Yüksek verimli izolasyon ve küçük hücre dışı veziküllerin saflaştırılması için akış sitometrik sıralama parametrelerinin optimizasyonu

Özet

Bu protokol, hava püskürtme nozulunun boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, numune akış basıncını, voltajı, kazancı ve tetikleyici eşik parametrelerini optimize ederek küçük hücre dışı veziküller için hızlı ve boyuta özgü bir izolasyon yöntemi sağlar.

Özet

Küçük hücre dışı veziküller (sEV) tüm hücre tiplerinden salınabilir ve protein, DNA ve RNA taşıyabilir. Sinyal molekülleri, bir hücrenin fizyolojik ve patolojik durumunun göstergeleri olarak hizmet eder. Bununla birlikte, aşağı akış biyobelirteci tanımlamasını ve ilaç müdahale çalışmalarını önleyen sEV izolasyonu için standart bir yöntem yoktur. Bu yazıda, bir akış hücresi sıralayıcısı ile 50-200 nm sEV'nin izolasyonu ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bunun için, iyi bir sıralama hızı ve kararlı bir yan akış elde etmek için 50 μm'lik bir nozul ve 80 psi kılıf sıvı basıncı seçildi. Standart boyutlu polistiren mikrosferler, 100, 200 ve 300 nm parçacıkların popülasyonlarını bulmak için kullanıldı. Voltaj, kazanç ve ileri saçılma (FSC) tetikleme eşiğinin ek optimizasyonu ile sEV sinyali arka plan gürültüsünden ayrılabilir. Bu optimizasyonlar, yalnızca FSC ve yan saçılma (SSC) kullanarak temsili bir sEV popülasyonu elde edilmesini sağlayan kritik sıralama ayarlarından oluşan bir panel sağlar. Akış sitometrisi tabanlı izolasyon yöntemi sadece yüksek verimli analize izin vermekle kalmaz, aynı zamanda biyobelirteç ekspresyonuna dayalı sEV'nin senkron sınıflandırmasına veya proteom analizine izin vererek çok sayıda aşağı akış araştırma uygulaması açar.

Giriş

Bir hücre, hücreler arası iletişim için önemli olan sinyal molekülleri ve membran kapanımları ile sonuçlanan çeşitli boyutlarda hücre dışı vezikülleri (EV'ler) serbest bırakır¹. Farklı boyutlardaki EV'ler de farklı biyolojik roller oynar, 50-200 nm sEV, RNA, DNA ve proteinleri doğru hücre dışı konuma hassas bir şekilde dağıtabilir. sEV ayrıca, sadece immün sürveyans, kök hücre bakımı, kan pıhtılaşması ve doku onarımı gibi normal fizyolojik süreçlerin düzenlenmesini değil, aynı zamanda tümör ilerlemesi ve metastaz ^2,3 gibi çeşitli hastalıkların altında yatan patolojiyi de içeren salgı mekanizmalarını belirlemeye yardımcı olur. sEV'nin etkili izolasyonu ve analizi, biyobelirteçlerin tanımlanması ve gelecekteki ilaç müdahalelerinin tasarlanması için kritik öneme sahiptir.

