JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) in vitro deney için mikroglia benzeri hücrelere farklılaşma sürecini açıklar. Ayrıca, canlı hücre görüntüleme sistemlerini kullanarak in vitro fagositoz testleri için bir substrat olarak kullanılabilecek iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan insan sinaptozomları üretmek için ayrıntılı bir prosedür de sunuyoruz.

Özet

Mikroglia, beyin mikro ortamında homeostazı koruyan ve çoklu nörolojik hastalıklarda kilit bir oyuncu haline gelen miyeloid kökenli yerleşik bağışıklık hücreleridir. İnsan mikrogliasını sağlık ve hastalıkta incelemek, insan hücrelerinin son derece sınırlı arzı nedeniyle bir meydan okumayı temsil eder. İnsan bireylerden türetilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) bu bariyeri aşmak için kullanılabilir. Burada, in vitro deneyler için insan iPSC'lerinin mikroglia benzeri hücrelere (iMG'ler) nasıl ayırt edileceği gösterilmiştir. Bu iMG'ler, mikroglia benzeri morfoloji, uygun belirteçlerin ekspresyonu ve aktif fagositoz dahil olmak üzere mikroglia'nın beklenen ve fizyolojik özelliklerini sergiler. Ek olarak, insan iPSC kaynaklı alt motor nöronlardan (i3LMN'ler) türetilen sinaptozom substratlarının izole edilmesi ve etiketlenmesi için belgeler sağlanmaktadır. Canlı hücreli, uzunlamasına bir görüntüleme testi, pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş insan sinaptozomlarının yutulmasını izlemek için kullanılır ve iMG'nin fagositik kapasitesinin araştırılmasına izin verir. Burada açıklanan protokoller, insan mikroglia biyolojisini ve mikroglia'nın hastalığa katkısını araştıran farklı alanlara geniş ölçüde uygulanabilir.

Giriş

Mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) yerleşik bağışıklık hücreleridir ve CNS'nin geliştirilmesinde çok önemli bir rol oynar. Mikroglia, yetişkin beyninde homeostazı korumak ve travma ve hastalık süreçlerine aktif olarak yanıt vermek için de önemlidir. Kümülatif kanıtlar, mikroglia'nın çoklu nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezinde anahtar katkıda bulunduğunu göstermektedir 1,2. Mikroglial biyoloji hakkındaki mevcut bilgiler ağırlıklı olarak fare modellerinden türetilmiş olsa da, son çalışmalar murin ve insan mikrogliası arasındaki önemli farklılıkları aydınlatmış ve insan mikrogliasının genetiğini ve biyolojik işlevlerini incelemek için teknolojilerin geliştirilmesine duyulan ihtiyacı vurgulamıştır 3,4. Mikroglia'nın disseke edilmiş birincil dokudan izole edilmesi, mikroglia özelliklerini ciddi şekilde değiştirebilir5, bu tür hücrelerle elde edilen potansiyel olarak kafa karıştırıcı sonuçlar. Bu yöntemin genel amacı, insan iPSC'lerini iMG'lere ayırt etmek, böylece bazal koşullar altında insan mikrogliasını incelemek için bir hücre kültürü sistemi sağlamaktır. Ayrıca, tamamen insan model sistemi kullanan bir fagositoz testi, hem kalite kontrol önlemi olarak hem de hastalık bağlamında iMG disfonksiyonunu değerlendirmek için iMG'lerin işlevselliğini incelemek için bir araç olarak buraya dahil edilmiştir.

Mikroglia'nın iPSC'lerden farklılaşması için çoklu protokoller son zamanlarda literatürdeortaya çıkmıştır 6,7,8,9,10. Bazı protokollerin potansiyel dezavantajları arasında uzun veya uzun süreli farklılaşma, çoklu büyüme faktörlerinin eklenmesi ve / veya karmaşık deneysel prosedürler 6,9,10 bulunmaktadır. Burada, iPSC'lerin ilkel makrofaj öncülleri (PMP'ler) olarak adlandırılan öncü hücrelere farklılaştırılması yoluyla mikroglia ontojenisinin yönlerini özetleyen "kullanıcı dostu" bir farklılaşma yöntemi gösterilmiştir7,11. PMP'ler daha önce açıklandığı gibi oluşturulur ve bazı optimizasyonlar burada12'de sunulmuştur. PMP'ler, kan-beyin bariyeri kapanmadan önce beyni istila ederek embriyonik gelişim sırasında mikrogliaya yol açan MYB'den bağımsız yumurta sarısı kesesi kaynaklı makrofajları taklit eder13. PMP'leri iMG'lere ölümcül bir şekilde ayırt etmek için, Haenseler ve ark. ve Brownjohn ve ark. tarafından protokollere dayanan hızlı ve basitleştirilmiş bir monokültür yöntemi kullandık ve iMG'lerin mikroglia ile zenginleştirilmiş belirteçleri 7,8 sağlam bir şekilde eksprese ettiği verimli bir mikroglia farklılaşma yöntemi oluşturmak için bazı değişiklikler yaptık. Bu farklılaştırma yöntemi, iPSC'lerin kültüründe uzmanlığa sahip laboratuvarlarda ve bir insan modeli sistemi kullanarak mikroglia biyolojisini incelemeyi amaçlayan araştırma hedefleriyle çoğaltılabilir.

