2D Hücre Kültürü Modelinde Verteporfin Sitotoksisitesini Arttırmak için Şirket İçi İnşa Edilmiş ve Işık Yayan Diyot Tabanlı Fotodinamik Terapi Cihazı

Özet

Burada, iki boyutlu HeLa hücre kültürü ve verteporfin kullanarak in vitro fotodinamik terapi (PDT) testlerini başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihazı fotosensitizör olarak tanımladık.

Özet

Bu yazıda, PhotoACT adı verilen in vitro fotodinamik terapi (PDT) tahlillerini gerçekleştirmek için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihaz açıklanmaktadır. Cihaz, bir dizi geleneksel programlanabilir ışık yayan diyot (LED), bir sıvı kristal ekran (LCD) modülü ve ticari bir mikrodenetleyici kartına bağlı bir ışık sensörü kullanılarak üretilmiştir. Prototipin kutu tabanlı yapısı, orta yoğunluklu suntalarla (MDF'ler) yapıldı. İç bölme aynı anda dört hücre kültürü multiwell mikroplakasını tahsis edebilir.

Kavramın bir kanıtı olarak, iki boyutlu (2D) kültürde fotosensitizör (PS) verteporfinin HeLa hücre hattına karşı sitotoksik etkisini inceledik. HeLa hücreleri 24 saat boyunca artan verteporfin konsantrasyonları ile tedavi edildi. İlaç içeren süpernatant ortam atıldı, yapışkan hücreler fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı ve ilaçsız ortam eklendi. Bu çalışmada, verteporfinin hücreler üzerindeki etkisi, ışığa maruz kalmadan veya 255, 255 ve 255 kırmızı-yeşil-mavi (RGB) değerleri (ortalama akıcılık 49.1 ± 0.6 J /^cm2) kullanılarak ışığa 1 saat maruz kaldıktan sonra incelenmiştir. 24 saat sonra, hücre canlılığı 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi ile değerlendirildi.

Deneysel sonuçlar, verteporfin ile muamele edilen hücrelerin cihazdan gelen ışığa maruz kalmasının, reaktif oksijen türlerinin (ROS) aracılık ettiği bir mekanizma aracılığıyla ilacın sitotoksik etkisini arttırdığını göstermiştir. Ek olarak, bu çalışmada açıklanan prototipin kullanımı, sonuçların ticari bir PDT cihazı ile karşılaştırılmasıyla doğrulanmıştır. Bu nedenle, bu LED tabanlı fotodinamik terapi prototipi, PDT'nin in vitro çalışmaları için iyi bir alternatiftir.

Giriş

En ölümcül bulaşıcı olmayan hastalıklar arasında kanser, erken ölümün küresel bir önde gelen nedenini temsil etmektedir. 2020'de yaklaşık 10 milyon ölümden sorumluydu ve dünya çapında altı ölümden birini temsil^{ediyordu 1}. Ek olarak, çoklu ilaç direnci (MDR) fenomeni, onaylanmış kemoterapötik protokoller bu klinik durum² için remisyon aşamalarına ulaşamaaşamadığından muazzam bir halk sağlığı tehdidini temsil etmektedir. Kanser hücreleri çeşitli mekanizmalarla kemoterapiye direnç geliştirebilir; Bununla birlikte, bazı ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılarının (ATP'ye bağımlı efflux pompalar) aşırı ekspresyonu, bir tümör mi....

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Cihaz yapımı

1. Testere 3 mm kalınlığında orta yoğunluklu suntalar (MDF) Şekil 1A'da gösterilen boyutlara sahip parçalar elde etmek için.
   NOT: Bilgisayar sayısal denetimi (CNC) kesimi için vektör dosyasını (Ek Dosya 1) kullanın.
2. Aşağıdaki boyutlarda iki kutu oluşturun (uzunluk x genişlik x yükseklik): Büyük kutular için 330 mm x 235 mm x 225 mm ve küçük kutular için 300 mm x 220 mm x 150 m (Şekil 1....

Sonuçlar

PhotoACT olarak adlandırılan son PDT cihazı, dört adede kadar çok kuyulu mikro plakayı tahsis etmek için karanlık bir oda içeriyordu ve üst iç yüzeyi, farklı görünür ışık spektrumları yaymak üzere programlanmış 30 dağınık LED seti ile donatılmıştı (Şekil 3 ve Ek Dosya 6). Cihaz iki ilişkili kutu kullanılarak inşa edilmiştir: PDT tahlilleri için karanlık bir oda olarak tasarlanmış bir iç kutu ve iç odayı örtmek ve kontrol ünitesini .......

Tartışmalar

Son PhotoACT cihazı, ticari olarak temin edilebilen, düşük maliyetli bileşenlerle toplam maliyeti 50 dolardan az olan bileşenlerle inşa etmek için uygundu. Ek avantajlar arasında düşük bakım talepleri, birden fazla kültür plakası türünü ışınlama kapasitesi, tahlil başına dört üniteye kadar aynı anda kullanım, taşınabilirliğe izin veren düşük ağırlık (2 kg) / boyut (44^cm3), doğru ve tekrarlanabilir ışınlama (veriler gösterilmemiştir) ve bilgisayarlara veya diğer makin.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer	Flashforge		Finder model
96-well plates			Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor			TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks			Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM High Glucose	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657029	FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer			Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL LED
Laminar Flow Hood			Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards			3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette			Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette			Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment	LumaCare		Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Gibco	10010031	Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips			Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥94% (HPLC)