sEV'nin klinik uygulaması üzerine yapılan sürekli araştırmalarla, sEV'nin izolasyon yöntemleri daha yüksek gereksinimler ortaya koymuştur. sEV'nin boyut, kaynak ve içerik bakımından heterojenliğinin yanı sıra fizikokimyasal ve biyokimyasal özelliklerde diğer EV'lerle benzerliği nedeniyle, sEV izolasyonu ^4,5 için standart bir yöntem yoktur. Şu anda, ultrasantrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi (SEC), polimer çökeltme ve immünoaffinite yakalama en yaygın sEV izolasyon yöntemleridir⁶. Ultra santrifüjleme, zaman alıcı olmasına rağmen, araştırmada sEV izolasyonu için hala altın standarttır, bu da 40-500 nm'lik geniş bir boyut dağılımı ile düşük saflığa ve uzun süreli santrifüjlemeden sonra sEV'ye önemli mekanik hasara neden olur ^7,8,9. Genellikle polietilen glikol (PEG) kullanan polimer çökeltmesi, hücre dışı protein agregalarının eşzamanlı çökelmesi ve polimer kontaminasyonu^10,11 ile sonraki fonksiyonel analizler için kabul edilemez saflıktan muzdariptir. İmmünoaffinite yakalama tabanlı yöntemler, farklı özgüllüklere sahip yüksek maliyetli antikorlar gerektirir, ayrıca düşük işlem hacmi ve verim^12,13,14 ile ilgili problemleri vardır. Partikül boyutu, izole edilmiş sEV'nin saflığını değerlendirmek için ana göstergelerden biridir. Her ne kadar sEV saflığı ulaşılamaz bir hedef olmaya devam etse de, SEC önemli miktarda orta bileşeni ortadan kaldırır ve SEC yöntemiyle ekstrakte edilen sEV parçacıkları esas olarak 50-200 nm¹⁵ aralığındadır. Mevcut tekniklerin zaman alıcı, düşük saflık, düşük verim, zayıf tekrarlanabilirlik, düşük numune verimi ve sEV'nin potansiyel hasarı dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birkaç dezavantajı vardır, bu da onu klinik kullanımla uyumsuz hale getirir¹⁶. Bu nedenle, çeşitli biyosıvılara uygulanabilir hızlı, ucuz ve boyut olarak belirlenmiş bir sEV izolasyon yöntemi, çeşitli araştırma ve klinik durumlarda önemli bir ihtiyaçtır.

Akış sitometrisinde, tek parçacıklar yüksek verimli, multiparametrik bir şekilde analiz edilir ve alt kümeler^17'ye ayrılır. EV'lerin heterojenliği nedeniyle, hücre analizi paradigmalarını takip eden EV'leri araştırmak için kullanılan tek parçacıklı bir akış sitometrik ölçümü ideal olacaktır, fizyoloji ile ilgili özellikleri ve protein bileşenlerini tanımlamak için ışık saçılımı ve floresan etiketleri kullanılmaktadır^18,19,20. Bununla birlikte, geleneksel akış sitometrisi, küçük boyutlu sEV'ler ve düşük yüzey biyobelirteçleri bolluğu ile zorlanmaktadır. Akış sitometrisinin hassasiyeti, ileri saçılma (FSC), yan saçılma (SSC) veya floresan eşiği tetikleyici parametre¹⁹ kullanılmasına bakılmaksızın arka plan gürültüsünü ve sEV'yi ayırt etmek için algılama parametrelerini optimize ederek geliştirilebilir.

Mevcut protokolle, yüksek çözünürlüklü akış sitometrik sıralama ayarları, standart olarak floresan boncuklar kullanılarak optimize edildi. Uygun nozul boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, eşik tetikleme parametresini ve dağınık ışık yoğunluklarını kontrol eden voltajları seçerek, sEV'nin belirli bir alt kümesini karmaşık bir karışımdan izole edebildik.

Protokol

1. Hücre kültürü

1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) bir kültür ortamını hazırlayın. İnsan pankreas kanseri hücresi PANC-1'i, 1 x 10⁶ hücre / mL yoğunluğunda 75^cm2'lik bir kültür şişesinde kültürleyin. Kültürü 37 °C'de %5 CO₂ ile inkübe edin.
2. Mikroskobik gözlem altında hücre yoğunluğu %75-%80'e ulaştığında hücreleri alt kültüre alır. Ortamı çıkarın ve 3-5 mL fosfat tampon salin (PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4) ile 2 kat durulayın.
3. Çözeltiyi atın, 1-2 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve hücrelerin mikroskop altındaki ortamda yuvarlanıp asılana kadar ayrılmasına izin verin. Taze ortam ekleyin, aspire edin ve 15 mL kültür ortamı ile 75^cm2 kültür şişelerine dağıtın. 1:2 ila 1:4 arasında bir alt yetiştirme oranı kullanın (önerilir).
   NOT: Tüm işlemler, hücre kontaminasyonunu önlemek için bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.