iPSC türevi mikroglia, in vitro deneyler için biyolojik olarak ilgili bir insan mikroglia kaynağını temsil eder ve fagositoz da dahil olmak üzere mikroglial kanonik fonksiyonları araştırmak için önemli bir araçtır. Mikroglia, hücre kalıntılarını, toplanmış proteinleri ve bozulmuş miyelin14'ü temizledikleri beyin ve CNS'nin profesyonel fagositleridir. Mikroglia ayrıca sinapsları yutarak sinaptik yeniden şekillenmede ve patojenlerin fagositozu yoluyla dış enfeksiyonlara karşı savunmada işlev görür15,16. Bu protokolde, iMG'ler tarafından fagositoz, iMG yutulması için materyal olarak insan sinaptozomları kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla, insan i3LMN'lerinden türetilen sinaptozomları izole etmek için bir açıklama açıklanmaktadır. i3LMN türevi insan sinaptozomları, fagozom işleme ve in vitro bozunma sırasında asidik bölmeler içinde lokalize sinaptozomların miktarının belirlenmesine izin veren pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiştir. Canlı hücre mikroskobu kullanan bir fagositoz testi, mikroglia yutulmasının dinamik sürecini gerçek zamanlı olarak izlemek için gösterilmiştir. Bu fonksiyonel tahlil, tam bir insan sistemi kullanarak sağlık ve hastalıkta mikroglial fagositozdaki olası kusurları araştırmak için bir temel oluşturur.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler steril olmalı ve tüm adımlar steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. Tüm iPSC hatlarının yanı sıra bakım ve farklılaştırma ortamları Malzeme Tablosunda açıklanmıştır. Aşağıda gösterilen mikroglia farklılaştırma yöntemi, burada açıklanan yeni değişikliklerle daha önce yayınlanmışprotokoller 7,8,12'ye dayanmaktadır.

1. Mikroglia farklılaşması

NOT: Protokole genel bir bakış Şekil 1'de özetlenmiştir.

