Farelerde İntratimik Enjeksiyon için Minimal İnvaziv, Doğru ve Etkili Bir Teknik

Özet

Bu protokol, açık cerrahi riskini önlemek ve kör perkütan enjeksiyonların doğruluğunu artırmak için farelerde intratimik enjeksiyon için oluşturulan girişimsel bir radyoloji prosedürünü tanımlamaktadır.

Özet

Fare modellerinde intratimik enjeksiyon, genetik ve edinilmiş T hücre bozuklukları da dahil olmak üzere timik ve bağışıklık fonksiyonlarını incelemek için önemli bir tekniktir. Bu, reaktiflerin ve / veya hücrelerin canlı farelerin timusuna doğrudan birikmesi için yöntemler gerektirir. Geleneksel intratimik enjeksiyon yöntemleri, her ikisi de önemli sınırlamalara sahip olan göğüs cerrahisi veya minimal invaziv perkütan kör enjeksiyonları içerir. Ultra yüksek frekanslı ultrason görüntüleme cihazları, farelerde görüntü rehberliğinde perkütan enjeksiyonları mümkün kılarak perkütan enjeksiyon yaklaşımının enjeksiyon doğruluğunu büyük ölçüde artırmış ve daha küçük hedeflerin enjeksiyonunu sağlamıştır. Bununla birlikte, görüntü kılavuzlu enjeksiyonlar, entegre bir raylı sistemin kullanımına dayanır ve bu da bunu katı ve zaman alıcı bir prosedür haline getirir. Farelerde perkütan intratimik enjeksiyonlar için benzersiz, güvenli ve etkili bir yöntem burada sunulmakta ve enjeksiyonlar için raylı sisteme olan bağımlılığı ortadan kaldırmaktadır. Teknik, fare timusunu invaziv olmayan bir şekilde görüntülemek için yüksek çözünürlüklü bir mikro-ultrason ünitesi kullanmaya dayanır. Serbest el tekniği kullanarak, bir radyolog sonografik rehberlik altında doğrudan fare timusuna bir iğne ucu yerleştirebilir. Fareler görüntülemeden önce temizlenir ve anestezi altına alınır. Ultrason rehberliğindeki prosedürlerde usta deneyimli bir radyolog için, belirtilen tekniğin öğrenme süresi, tipik olarak bir seansta oldukça kısadır. Yöntem, fareler için düşük morbidite ve mortalite oranına sahiptir ve perkütan enjeksiyon için mevcut mekanik destekli tekniklerden çok daha hızlıdır. Araştırmacının, hayvan üzerinde minimum stresle her büyüklükteki (yaşlı veya immün yetmezlikli farelerin timusları gibi çok küçük organlar dahil) timüzlerin hassas ve güvenilir perkütan enjeksiyonlarını verimli bir şekilde gerçekleştirmesini sağlar. Bu yöntem, istenirse bireysel lobların enjeksiyonunu sağlar ve prosedürün zaman kazandıran doğası nedeniyle büyük ölçekli deneyleri kolaylaştırır.

Giriş

Timus, T hücresi gelişimi ve bağışıklığında önemli bir role sahiptir. Timik evrim, genetik bozukluklar, enfeksiyonlar ve kanser tedavilerinin neden olabileceği T hücre eksikliği, diğer faktörlerin yanı sıra, yüksek mortalite ve morbiditeye yol açmaktadır ^1,2. Fare modelleri hem temel hem de translasyonel immünoloji araştırmalarında vazgeçilmezdir ve timik biyoloji ve T hücresi gelişimini incelemek ve ayrıca timik disfonksiyon ve T hücre eksikliğinden muzdarip olanlar için tedaviler geliştirmek için onlarca yıldır kullanılmaktadır ^3,4,5.