2. Kültür ortamı koleksiyonu

1. Hücreleri %5 CO₂ ile 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. İki adet 50 mL santrifüj tüpünde hücre süpernatantını (90 mL) toplayın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
2. Süpernatantı yeni steril tüplere aktarın ve 20 dakika boyunca 2.000 x g'de, 30 dakika boyunca 10.000 x g'de ve 4 ° C'de 70 dakika boyunca 12.000 x g'de art arda santrifüj yapın.
3. Süpernatantı çıkarın ve hafifçe pipetleyerek peleti 10 mL PBS ile durulayın. 12.000 x g'de 4 ° C'de 70 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın ve bir EV karışımı elde etmek için pelet 10 mL PBS tamponunda yeniden askıya alın.
4. EV karışımını ölçmek ve boyutlandırmak için nanopartikül izleme analizi (NTA) gerçekleştirin. NTA analizini cihaz kullanım referans kılavuzuna ve^{referans 21'e} göre gerçekleştirin.

3. Hücre sıralama

1. Akış hücresi sıralayıcısının standart başlatma yordamını gerçekleştirin. Başlangıç düğmesine basarak makineyi AÇIN. Lazer kontrol panelindeki Lazer Gücü düğmesine tıklayın. Akışkanları basınçlandırmak için akıllı numune alma cihazı alt menüsündeki Tankları Değiştir düğmesine basın.
   NOT: Çalıştırmadan önce atık tankının boş olduğundan ve kılıf tankının dolu olduğundan emin olun.
2. Ultrasonik olarak temizlenmiş 50 μm jet-in-air nozulu kullanın ve nozul tertibatına takın. Basıncı, kılıf sıvısı için 80 psi'ye ve basınç konsolundaki numune akışı için 80,3 psi'ye ayarlayın.
3. Kılıf akışı akışını başlatmak için Kılıf Akışını Başlat düğmesine basın. Akıllı örnekleyici alt menüsündeki Kabarcık Düğmesine tıklayarak 10 dakika boyunca otomatik olarak kabarcıktan arındırın ve ardından kapatın.
   NOT: Hücre ayıklama için, farklı boyutlardaki hava püskürtme nozulları, sıvı akış stabilitesini korumak için farklı kılıf sıvısı basınçları gerektirir. Bu yöntemde, 50 μm'lik bir nozul kullanıldı ve yalnızca 80 psi'ye eşit veya daha büyük bir kılıf sıvısı basıncı kararlı yan akışlar üretebilir. Numune akışı ile kılıf sıvısı arasındaki basınç farkı, ayıklamanın yükleme hızını belirler. Yöntemin ayar koşulu altında (numune akışı ile kılıf sıvısı arasındaki basınç farkı 0,3-0,6 psi'dir), sıvı akışı nispeten kararlıydı ve yükleme hızı, ayıklama verimliliğinin 0,3-0,6 psi'den daha düşük basınç farkı için% 50'den% 80'e çıkmasını sağladı.
4. Akışı hizalayın ve lazer noktasını belirleyin. İğne deliklerinin üzerindeki akışı görüntülemek için aydınlatma odası ışığını AÇIN. Akışı iğne deliğinde ortalamak ve akışı odaklamak için yukarı ve aşağı, sola ve sağa ve ön ve arka mikrometreleri ayarlayın.
5. Lazer ve Akış Durdurucu sekmesini seçin. Lazer durdurma ve nozul hizalama kalibrasyon işlemini tamamlamak için istendiğinde Yeşil Ok düğmesine sürekli basın.