  1. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kültürü
    NOT: iPSC kültür tekniklerini açıklayan daha fazla ayrıntı başka bir yerde bulunabilir17.
    1. Çözme ve bakım
      1. iPSC ortamını hazırlayın, ortamı aliquot edin ve -20 ° C'de 6 aya kadar saklayın. Alikotları gece boyunca 4 ° C'de çözün ve 1 haftaya kadar kullanın. Kullanmadan önce ortamı ortam sıcaklığında en az 1 saat bekletin.
      2. 6 delikli bir plakanın kuyularını, kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'de seyreltilmiş 1 mL'lik 10 μg / mL laminin 521 ekleyerek kaplayın18. Plakaları bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de en az 2 saat veya tercihen bir gece boyunca saklayın. Seyreltildikten sonra, laminini 3 ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
      3. Steril suda seyrelterek 10 mM Rho kinaz inhibitörü Y27632 (ROCK İnhibitörü) stok çözeltisi hazırlayın. ROCK inhibitörü çözeltisinin tek kullanımlık alikotlarını yapın ve bunları 1 yıla kadar -20 ° C'de saklayın.
      4. DPBS'de 0,5 M EDTA'nın stok çözeltisini seyrelterek 0,5 mM EDTA hazırlayın.
      5. Dondurulmuş iPSC'lerin bir şişesini eritmek için, şişeyi çoğunlukla çözülene kadar 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin. Şişenin içeriğini derhal 4 mL iPSC ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 1 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj.
      6. Süpernatantı aspire edin ve kolonilerin bozulmasını önlemek için tüpün duvarına yavaşça 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1 mL iPSC ortamı ekleyerek hücreleri yeniden askıya alın.
      7. Kaplanmış kuyucukların her birine 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1,5 mL iPSC ortamı ekleyin ve yeniden askıya alınan kolonileri damla damla ortamı içeren kuyucuklara aktarın.
        NOT: Kültür bakımı için adım 1.1.1.6'dan 5-7 damla kullanın, ancak her iPSC hattı için optimum tohumlama yoğunluğunu ayarlayın.
      8. Plakayı yan yana ve arkadan öne doğru manuel olarak karıştırarak kuyucuklardaki hücreleri eşit olarak dağıtın. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, ROCK inhibitörü olmadan taze iPSC ortamı ekleyerek ortamı tamamen değiştirin.
      9. Bakım için, hücreler% 80 akıcılığa ulaşana kadar ortamı her gün değiştirin.
        NOT: Kullanılan iPSC ortamı esnek bir besleme programına izin veriyorsa, hücreler ortamı değiştirmeden 2 gün boyunca muhafaza edilebilir. Bunu geçiş başına bir kez ile sınırlamanız ve yalnızca hücrelerin% 50'den az birleşik olması durumunda tavsiye edilir.
    2. Bölme
      1. Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL DPBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) ile yıkayın.
      2. Hücreleri yerinden çıkarmak için, 1 mL 0.5 mM EDTA ekleyin ve hücre kolonilerinin kenarları kuyunun yüzeyinden kalkıncaya kadar oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. Hücreleri DPBS ile tekrar yıkayın ve 1 mL iPSC ortamı ekleyin.
      3. Hücre kolonilerini, bir hücre kaldırıcı kullanarak hafifçe kazıyarak ayırın. Kolonileri rahatsız etmemek için kuyunun her alanını sadece bir kez kazıyın.
        NOT: Kolonileri kuyudan çıkarmak için alternatif yöntemler başka bir yerde bulunabilir17.
      4. 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak hücreleri toplayın ve 1,5 mL iPSC ortamı içeren önceden kaplanmış kuyucuklara (adım 1.1.1.2'de belirtildiği gibi) 1:6 oranında (hücrelerden ortama) damla damla aktarın.
  2. Mikroglia benzeri hücrelere (iMG'ler) iPSC farklılaşması
    NOT: Küçük moleküller ve büyüme faktörleri, DPBS'de steril filtrelenmiş% 0.1 sığır serum albümininde, nihai konsantrasyondan 1.000 kat daha yüksek bir stok konsantrasyonuna çözülür. Erken geçişlerde iPSC'leri iMG'lere ayırmanız önerilir. iPSC hatlarının rutin karyotiplemesi önerilir.
    1. Standart kaplama çözümü hazırlayın
      1. Hücre dışı matris kaplama reaktifinin stok çözeltisini gece boyunca 4 °C'de buz üzerinde çözün.
      2. Mikrosantrifüj tüplerini ve filtre pipet uçlarını 4 °C'de önceden soğutun.
      3. Aliquot 250 μL konsantre hücre dışı matris kaplama reaktifi her tüpün içine yerleştirilir ve hemen buzun üzerine yerleştirilir. Alikotları -20 ° C'de saklayın.
      4. Kaplama çözeltisini hazırlamak için, hücre dışı matris kaplama reaktiflerinden birini gece boyunca 4 ° C'de buz üzerinde çözün.
      5. İnsan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (DMEM-F12 olarak adlandırılır) büyümesi için optimize edilmiş 50 mL buz gibi soğuk DMEM-F12'yi önceden soğutulmuş bir konik tüpe ekleyin ve buz üzerinde tutun.
      6. Buz gibi soğuk DMEM-F12'yi birden çok kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 1 mL'lik bir pipet ucunu soğutun ve ardından hücre dışı matris kaplama reaktifinin 250 μL'sini DMEM-F12 ortamını içeren konik tüpe aktarmak için hemen pipet ucunu kullanın.
        NOT: Standart kaplama çözeltisi 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.
    2. Embriyoid cisim (EB) oluşumu
      1. 4 °C'de 4 güne kadar muhafaza edilebilen EB ortamını hazırlayın.
      2. iPSC'ler %80 akıcılığa ulaştığında, 1 mL DPBS ile yıkayarak ve 37 °C'de 2 dakika boyunca 1 mL ayrışma reaktifi ekleyerek kolonileri ayrıştırın. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için birden çok kez kazıyarak bir hücre kaldırıcı kullanarak kolonileri yerinden çıkarın. Hücreleri toplayın ve her şeyi 9 mL DPBS içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın.