Timik araştırmaların merkezi bir kısmı, fare modellerinde hücreler, genler veya proteinler gibi biyolojik materyallerin intratimik enjeksiyonu olmuştur 6,7,8,9,10,11,12. Konvansiyonel intratimik enjeksiyon yöntemleri, torakotomi ve ardından doğrudan görselleştirme altında intratimik enjeksiyon veya mediastenin içine "kör" perkütan enjeksiyon kullanır. Cerrahi yaklaşım, diğerlerinin yanı sıra pnömotoraks riskini önemli ölçüde artırır. Dahası, bu ameliyat sırasında artan stres immünsüpresyona neden olur, böylece potansiyel olarak immünolojik verilerden ödün verir¹³. Deneyimli araştırmacılar, bazı uygulamalardan sonra, kör enjeksiyon tekniğini uygulayabilirler, ancak bu yaklaşım daha az doğrudur ve bu nedenle deneysel konuları büyük bir timuslu genç farelerle sınırlar.

Ultrason rehberliğinin kullanımı, geleneksel intratimik enjeksiyon yaklaşımlarına kesin ve minimal invaziv bir alternatif olarak tanıtılmıştır¹⁴. Bununla birlikte, serbest el tekniği yerine entegre raylı sistem kullanıldığında bu prosedür çok zaman alıcıdır. Enjeksiyon montajı ile enjeksiyonların gerçekleştirilmesi, dikkatli görüntüleme optimizasyonu ve dönüştürücü standı ve montajı, X, Y ve Z konumlandırma sistemi gibi çeşitli ataşmanların yardımıyla dönüştürücünün konumlandırılmasını ve ayrıca mikro manipülasyon kontrollerinin ve ray sistemi uzantılarının yetkin bir şekilde çalışmasını gerektirir. Basit bir alternatif teknik olan ultrason rehberliğinde timik enjeksiyon, burada bir radyolog tarafından yukarıda açıklanan yöntemlere hem hızlı hem de doğru minimal invaziv bir alternatif olan serbest el yaklaşımı¹⁵ kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Daha da önemlisi, mevcut yaklaşım, enjeksiyon montajına ve entegre raylı sisteme ihtiyaç duymadan herhangi bir yüksek çözünürlüklü ultrason görüntüleme sistemi ile gerçekleştirilebilir. Özellikle çok sayıda farenin enjekte edilmesini gerektiren çalışmalar için^{yararlıdır 11}, her iki timik lobun enjeksiyonunu içeren deneyler için veya yaşlı, ışınlanmış veya bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde küçük timüslerin doğru enjeksiyonu^{için 12}.

Protokol

Tüm prosedürler, Keşif ve İnovasyon Merkezi'ndeki (IACUC protokolü 290) hayvan bakımı kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, C57BL/6 fareler (dişi, 4-6 haftalık), C57BL/6 fareler (dişi, 6 aylık), J:NU dişi fareler, NOD scid gama (NSG) dişi fareler ve B6; CAG-luc, -GFP fareler sırasıyla genç fare modeli, yaşlı fare modeli, atimik çıplak model, immün yetmezlik modeli ve biyolüminesans hücre kaynağı olarak kullanılmıştır. Fareler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Bu prosedür tipik olarak iki kişi gerektirecektir (biri enjeksiyonları gerçekleştirirken steril kalmak ve diğeri fareleri idare etmek için).

1. Hayvan hazırlığı

1. %3-%4 izofluran gazı kullanarak farelerde anesteziyi indükleyin ve burun konisi ve hassas kalibre edilmiş buharlaştırıcı ile uygulanan %1-%3 izofluran gazı kullanarak anesteziyi sürdürün (bkz.
2. Arka pençe sıkışmasına yanıt vermeyerek uygun anestezik derinliği / bilinçsizliği onaylayın.
3. Kürkü, farelerin ön göğüs bölgesinden, 1 dakikadan daha kısa bir süre boyunca ince bir tüy dökücü krem tabakası uygulayarak çıkarın. Kremayı gevşek kürkle birlikte tamamen çıkarmak için ıslak bir kağıt havlu kullanın.
   NOT: Çok fazla krem uygulamak göğüs bölgesi cildinin iltihaplanmasına neden olur.
4. Her seferinde bir fareyi, sırtüstü olarak, küçük hayvan ultrason görüntüleme istasyonunun ısıtılmış platformuna yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) burun konisi yerinde olacak şekilde (Şekil 1).
5. Fareyi arka ve ön ayaklarda tıbbi yapışkan bant ile sahneye sabitleyin (Şekil 1).
6. Kornea kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
7. Kürksüz üst toraks derisini bir klorheksidin glukonat aplikatörü kullanarak dezenfekte edin (bkz.