6. İnce lazer hizalama ekranına erişin. X ekseni parametresi olarak 640-722/44 (H) kanalını ve Y ekseni parametresi olarak 405-448/59 (H) kanalını seçin. Tetik Parametresi Seçici'ye basın ve 488 nm lazerin SSC Parametresini seçin. Tüm lazer deklanşörlerini açın.
   NOT: Seçilen X ekseni ve Y ekseni parametreleri, sistemin lazer yapılandırmasına bağlıdır. Sistemde 640 nm veya 405 nm lazer yoksa diğer parametrelere izin verilir. En iyi sonuçlar için, iğne deliği şeridinde en büyük uzamsal ayrıma sahip lazerleri seçin (355 nm lazer hariç).
7. Gökkuşağı floresan parçacıklarını, mL başına 1 x 10⁶ boncuk nihai konsantrasyonu için 1 mL çift damıtılmış suya bir damla ekleyerek seyreltin. Numune odasının kapısını açın ve hazırlanan gökkuşağı floresan parçacıklarının bir tüpünü yükleyin.
8. Start Sample (Örneği Başlat) düğmesine basın. Floresan yoğunluğunu optimize etmek için yukarı ve aşağı mikrometreleri ayarlayın ve her sinyali mümkün olduğunca yoğun hale getirin. QC'yi otomatik olarak gerçekleştirmek için dokunmatik ekran kontrol panelindeki Kalite Kontrolü Başlat (QC) düğmesine basın.
9. Bırakma gecikmesi gerçekleştirin. Sıralama ayarları ekranına erişin ve bırakma gecikmesi düğmesini seçin. IntelliSort Initialization düğmesine basın. Cihaz, 25 ± 5'lik düşme gecikmesini elde etmek ve damlanın kopma noktasını net bir şekilde görselleştirabilmek için damlacık salınımının frekansını ve genliğini otomatik olarak ayarlar. Maintenance ( Bakım ) düğmesine basın.
10. Sıralama çıktısı türü olarak tüpü seçin. Sıralama odasına 15 mL'lik bir tüp tutucu yerleştirin. Plaka voltajını AÇIK duruma getirin ve plaka voltajını yaklaşık 4000 V'a ayarlayın.
11. Akış Kurulumu düğmesini seçerek test desenini açın. Akışın görüntüsünün toplama tüpüyle aynı hizada olduğundan emin olmak için şarj fazı kaydırıcısını ve sapma kaydırıcısını ayarlayın. Onay İşareti düğmesini seçin.
12. Bilgisayardaki Summit iş istasyonunda oturum açın. Dosya ana menüsünden yeni bir protokol oluşturun. Summit yazılımı kontrol panelindeki Histogram sekmesini seçerek bir nokta grafiği oluşturun.
13. Çalışma alanında yeni nokta grafiğin eksenlerine sağ tıklayın ve X ekseni parametresi olarak FSC'yi ve Y ekseni parametresi olarak SSC'yi seçin. FSC ve SSC'yi logaritmik biçimde sunun.
14. Edinme sekmesini seçin ve alma parametreleri panelini bulun. Parametreleri etkinleştirme alt menüsündeki tüm sinyalleri etkinleştirin. Tetikleyici parametre olarak FSC'yi seçin ve eşiği 0,01 olarak ayarlayın. FSC ve SSC grafiğindeki olayların ve popülasyonların ayrıldığından emin olmak için FSC ve SSC'nin voltajını ve kazancını 250 ve 0,6'da ayarlayın.
    NOT: Eşik ayarı, akış sitometrisi ile tespit edilebilen parçacık boyutunu ayarlamaya eşdeğerdir. Eşik ne kadar büyük olursa, tespit edilen parçacıklar o kadar büyük olur ve küçük parçacıklar eşik tarafından kesilir ve tespit edilemez. Bu yöntemde, eşik 0.01 olarak ayarlanır, böylece elektronik gürültüden daha büyük tüm parçacıklar tespit edilebilir.