      3. Hücreleri 1 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj edin, süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL EB ortamında yeniden askıya alın. 10 μL hücre alın ve 1: 1'i Tripan mavisi ile seyreltin. Hücreleri bir hemasitometre ile sayın ve hücre sayısına dayanarak, hücre stokunu 100 μL başına 10.000 hücrenin son seyreltilmesine kadar seyreltin. Hücreleri kaplamak için, seyreltilmiş hücrelerin kuyu başına 100 μL'sini düşük yapışkanlı, yuvarlak tabanlı, 96 delikli bir plakaya ekleyin.
        NOT: Genel olarak, iPSC'lerin her %80'lik akıcılık kuyusundan 96 delikli plakanın 48 kuyusu elde edilebilir.
      4. Plakayı 3 dakika boyunca 125 × g'da santrifüj yapın ve 4 gün boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. 2. günde çok kanallı bir pipet kullanarak ve 50 μL eski ortamı nazikçe toplayarak ve ardından 50 μL taze EB ortamını geri ekleyerek yarım orta ölçekli bir değişiklik gerçekleştirin.
        NOT: 4. günde, iPSC'ler sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi EB'ler olarak adlandırılan küresel hücresel yapılar oluşturacaktır. EB farklılaştırma süreci, gerekirse 7 güne kadar uzatılabilir.
    3. İlkel makrofaj öncüllerinin (PMP'ler) üretilmesi
      1. PMP baz ortamını, steril filtreyi hazırlayın ve 1 aya kadar 4 ° C'de saklayın.
      2. 6 delikli bir plakanın kuyularını 1 mL buz gibi soğuk Matrigel kaplama çözeltisi ekleyerek kaplayın ve 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de en az2 saat veya tercihen bir gece boyunca inkübe edin.
      3. EB farklılaşmasının 4. gününde, EB'leri 1 mL pipet uçlarıyla toplayarak (pipet kullanarak) Matrigel kaplı kuyucuklara aktarın. EB'leri kuyudan çıkarmak için bir veya iki kez yukarı ve aşağı pipet. EB'lerin kuyunun kenarına yerleşmesini sağlamak için 6 delikli plakayı eğimli bir açıyla tutun.
        NOT: Kaplanmış kuyu başına dokuz veya on EB kaplanabilir.
      4. Tüm EB'ler yerleştikten sonra, EB'leri kuyunun kenarında tutarken 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak eski ortamı nazikçe pipetleyin ve çıkarın. Her bir kuyucuğa 3 mL taze hazırlanmış PMP tam ortam ekleyin. Plakayı yan yana ve arkadan öne doğru manuel olarak karıştırarak kuyucuklardaki hücreleri eşit olarak dağıtın. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de ve% 5 CO2'ye yerleştirin.
      5. EB'lerin kuyunun dibine yapışmasına izin vermek için plakayı 7 gün boyunca rahatsız etmeyin. Bu süreden sonra, PMP tam ortam kullanarak yarım orta bir değişiklik gerçekleştirin.
        NOT: Bu noktada, EB'lerin çoğu plakaya tutturulmalıdır. Kayan EB'ler kaldırılabilir.
      6. 5-7 gün sonra, EB'leri kuyucukların dibine tutturulduklarından emin olmak için 4x büyütmede bir ışık alanı mikroskobu altında inceleyin. Ortamı 1.2.3.5'te açıklandığı gibi değiştirin. 21. günde, 3 mL PMP tam ortam ile tam bir ortam değişimi gerçekleştirin.
        NOT: Ortamda yüzen miyeloid progenitörler bu noktada belirgin olabilir. Bu hücreler orta değişim sırasında atılmalıdır.
      7. 28. günde, süpernatantta PMP'ler olarak adlandırılan yuvarlak hücreleri arayın ve 10 mL'lik bir pipet ve otomatik pipetleyici kullanarak PMP'leri içeren ortamı toplayın. EB'leri rahatsız etmemeye dikkat edin. PMP'leri ve ortamı 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve adım 1.2.4'te açıklandığı gibi devam edin.
        NOT: Genellikle aynı iPSC hattından PMP'ler, 6 delikli bir plakanın beş kuyucuğundan toplanabilir ve tek bir 15 mL konik tüp içinde bir araya getirilebilir.
      8. EB'lerin daha fazla bakımı için 3 mL taze PMP komple ortam ekleyin. PMP'ler EB'lerden 3 aydan uzun bir süre boyunca sürekli olarak ortaya çıktıkça, bunları 1.2.3.7 ve 1.2.3.8 numaralı adımlarda açıklandığı gibi her 4-7 günde bir toplayın (ortamın rengi sarı bir tona değiştirmesine izin vermeyin).
        NOT: PMP'ler birkaç ay boyunca toplanabilse de, zamanla fenotiplerini değiştirebilirler.
    4. iMG'lere farklılaşma
      1. iMG baz ortamını (Malzeme Tablosu) hazırlayın, steril filtre uygulayın ve 3 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
      2. PMP'ler 15 mL'lik bir konik tüp içinde toplandıktan sonra, 4 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve 1-2 mL iMG bazal ortam kullanarak PMP'leri yeniden askıya alın. Küçük bir aliquot alarak ve Trypan mavisi ile 1: 1 seyrelterek bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
        NOT: 0.5-1.5 × 106 PMP'ler normalde iPSC hattına ve EB kültürünün yaşına bağlı olarak her hafta elde edilir.
      3. Hücrelerin geri kalanını 4 dakika boyunca 200 × g'da tekrar santrifüj yapın. PMP'leri istenen konsantrasyona kadar seyreltin, böylece hücreler taze hazırlanmış iMG tam ortamı kullanılarak hücre kültürü ile işlenmiş plakalar üzerinde ~ 105 /cm2 yoğunlukta kaplanır. Terminal farklılaşmasına izin vermek için 10-12 gün boyunca her 3-4 günde bir taze hazırlanmış iMG komple ortam kullanarak yarım orta bir değişim gerçekleştirin.
        NOT: Bu noktada, hücreler mikroglia benzeri morfoloji kazanmalıdır. PMP'lerin mikroglia kaderine bağlılığını doğrulamak için, pürinerjik reseptör P2RY12 ve transmembran protein 119 (TMEM119)9 gibi mikroglia ile zenginleştirilmiş belirteçlerin ekspresyonunu doğrulamak için immünofloresan analizi yapılır.
      4. Hücre sağlığını ve canlılığını korumak için, iMG farklılaşmasının 10 ila 12. günleri arasındaki tüm deneyleri yapın.