2. Ultrason makinesinin ve steril alanın hazırlanması

1. Mevcut en yüksek frekanslı lineer probu, tipik olarak görüntülenen hayvanın büyüklüğü için en yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip probu etkinleştirin. Başlangıç ekranından sonra ilgili düğmeye dokunarak probu etkinleştirin.
   NOT: Farelerle yapılan bu uygulama için, kullanılan prob özellikle fareler ve küçük sıçanlarla kullanılmak üzere tasarlanmıştır (bkz.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek görüntüleme ve enjeksiyon için ultrason ayarlarını optimize edin.
   1. Ekranın sağ tarafındaki dikey yönelimli kaydırıcıları ayarlayarak görüş alanının derinliğini hedef hayvan için uygun bir boyuta ayarlayın (Şekil 2). Maksimum derinlik ayarı, genç fareler için tipik olarak yaklaşık 6-8 mm olacaktır.
   2. Düğmeyi ekranın altındaki yatay çubuk boyunca kaydırarak gri tonlama kazancını ayarlayın (Şekil 2). Amaç, tipik bir "gri" görünümden biraz daha koyu bir görüntüyle başlamaktır.
   3. Odak bölgesini (ekranın sağındaki mavi ok, Şekil 2) beklenen timus seviyesine ayarlayın. Genç fareler için bu, 4 mm'lik bir derinlik civarında olacaktır.
   4. Görüntü yakalama isteniyorsa, görüntülerin yordam boyunca uygun şekilde kaydedilebildiğinden emin olmak için depo görüntüsünün işlevselliğini ve depo klibi düğmelerini sınayın. Bunu, ekranın sağ alt köşesindeki Klibi Kaydet düğmesine veya Dondur düğmesine ve ardından Görüntüyü Kaydet'e dokunarak gerçekleştirin (Şekil 2).
3. Dönüştürücü yüzeyine, ultrason makinesi tutucusunda veya bir asistanın elinde durarak, dik durumdayken az miktarda (~ 1 mL ) ultrason jeli uygulayın (bkz.
4. Isıtmalı platformun yanında küçük bir steril alan hazırlayın. Bunun için en uygun konumlandırma genellikle platform ve ultrason makinesi arasındadır.
   1. Bu maddeleri steril alana boşaltın: steril bir prob kapağı, lastik bant, steril eldivenler ve steril ultrason jeli (bkz.
   2. Steril alan kurulduktan ve eşyalar yerleştirildikten sonra, steril eldivenleri giyin.
   3. Steril prob kapağını ultrason dönüştürücüsünün üzerine (ve başlangıçta proba yerleştirilen jelin üzerine) dikkatlice yerleştirin. Steriliteyi koruyun ve sadece steril kapağa dokunun, başka bir şeye değil. Steril lastik bandı yerinde tutmak için steril prob kapağının üzerine kaydırın.
      NOT: Hava odakları, boyutlarından bağımsız olarak, ultrason görüntülemeye müdahale edebilir. Bu nedenle, ultrason jelinin dönüştürücü ve steril prob kapağı arasına ve ultrason probu ile hayvan arasında havasız bir arayüz sağlamak için prob kapağının üstüne uygulanması önemlidir.
   4. Transdüserin üzerine ılımlı miktarda (2-3 mL) steril ultrason jeli yerleştirin.
      NOT: Kullanıcı artık anestezi uygulanmış bir fareyi görüntülemeye hazırdır.