4. sEV'nin izolasyonu

1. Floresan polistiren mikrosferleri 100 nm, 200 nm ve 300 nm süspansiyonlara seyreltin. 1 mL çift damıtılmış suya 1 μL mikrosfer ekleyin.
2. Mikrosfer süspansiyonunu art arda yükleyin. Zirve yazılımının satın alma menüsü altında Başlat'ı seçin ve 20.000 etkinlik kaydedin.
   NOT: Olay sayısı isteğe bağlıdır. İstatistiksel anlamlılığı karşılamak için en az 5.000 etkinlik önerilir.
3. Dikdörtgenler oluşturmak için FSC ve SSC nokta grafiğine sağ tıklayın ve elektronik gürültü bölgelerini ve 100 nm mikrosfer popülasyonunu yeniden boyutlandırmak ve yeniden konumlandırmak için sürükleyin. Sırasıyla R7 ve R4 olarak yeniden adlandırmak için bölgelere sağ tıklayın. 200 nm ve 300 nm mikrosferleri dikdörtgenlerle art arda çerçevelemek için yukarıdaki adımları tekrarlayın ve bunları sırasıyla R5 ve R6 olarak yeniden adlandırın.
4. Son olarak, elektronik gürültüye ve R8 olarak tanımlanan 200 nm parçacıkların konumuna göre 50-200 nm sıralama bölgesini belirleyin.
   NOT: 50 nm'lik alt algılama sınırı, akış hücresi sıralayıcısının elektronik gürültüsünün hemen üzerine yerleştirilir. Bu nedenle gürültü ile 200 nm mikrosfer popülasyonu arasındaki bölge 50-200 nm arasında tanımlanabilir.
5. Sıralama kararlarını sıralama mantığı ve istatistikler panelinde düzenleyin. Soldaki (L1) akışın boş alanına çift tıklayın. Sıralama mantığını oluşturmak için R8 adlı bölgeyi seçin. Saflığın İptal modunu seçin ve L1 akışı için 1 damlalık bir damlacık zarfı seçin.
6. Adım 2.3'ten itibaren 500 μL EVs karışımı örneği yükleyin. Veri almak için Summit'teki edinme menüsünün altındaki Başlat düğmesine basın ve ardından 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 50-200 nm sEV toplamak için sıralama menüsünde Başlat'a basın.
   NOT: Herhangi bir prosedür sırasında kontaminasyonu en aza indirmek için steril bir ortam gereklidir.
7. İletim elektron mikroskobu (TEM) ile sEV'nin varlığını gözlemleyin ve NTA kullanarak sEV'nin parçacık boyutunu doğrulayın. CD9, CD63 ve CD81 belirteçleri^18'in ifadesini daha fazla doğrulamak için batı lekesi (WB) analizi gerçekleştirin.

Sonuçlar

Deneysel protokolün akış şeması diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu yöntemde, partikül boyutu dağılımı için referans standartlar olarak standart boyutlu polistiren mikrosferler kullanılmıştır. Belirli enstrümantal parametre koşulu altında, parçacık sinyali, logaritmik form kullanılarak FSC ve SSC grafiğindeki arka plan gürültüsünden açıkça ayırt edilebilir. Geçit stratejileri Şekil 2'de gösterilmiştir. R4, R5 ve R6, sı...

Tartışmalar

Bu protokol, NTA tarafından doğrulanan bir akış hücresi sıralayıcısı kullanarak 50-200 nm'lik belirtilen parçacık boyutuyla sEV'yi izole etmek ve saflaştırmak için optimize edilmiş bir yöntemi özetlemektedir. Yöntem, düzgün parçacık boyutu ve yüksek saflıkta sEV elde etme darboğazı problemini çözdü ve büyük boyutlu EV'lere sarılmış ilgisiz biyolojik moleküllerin müdahalesini önledi²². Saniyede 100.000 parçacık yakalayabilen ve saniyede 70.000 sıralama karar?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Beckman Coulter	344058
Culture flasks	Corning	430641
Dulbecco’s modified eagle medium	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal bovine serum	SUER	SUER050QY
Flow cell sorter	Beckman Coulter	Moflo Astrios EQ
Human pancreatic cancer cell, PANC-1	NA	NA	PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University
Laser particle size and zeta potential analyzer	Malvern	Zetasizer Nano ZS 90
Phosphate buffer saline	Gibco	C20012500BT
Polystyrene fluorescent microspheres	Beckman Coulter	6602336
Transmission electron microscopy	JEOL	JEM-1200EX
Trypsin-EDTA solution	Gibco	1713949
Ultra rainbow fluorescent particles	Beckman Coulter	B28479
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima-L80XP
Ultracentrifuge rotor	Beckman Coulter	SW32TI