2. Motor nöron kaynaklı insan sinaptozomları kullanılarak fagositoz testi

  1. iPSC kaynaklı alt motor nöronların transkripsiyon faktörü aracılı farklılaşması (i3LMN'ler)
    NOT: Daha önce açıklandığı gibi farklılaşma işlemi için nörogenin-2 (NGN2), adacık-1 (ISL1) ve LIM homeobox 3 (LHX3) transkripsiyon faktörlerini içeren hNIL indüklenebilir transkripsiyon faktörü kasetinin kararlı bir şekilde yerleştirildiği bir WTC11 hattı kullanılmıştır.17. iPSC hattı, adım 1.1.1'de açıklandığı gibi, ancak adım 1.2.1'de açıklanan kaplama koşullarıyla korunmuştur. Herhangi bir hücre dışı matris kaplama reaktifi, laminin 521 gerekli olmadığından nöronal farklılaşma için kullanılacak iPSC'lerin kültürlenmesi için kullanılabilir. Tüm ortamlar kullanımdan önce en az 1 saat boyunca ortam sıcaklığına dengelenir.
    1. 10 cm'lik kapları, adım 1.2.1'de açıklandığı gibi 5 mL standart kaplama çözeltisi ile kaplayın.
      NOT: Burada farklılaşma başına 3-4 adet 10 cm'lik tabaklar kullanılmıştır.
    2. İndüksiyon Baz ortamını, steril filtreyi hazırlayın ve 3 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
    3. Nöron ortamını, steril filtreyi hazırlayın ve 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
    4. Steril suda 100 mM borik asit, 25 mM sodyum tetraborat ve 75 mM sodyum klorür karıştırarak borat tamponu hazırlayın. PH'ı 8,5'e ayarlayın ve steril olarak filtreleyin.
    5. İPSC'ler% 80 akıcılığa ulaştığında, hücreleri DPBS ile yıkayın ve 0.5 mM EDTA ekleyerek kolonileri yerinden çıkarın.
      NOT: Her 10 cm'lik çanak için genellikle iki kuyu yeterlidir.
    6. Hücreleri ortam sıcaklığında 4-5 dakika boyunca inkübe edin. EDTA'yı çıkarın ve her bir oyuğa HEPES ile 3 mL DMEM / F12 ekleyin.
    7. Bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri kazıyın ve hücreleri kuyunun dibinden çıkarmak için 2-3x yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek 10 mL'lik bir pipet kullanın.
    8. Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın ve 3 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj yapın.
    9. Hücreleri 10 μM ROCK inhibitörü içeren 3 mL iPSC ortamında yeniden askıya alın ve bir hemasitometre kullanarak sayın.
    10. Plaka 1.5 × 10 μM ROCK inhibitörü içeren 12 mL iPSC ortamı ile önceden kaplanmış 10 cm'lik bir kapta 106 iPSC'ler.
    11. Ertesi gün, ortamı çıkarın ve hücreleri DPBS ile yıkayın. Transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu indüklemek için 12 mL taze hazırlanmış Tam İndüksiyon ortamı ekleyin.
    12. 2. günde, eşit hacimlerde 0.1 mg / mL poli-D-lizin ve 1 mg / mL poli-L-ornitin ile hazırlanan 5 mL nöron kaplama çözeltisi ile 10 cm'lik kapları borat tamponunda seyreltin. Gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    13. 3. günde, kaplanmış bulaşıkları 3 kat steril suyla yıkayın, suyu tamamen aspire edin ve tabakları eğerek ve ortam sıcaklığında en az 1 saat boyunca bir biyogüvenlik dolabı içinde kısmen açıkta bırakarak bulaşıkları kurumaya bırakın.
    14. Bulaşıklar tamamen kuruduktan sonra, 37 ° C'de en az 1 saat ve% 5 CO2 için 15 μg / mL laminin ve 40 μM BrdU ile desteklenmiş 6 mL Tam İndüksiyon ortamı ile kaplayın.
      NOT: BrdU tedavisi, mitotik olarak aktif hücreleri ortadan kaldırmak ve böylece nöronal kültürlerin saflığını arttırmak için önerilir. BrdU'nun nöronal sağlık üzerindeki etkileri minimumdur.
    15. Farklılaşan hücreleri 10 cm'lik çanak başına 3 mL ayrışma reaktifi ile tedavi edin ve ortam sıcaklığında 3-4 dakika inkübe edin.
    16. Ayrışma reaktifini çıkarmadan plakaya 6 mL DPBS ekleyin ve hücreleri ayırmak için çözeltideki hücreleri 10 mL'lik bir pipetle 4-5x yukarı ve aşağı pipetleyin.
    17. Hücre süspansiyonunu toplayın ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe geçirin. Süzgeci durulamak için 1 mL İndüksiyon baz ortamı ekleyin.
    18. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin. Ortamı aspire edin ve hücreleri 40 μM BrdU içeren 3 mL Tam İndüksiyon ortamında yeniden askıya alın.
    19. Hücreleri bir hemositometre ile sayın. Adım 2.1.14'te eklenen kaplama çözeltisini çıkarmadan 40 μM BrdU içeren 6 mL Tam İndüksiyon ortamında hücreleri seyrelterek 10 cm'lik tabak başına yaklaşık 2.5 × 10 cm'lik tabak 6 hücreyi önceden kaplanmış tabaklara yerleştirin.
    20. 4. günde, ortamı aspire edin, hücreleri DPBS ile 1x yıkayın ve 40 μM BrdU içeren taze Tam İndüksiyon ortamı ekleyin.
