerini modüle etmek için, çoklu alanların dinamik davranışını anlamak önemlidir. Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET), protein konformasyonu ve dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak ölçülmesini sağlayan bir floresan tekniğidir

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate	Sigma Aldrich	Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine	Chem-Impex International	Cat # 06162
548UAA	Liauw et al. 2021		Transfected construct
Acetic Acid	Fisher Chemical	64-19-7
Acetone	Fisher Chemical	67-64-1
Adobe Illustrator (2022)	https://www.adobe.com/	RRID:SCR_010279	Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride)	Cayman Chemical	81530
Aminosilane	Aldrich	919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L	Fisher Scientific		Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG	Laysan Bio Inc	Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES	Click Chemistry Tools	1237-500
Copper (II) sulfate	Sigma Aldrich	Cat # 451657-10G
Cover slip	VWR	16004-306	Sample chamber
Cy3 Alkyne	Click Chemistry Tools	TA117-5
Cy5 Alkyne	Click Chemistry Tools	TA116-5
DDM	Anatrace	Part# D310 1 GM	Detergent
DDM-CHS (10:1)	Anatrace	Part# D310-CH210 1 ML	Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	SH30070.03
Di01-R405/488/561/635	Semrock		Notch filter
DMEM	Corning	10-013-CV
EMCCD	Andor	DU-897U	Camera
ET542lp	Chroma		Long pass emission filter
FF640-FDi01	Semrock		Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody	Genscript	A01429
Fluorescent bead	Invitrogen T7279	TetraSpeck microspheres	Spherical bead
Glass slides	Fisherfinest	12-544-4	sample chamber
Glutamate	Sigma Aldrich	Cat # 6106-04-3
HEK 293T	Sigma Aldrich	Cat # 12022001	Cell line
HEPES	FisherBioReagents	7365-45-9
Image splitter	OptoSplit II
KOH	Fluka	1310-58-3
Laser	Oxxius		4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000015	Transfection Reagent
Methanol	Fisher Chemical	67-56-1
Microscope	Olympus	Olympus IX83
Milli-Q water	Barnstead		Water Deionizer
m-PEG	Laysan Bio Inc	Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635	Semrock		Dichroic mirror
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	51985091	Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)	https://www.originlab.com/	RRID:SCR_014212	Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
pIRE4-Azi	Addgene	Plasmid # 105829	Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma Aldrich	Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA)	HWI group	99-50-3
smCamera (Version 1.0)	http://ha.med.jhmi.edu/resources/		Camera software
Sodium bicarbonate	FisherBioReagents	144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	1310-73-2
Syringe filter	Whatman UNIFLO	Cat#9914-2502	Liquid filtration
Trolox	Sigma	53188-07