3. Timüsün görüntülenmesi ve bulunması

1. Steriliteyi korurken, ultrason jel kaplı probu, ilk görüntüleme için farenin ön göğüs duvarının dezenfekte edilmiş kısmına dikey olarak yerleştirin.
   1. Ultrason görüntüsüne bakmak ve daha da optimize etmek için bir dakikanızı ayırın. Adım 2.2'ye geri dönün ve Şekil 3'ünkine benzer bir görünüm elde etmek için ayarlayın.
2. Farenin ön göğsünü enine düzlemde tarayın. Bunu, dönüştürücüyü dikey olarak tutarak ve boya fırçası benzeri veya "süpürme" hareketiyle boyundan karnına yukarı ve aşağı hareket ettirerek gerçekleştirin.
   NOT: Kalp, hızlı hareketi ve "odacıklı" görünümü nedeniyle göğüsteki en tanınabilir yapı olacaktır. Kalp lokalize olduğunda, bu timüsün görüntüsünü elde etmek için bir referans noktası olarak kullanılabilir.
3. Kalp görüş alanında ortalanmışken, dönüştürücüyü hafifçe boyuna doğru süpürün. Kalbe göre daha üstün olan timusla genellikle karşılaşılır.
4. Timüsü, orta hatta ortalanmış, aortun ön tarafında ve sternumun arkasında bulunan bilobed, piramidal, hipoekoik ("karanlık" veya "siyah" ekranda görünen) bir yapı olarak görselleştirin (Şekil 3A).
5. Üst göğsün her iki tarafındaki iki yuvarlak eşleştirilmiş siyah (yani, "hipoekoik") yapıya dikkat edin.
   NOT: Bunlar bilateral venae kavalardır. Aort, iki venae kava arasındaki orta hatta benzer eğrisel hipoekoik bir yapıdır. Bunlar pulsatil hareketleriyle kolayca tanınabilir.

4. Timus enjeksiyonu

1. Gerekirse, dönüştürücüye daha fazla (2-3 mL) steril ultrason jeli uygulayın.
   NOT: Dönüştürücü üzerindeki nispeten büyük miktarda steril jel (fare göğüs kafesinin boyutuna kıyasla), farenin göğüs duvarının etrafında bir "jel ped" görevi görecektir. Bu, görüş alanı içinde hava ile yapılan ultrason eserlerinin sayısını azaltacaktır.
2. Ultrason probunu kullanarak, genellikle enjeksiyon için ideal hedef bölge olan timusun en geniş kısmını bulun. Seçilen konumda yatay bir iğne yörüngesi tahmin edin.
   1. Ana kan damarlarının (SVC'ler ve aort) bu bölgede nerede bulunduğuna dikkat edin. Enjeksiyon sırasında bunlardan kaçının.
   2. Kan damarları, adım 3.7'de açıklandığı gibi hipoekoik, pulsatil yapılar olacaktır. Emin değilseniz, damarlar içindeki akışı kontrol etmek için renkli Doppler modunu kullanın (Şekil 4A). Ekrandaki Renk (Color ) düğmesine dokunarak renkli Doppler modunu etkinleştirin.
   3. Ana kan damarlarından birinin (veya kalbin) beklenen iğne yörüngesi boyunca olması bekleniyorsa, yeni bir hedef alan seçin veya farklı bir yaklaşım / yörünge bulun.
3. Transdüseri bir elinizde tutun ve diğer elinizde 10 μL enjekte edilen 30 G insülin iğnesini ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Enjektör, deneysel tasarıma bağlı olarak değişecektir. Bu çalışmada fosfat tamponlu salin, tripan mavisi veya D-lusiferin (0.1 μg / 10 μL) kullanılmıştır.
4. Enjeksiyon işlemine başlamak için, transdüseri yanal olarak hareket ettirin, böylece timus ultrason görüş alanında merkezden uzakta olur. Görüş alanının diğer tarafının çoğunlukla ultrason jelinden ve başka hiçbir şeyden oluşmadığından emin olun.
5. İğnenin ucunu dönüştürücünün altındaki jele yerleştirin ve iğneyi cilt yüzeyine bitişik olarak görselleştirilene kadar yavaşça hareket ettirin (Şekil 4B).
6. İğneyi ultrason altında sürekli görüntülerken, iğneyi kan damarlarından uzakta, perkütan bir yörünge ile timus bezine yerleştirin.
   1. İğne ucunu giriş bölgesine aykırı timik loba yerleştirmek için "çapraz timus" yatay yörüngesini kullanın. Bu, iğne yolu boyunca potansiyel sızıntıyı açıklar (Şekil 5A).
7. İğne ucu timusun istenen kısmının içine girdikten sonra, sonografik görselleştirme kullanırken içeriği (10 μL tripan mavisi veya D-lusiferin, 0.1 μg / 10 μL gibi) 30 G şırıngadan hızlı bir şekilde enjekte edin.
   1. İğne yerleştirme ve enjeksiyon sırasında şırıngayı stabilize etmek için, şırıngayı başparmak ile üçüncü parmak arasında tutun ve şırınga pistonunu işaret parmağıyla kontrol edin.
8. Tüm içerikler yatırıldıktan sonra iğneyi çıkarın.