    21. 6. günde, ortamı aspire edin, hücreleri DPBS ile 1x yıkayın ve 1 μg / mL laminin ile desteklenmiş Nöron ortamı ekleyin.
    22. 9. günde, ortamın 1 /3'ünü , 1 μg / mL laminin ile desteklenmiş taze Nöron ortamı ile değiştirerek değiştirin.
    23. Her 3-4 günde bir taze 1 μg / mL laminin ile desteklenmiş Nöron ortamı ile yarım orta değişiklikler yaparak i3LMN'leri 25 gün daha koruyun.
      NOT: Bu zaman noktasında, i3LMN'ler uzun süreçlere sahip bir nöronal morfoloji sunmalıdır. Nöronlar ayrıca kümeler veya hücre kümeleri oluşturma eğilimindedir. i3LMN'lerin farklılaşmasının nasıl doğrulanacağına dair daha ayrıntılı bir açıklama başka bir yerde bulunabilir17.
  2. Sinaptozom saflaştırma ve etiketleme
    NOT: Steril koşulları koruyun ve tüm adımları bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirin.
    1. i3 LMN'leri DPBS ile iki kez yıkayın.
    2. Sinaptozomların izolasyonu için 2 mL buz gibi soğuk hücre lizis reaktifi ekleyin, 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve nöronları sıkıca kazıyın.
    3. Lisatı birden fazla 2 mL mikrotüpe (tüp başına ~ 1.5 mL lizat) aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.200 × g'de santrifüj yapın.
      NOT: Bu prosedür boyunca tüpleri buz üzerinde tutun.
    4. Süpernatantı toplayın (peleti atın) ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 15.000 × g'de santrifüj yapın. Sinaptozomları içeren peleti, DPBS'de% 5 DMSO'luk benzer bir hacme (orijinal lizat gibi) kaydedin ve yeniden askıya alın.
      NOT: Sinaptozomlar hemen bir florofor ile etiketlenebilir veya gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de saklanabilir.
    5. Sinaptozom preparatındaki toplam protein verimini değerlendirmek için tüm tüpler için bir Bisinkoninik asit (BCA) protein testi yapın.
      NOT: Protein konsantrasyonunu ölçmek için diğer testler kullanılabilir. Farklı preparatlardan elde edilen toplam protein verimi referans olarak Tablo 1'e dahil edilmiştir. Presinaptik ve postsinaptik proteinlerin varlığını doğrulamak için sinaptoz preparatının batı leke analizinin yapılması önerilir. Burada, presinaptik belirteç, sinaptofizin (SYP) ve postsinaptik belirteç, postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD95), daha önce tarif edildiği gibi batı lekelenme analizi için seçildi19.
    6. Suda 100 mM sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın, pH'ı 8.5'e ayarlayın ve steril filtreleyin.
    7. Kullanılan pH'a duyarlı boyanın 1 mg liyofilize tozunu 150 μL DMSO içine çözündürün. Tek kullanımlık alikotlar yapın ve bunları -80 ° C'de saklayın.
    8. Sinaptozomları 4 ° C'de 5 dakika boyunca 15.000 × g'da santrifüj yapın.
    9. 100 μL 100 mM sodyum bikarbonat çözeltisinde 1 mg'a kadar sinaptozomları seyreltin.
    10. Sinaptozomları etiketlemek için, 1 mg sinaptozom başına yeniden yapılandırılmış pH'a duyarlı boyanın 1 μL'sini ekleyin ve ışığa maruz kalmayı önlemek için reaksiyonu alüminyum folyo ile örtün. Bir tüp çalkalayıcı kullanarak oda sıcaklığında 2 saat çalkalayın.
    11. Tüpe 1 mL DPBS ekleyin ve etiketli sinaptozomları 4 ° C'de 5 dakika boyunca 15.000 × g'de santrifüj edin.
    12. Süpernatantı çıkarın ve adım 2.2.11'de açıklandığı gibi dört ek yıkama gerçekleştirin.
    13. Son yıkama ve spinden sonra, peleti rahatsız etmeden süpernatantı mümkün olduğunca çıkarın ve etiketli sinaptozomları DPBS'de% 5 DMSO ile istenen konsantrasyon için bir hacimde yeniden askıya alın (burada kullanılan 0.7 μg / μL). Tek kullanımlık alikotlar hazırlayın ve -80 ° C'de saklayın. Etiketli sinaptozomlara ışığa maruz kalmaktan kaçındığınızdan emin olun.
  3. Canlı hücreli fagositoz testi
    1. Plaka 20-30 × 1004 PMP'leri 100 μL iMG tam ortamda 96 delikli plakalara yerleştirin ve adım 1.2.4'te belirtildiği gibi 10 gün boyunca farklılaşma işlemini izleyin.
    2. Tahlil gününde, canlı hücreler için 1 damla nükleer lekeyi 2 mL iMG bazal ortamına ekleyerek nükleer boyama çözeltisini hazırlayın.
    3. 96 delikli plakanın kuyucuğu başına 40 μL ortam çıkarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak 10 μL nükleer boyama çözeltisi ekleyin. Plakayı 37 ° C'de ve 2 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
    4. Etiketli sinaptozomları buz üzerinde çözün ve 1 dakika boyunca bir su sonikatör kullanarak hafifçe sonikleştirin. Sinaptozomları hemen buza geri aktarın. Etiketli sinaptozomları iMG tam ortamında, 50 μL ortam başına 1 μL sinaptozom oranında seyreltin.
      NOT: Sinaptozom konsantrasyonu tahlil bağımlıdır ve optimizasyon gerektirebilir. Ortamda DMSO'nun nispeten düşük bir yüzdesini (yani% 0.1 veya daha az) korumak için, kuyu başına 2 μL'den fazla sinaptozom eklenmemesi önerilir.
    5. Negatif kontrol olarak, aktin polimerizasyonunu ve dolayısıyla fagositozu inhibe etmek için bazı kuyucuklara sitokalasin D ile ön işlem yapın. İMG tam ortamında 60 μM sitochalasin D çözeltisi hazırlayın. 10 μM'lik son konsantrasyon için her bir kuyucuğa bu çözeltinin 10 μL'sini ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    6. Plakayı inkübatörden çıkarın ve 10 dakika boyunca 10 ° C'de inkübe edin. Plakayı buz üzerinde tutun ve adım 2.3.4'te açıklandığı gibi hazırlanmış 50 μL ortam içeren sinaptozomlar ekleyin.
    7. Plakayı 10 ° C'de 3 dakika boyunca 270 × g'da santrifüj yapın ve görüntüleme elde edilene kadar plakayı buz üzerinde tutun.
  4. Görüntüleme edinimi ve analizi
    1. Plakayı canlı hücre görüntüleme okuyucusuna yerleştirin ve analiz edilecek kuyuları seçin.
    2. 20x objektif lens seçin.
    3. Parlak alan ve mavi (4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]) kanallarının odağı, ışık yayan diyot (LED) yoğunluğunu, entegrasyon süresini ve kazancını ayarlayın. Sinaptozom floresansı ilk zaman noktasında ihmal edilebilir olmalıdır. Kırmızı (RFP) kanala odaklanmak için, parlak alan kanalını referans olarak kullanın. Entegrasyon süresi ve kazancı deneyler arasında farklılık gösterebilir; kırmızı kanal için şu başlangıç ayarlarını kullanın: LED: 4, entegrasyon süresi: 250 ve kazanç: 5.
    4. Kuyu başına bir montajda elde edilecek tek tek karo sayısını seçin (kuyunun merkezinde 16 karo elde edin, böylece toplam kuyu alanının yaklaşık% 5'ini görüntüleyin). Sıcaklığı 37 °C'ye ve görüntüleme için istenen zaman aralığına ayarlayın.
      NOT: Bu çalışmada görüntüler 16 saate kadar her 1 - 2 saatte bir elde edilmiştir.
    5. Analiz yazılımını açın.
      1. Görüntüleri içeren denemeyi açın. Veri Azaltma simgesine tıklayın.
      2. Menüde, Tablo 2'de açıklanan parametrelerle montajdaki 4 x 4 ayrı döşemeden tam bir görüntü oluşturmak için Görüntüleme İşlemi altında Görüntüleme Dikiş'i seçin.
      3. Dikişli görüntüler oluşturulduktan sonra, bu görüntüler için DAPI ve RFP kanallarını kullanarak bir yoğunluk eşiği tanımlayın. Bir resim açın ve Analiz Et'e tıklayın; Analiz altında, Hücresel Analiz'i seçin ve Algılama Kanalı'nın altında, DAPI veya RFP kanallarında dikişli bir görüntü seçin. Birincil Maske ve Sayı sekmesine gidin ve DAPI kanalındaki hücre çekirdeklerini veya RFP kanalındaki sinaptozom sinyalini doğru seçen bir eşik değeri ve nesne boyutu değerleri oluşturun. Denemenin tamamına uygulanabilecek parametreler optimize edilene kadar işlemi farklı görüntülerle tekrarlayın.
        NOT: Önerilen değerler Tablo 2'de bulunabilir.
      4. Çekirdek sayısını saymak için Veri Azaltma menüsüne gidin ve Görüntü Analizi altında Hücresel Analiz'i seçin. Birincil Maske ve Sayı sekmesine gidin ve Kanal altında, DAPI dikişli görüntüleri seçin ve Tablo 2'de açıklanan parametreleri kullanın.
      5. Hesaplanan Metrikler sekmesine gidin ve Hücre Sayısı'nı seçin. Sinaptozom sinyalinin alanını elde etmek için Veri Azaltma menüsüne gidin ve Analiz altında Hücresel Analiz'i seçin.
      6. Birincil Maske ve Sayı sekmesine gidin ve Kanal altında, RFP dikişli görüntüleri seçin ve Tablo 2'de ayrıntılı olarak açıklanan parametreleri kullanın.
      7. Hesaplanan Metrikler sekmesine gidin ve Nesne Toplamı Alanı'nı seçin. Veri Azaltma sekmesinde, Tamam'a tıklayın ve yazılımın elde edilen tüm görüntüleri analiz etmesine izin verin.
      8. Her zaman noktası için Nesne Toplamı Alanı ve Hücre Sayısı değerlerini dışa aktarın. Zaman noktası başına normalleştirilmiş alanı hesaplamak için Nesne Toplamı Alanı'nı Hücre Sayısı'na bölün. Birden fazla tedaviyi veya genotipi karşılaştırıyorsanız, denklemi (1) kullanarak fagositoz indeksini hesaplayın:
        figure-protocol-26033 (1)
      9. Sonuçları kaydedin ve verileri entegre edin.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak iMG'ler oluşturmak için, iyi tanımlanmış kenarlara sahip kompakt koloni morfolojisi gösteren farklılaşmamış iPSC'lerle başlamak önemlidir (Şekil 2A). EB oluşum bölümünde açıklandığı gibi tutulan ayrışmış iPSC'ler, farklılaşmanın 4. gününe kadar boyut olarak büyüyecek olan EB'ler olarak adlandırılan küresel agregalar oluşturacaktır (Şekil 2B). EB'ler PMP üretimi için uygun koşullarda toplandıktan...