5. Hayvanların enjeksiyon sonrası izlenmesi

1. Hayvanı boş bir kafese aktarın ve sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözlemleyin.
   NOT: Anesteziden tam iyileşmenin 2 dakika içinde gerçekleşmesi beklenmektedir.
2. Sıkıntı, nefes darlığı veya kanama belirtileri için hayvanı 10 dakika daha izleyin.
   NOT: Enjeksiyon sonrası ağrı beklenmez ve tipik olarak enjeksiyon sonrası analjeziye gerek yoktur.
3. Tamamen iyileştikten sonra ve enjeksiyon sonrası olaysız bir gözlem periyodunu takiben, enjekte edilen hayvanı diğer hayvanların şirketine iade edin.

Sonuçlar

Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması, izlenecek birkaç önemli adıma dayanmaktadır. İlk olarak, timus bezinin kendisinin güvenilir bir şekilde tanımlanması sağlanmalıdır. Genç farelerde, bezin büyüklüğü nedeniyle bu basittir (Şekil 3A). Yaşlı farelerde veya immün yetmezlikli farelerde, daha zor olabilir; Bununla birlikte, modern ultrason ekipmanı ile hala çok uygundur (Şekil 3B, C). İkincisi, iğne yörüng...

Tartışmalar

Ultrason rehberliğinde serbest el enjeksiyonu, çalışma materyallerini timusa verimli ve aseptik bir şekilde iletmek için oldukça doğru bir tekniktir. Enjeksiyon bölgesinde cildin ilk sterilizasyonunu takiben, steril eldivenler, steril ultrason prob kapakları ve steril ultrason jeli kullanımı nedeniyle prosedür sırasında sterilite korunur. Kör perkütan yaklaşım 10,17'nin aksine veya farelerde intratimik enjeksiyonlar için yaygın olarak kullanılan yöntemler olan timus

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquasonic 100 Ultrasound Gel	Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)	01-01	Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	025854	Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)	328431	Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - aged	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - young	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL	CareFusion (El Paso, TX, USA)	260449	chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	A5000-2	Sterile, 6"
D-Luciferin	Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)	LUCK-1G
Isoflurane	Henry Schein (Melville, NY, USA)	1182097
IVIS Lumina X5	PerkinElmer (Melville, NY, USA)	n/a	In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	007850	Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves	Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)	56892	Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion	Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)	n/a	Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	005557	Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning (Corning, NY, USA)	21-040-CV
Puralube Vet Ointment	Med Vet International	PH-PURALUBE-VET	Eye ointment
Sheathes	Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)	10040	Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)	EZ-17 85	Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals (Solon, OH, USA)	91691049
Vevo 3100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Procedural platform