Tartışmalar

Burada açıklanan farklılaşma protokolü, iPSC türevli mikroglia benzeri hücreleri ~ 6-8 hafta içinde yüksek saflıkta ve immünofloresan deneyleri ve daha fazla sayıda hücre gerektiren diğer tahlilleri gerçekleştirmek için yeterli verimde elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. Bu protokol, 1 haftada 1 × 106 iMG'ye kadar verim vermiştir, bu da protein ve RNA ekstraksiyonuna ve karşılık gelen aşağı akış analizlerine (örneğin, RNASeq, qRT-PCR, batı lekesi, kütle spektrometrisi) i...

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, motor nöron farklılaşması için WTC11 hNIL iPSC hattını sağladığı için Michael Ward'a ve mikroglia farklılaşması için kullanılan KOLF2.1J WT klonu B03 iPSC hattını tedarik ettiği için Jackson Laboratuvarlarına teşekkür eder. Ayrıca, protokollerin uygulanması sırasındaki desteği için Dorothy Schafer'e, canlı hücre görüntüleme sistemine yardımları için Anthony Giampetruzzi ve John Landers'a, revizyonlar sırasındaki teknik katkıları için Hayden Gadd'e ve bu çalışmadaki işbirliği için Jonathan Jung'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, UMASS Chan Tıp Fakültesi'nden Dan ve Diane Riccio Sinirbilim Fonu ve Angel Fund, Inc. tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibodyWako Chemical USANC92883641:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibodySigma-AldrichHPA0145181:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibodySigma-AldrichHPA0518701:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibodyAbcamab60461:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibodyAbclonalA63441:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibodyMilliporeMAB15961:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM)SigmaB6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtraSigma-AldrichS6297-250G
Sodium chloride (75 mM)Sigma S7653
Sodium tetraborate (25 mM)Sigma221732
Cell culture materials
6-well platesGreiner Bio-One657160
40 μm Cell Strainers Falcon352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture TreatedCELLTREAT229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, SterileCELLTREAT229305
low adherence round-bottom 96-well plateCorning7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture PlateCorning353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture PlateCorning353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom MicroplateCorning353872
Cell dissociation reagents
Accutase Corning25058CIdissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagentLife Technologies12-605-010dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane MatrixCorning™354230Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521STEMCELL Technology77004Referred as to laminin 521
Poly-D-LysineSigmaP7405Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-OrnithineSigma P3655Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
 mTeSR Plus KitSTEMCELL Technology100-0276To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4Fisher ScientificPHC9534final concentration 50 ng/mL
iPSC mediafinal concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632Fisher ScientificBD 562822final concentration 10 µM
SCFPeproTech300-07final concentration 20 ng/mL
VEGFPeproTech100-20Afinal concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAXGibco35050061final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15Lonza12001-988final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanolGibco21985023final concentration 55 µM
IL-3PeproTech200-03final concentration 25 ng/mL
M-CSFPeproTech300-25final concentration 100 ng/mL
PMP base mediafinal concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12Gibco12634010final concentration 1x
GlutaMAXGibco35050061final concentration 1x
N2 supplement, 100xGibco17502-048final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanolGibco21985023final concentration 55 µM
IL-34PeproTech or Biologend200-34 or 577904final concentration 100 ng/mL
iMG base mediafinal concentration 1x
M-CSFPeproTech300-25final concentration 5 ng/mL
TGF-βPeproTech100-21final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPESGibco11330032final concentration 1x
GlutaMAXGibco35050061final concentration 1x
N2 supplement, 100xGibco17502-048final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100xGibco11140050final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound ECalbiochem565790final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
DoxycyclineSigmaD9891final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base mediafinal concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632Fisher ScientificBD 562822final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture SystemGibcoA3653401final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAXGibco35050061final concentration 1x
N2 supplement, 100xGibco17502-048final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100xGibco11140050final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03The Jackson Laboratories
WTC11 hNILNational Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay KitThermo Scientific Pierce23227
dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction ReagentThermo Scientific87793Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagentInvitrogen R37605
pHrodo Red, succinimidyl esterThermoFisher Scientific P36600Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% SolutionAMRESCO INCK940-100ML
Bovine serum albumin (BSA)Sigma22144-77-0
BrdUSigmaB9285Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin DSigmafinal concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesiumCorning21-030-CV
DPBS without calcium and magnesiumCorning21-031-CVReferred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12Gibco12660012Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, NaturalGibco23017015Referred as to laminin
Software and Equipment
CentrifugeEppendorfModel 5810R
Cytation 5 live cell imaging readerBiotek
Gen5 Microplate Reader and Imager SoftwareBiotekversion 3.03
Multi-Therm Heat-ShakeBenchmarkrefer as tube shaker
Water sonicatorElmaMode Transsonic 310

Referanslar

  1. Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
  2. Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
  3. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  4. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  5. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  6. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  7. Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
  8. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  9. McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
  10. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  11. Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
  12. Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
  13. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
  14. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
  15. Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
  16. Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
  17. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  18. Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
  19. Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  20. Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
  21. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır