JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bakteriyofajın DNA'yı bakteri hücreleri arasında hareket ettirme yeteneği, onları bakteriyel konakçılarının genetik manipülasyonu için etkili araçlar haline getirir. Burada, Borrelia burgdorferi'nin bir bakteriyofajı olan φBB-1'i, Lyme hastalığı spiroketinin farklı suşları arasında heterolog DNA'yı dönüştürmek için indüklemek, iyileştirmek ve kullanmak için bir metodoloji sunulmaktadır.

Özet

Spiroket Borrelia burgdorferi'ye yabancı DNA'nın sokulması, neredeyse sadece elektroporasyon kullanılarak transformasyonla gerçekleştirilmiştir. Bu işlem, Lyme hastalığı spiroketinde diğer, daha iyi karakterize edilmiş Gram-negatif bakterilere göre önemli ölçüde daha düşük verimliliğe sahiptir. Transformasyonun başarı oranı, belirli geçmişlerden konsantre miktarlarda yüksek kaliteli DNA'ya sahip olmaya büyük ölçüde bağlıdır ve önemli gerinim-gerinim değişkenliğine tabidir. B. burgdorferi'ye yabancı DNA'yı (yani mekik vektörleri, floresan muhabirleri ve antibiyotik direnci belirteçleri) sokmak için alternatif yollar, Lyme hastalığı spiroketinin genetik manipülasyonu için yararlı araçların silahlandırılmasına önemli bir katkı olabilir. Bakteriyofaj, transdüksiyon adı verilen bir süreçte DNA'nın bakteriler arasındaki hareketi için doğal mekanizmalar olarak iyi tanınmıştır. Bu çalışmada, hem aynı hem de farklı genetik geçmişlere sahip B. burgdorferi hücreleri arasında DNA'yı dönüştürmek için her yerde bulunan borrelial faj φBB-1'i kullanmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Dönüştürülmüş DNA, hem borrelial DNA'yı hem de küçük mekik vektörleri şeklinde heterolog DNA'yı içerir. Bu gösterim, Lyme hastalığı spiroketinin genetik manipülasyonu için elektroporasyonun bir tamamlayıcısı olarak faj aracılı transdüksiyonun potansiyel bir kullanımını önermektedir. Bu rapor, B. burgdorferi'den faj φBB-1'in indüksiyonu ve saflaştırılması, bu fajın transdüksiyon tahlillerinde kullanımı ve potansiyel transdüktanların seçimi ve taranması için yöntemleri açıklamaktadır.

Giriş

Spiroketal bakteri Borrelia burgdorferi'nin genetik manipülasyonu için araçların geliştirilmesi, Lymehastalığının 1,2,3,4 doğasının anlaşılmasına ölçülemez bir değer katmıştır. B. burgdorferi, küçük bir doğrusal kromozomdan ve hem doğrusal hem de dairesel plazmidlerden oluşan alışılmadık derecede karmaşık bir genoma sahiptir 5,6. Spontan plazmid kaybı, intragenik yeniden düzenleme (aynı organizma içinde genlerin bir plazmidden diğerine hareketi) ve yatay gen transferi (HGT, DNA'nın iki organizma arasındaki hareketi), B. burgdorferi arasında baş döndürücü miktarda genetik heterojenliğe yol açmıştır (örneğin, Schutzer ve ark.7'ye bakınız). Ortaya çıkan genotipler (veya "suşlar") aynı türün üyeleridir, ancak farklı memeli konakçılarına bulaşma ve enfekte etme yeteneklerini etkileyen genetik farklılıklara sahiptir 8,9,10,11. Bu raporda, "suş" terimi, doğal olarak türetilmiş belirli bir genetik geçmişe sahip B. burgdorferi'ye atıfta bulunmak için kullanılacaktır; "klon" terimi, belirli bir amaç için veya deneysel manipülasyonun bir sonucu olarak genetik olarak değiştirilmiş bir suşu ifade etmek için kullanılacaktır.

B. burgdorferi'de kullanılabilen moleküler araç kutusu, seçilebilir belirteçleri, gen muhabirlerini, mekik vektörlerini, transpozon mutagenezini, indüklenebilir promotörleri ve karşı seçilebilir belirteçleri içerir (bir inceleme için bkz. Drektrah ve Samuels12). Bu metodolojilerin etkili kullanımı, heterolog (yabancı) DNA'nın ilgilenilen bir B. burgdorferi suşuna yapay olarak sokulmasını gerektirir. B. burgdorferi'de, heterolog DNA'nın tanıtılması neredeyse tamamen elektroporasyon yoluyla elde edilir; bu, bir bakteri zarını ortama sokulan küçük DNA parçalarına geçici olarak geçirgen hale getirmek için bir elektrik darbesi kullanan bir yöntemdir1. Hücrelerin çoğunluğu (≥% 99.5) olduğu tahmin edilmektedir, ancak kalan hücreler heterolog DNA13'ü tutma sıklığı yüksektir. DNA'yı bakterilere sokmanın en etkili yöntemlerinden biri olarak kabul edilmesine rağmen, B. burgdorferi'ye elektroporasyon sıklığı çok düşüktür (5 × 104 ila 5 × 106 hücrede 1 dönüştürücü arasında değişmektedir)13. Daha yüksek dönüşüm frekanslarına ulaşmanın önündeki engeller hem teknik hem de biyolojik gibi görünmektedir. B. burgdorferi'nin başarılı elektroporasyonunun önündeki teknik engeller, elektroremetuar hücreleri hazırlarken hem gerekli olan DNA miktarını (>10 μg) hem de spiroketlerin tam olarak doğru büyüme aşamasında (orta log, 2 ila 10 7 hücre · mL-1 ve7 ×× 107 hücre · mL − 1) olma gereksinimini içerir12,13. Bununla birlikte, bu teknik engellerin üstesinden gelmek biyolojik engellerden daha kolay olabilir.

Lyme hastalığı araştırmacıları, B. burgdorferi klonlarının genetik olarak manipüle edilme yetenekleri açısından iki geniş kategoriye ayrılabileceğini kabul etmektedir13,14. Yüksek pasajlı, laboratuara uyarlanmış izolatlar genellikle kolayca dönüştürülür, ancak genellikle bulaşıcılık için gerekli olan plazmidleri kaybetmiş, fizyolojik olarak anormal bir şekilde davranmış ve bir memeli konağını enfekte edememiş veya bir kene vektörü12,13 içinde devam edememiştir. Bu klonlar, spiroketin moleküler biyolojisini laboratuarda incelemek için yararlı olsa da, spiroketi enzootik döngünün biyolojik bağlamında incelemek için çok az değere sahiptir. Öte yandan, düşük pasajlı enfeksiyöz izolatlar, enfeksiyöz bir durumu yansıtan fizyolojik bir şekilde davranırlar ve enfeksiyöz döngüyü tamamlayabilirler, ancak genellikle heterolog DNA'nın girişine inatçıdır ve bu nedenle, çalışma12,13 için manipüle edilmesi zordur. Düşük pasajlı izolatların dönüştürülmesindeki zorluk, en az iki farklı faktörle ilgilidir: (i) düşük pasajlı izolatlar, özellikle elektroporasyon için gerekli olan yüksek yoğunluklu koşullar altında, genellikle sıkıca bir araya toplanır, böylece birçok hücrenin elektrik yükünün tam olarak uygulanmasını veya ortamdaki DNA'ya erişimini engeller13,15; ve (ii) B. burgdorferi, yüksek pasajlı izolatlarda kaybolabilecek en az iki farklı plazmid kaynaklı kısıtlama-modifikasyon (R-M) sistemini kodlar14,16. R-M sistemleri, bakterilerin yabancı DNA'yı tanımasına ve ortadan kaldırmasına izin verecek şekilde evrimleşmiştir17. Gerçekten de, B. burgdorferi'de yapılan birkaç çalışma, DNA'nın kaynağı Escherichia coli13,16 yerine B. burgdorferi olduğunda dönüşüm verimliliğinin arttığını göstermiştir. Ne yazık ki, B. burgdorferi'den elektroporasyon için gerekli yüksek konsantrasyonda DNA elde etmek pahalı ve zaman alıcı bir olasılıktır. Düşük pasajlı izolatların elektroporasyonu ve seçilmesi sırasında bir diğer potansiyel endişe, işlemin kritik virülansla ilişkili plazmidi kaybetmiş transformantları tercih ediyor gibi görünmesidir, lp2514,18,19; Bu nedenle, düşük pasajlı B. burgdorferi izolatlarını elektroporasyon yoluyla genetik olarak manipüle etme eylemi, enzootik döngü20 içinde biyolojik olarak ilgili analizler için uygun olmayan klonları seçebilir. Bu sorunlar göz önüne alındığında, heterolog DNA'nın yüksek pasajlı B. burgdorferi klonlarına elektrotransforme edilebileceği ve daha sonra elektroporasyon dışında bir yöntemle düşük pasajlı enfeksiyöz izolatlara aktarılabileceği bir sistem, Lyme hastalığı spiroketinde kullanılmak üzere mevcut moleküler araçların artan koleksiyonuna hoş bir katkı olabilir.

Transformasyona (çıplak DNA'nın alımı) ek olarak, bakterilerin düzenli olarak heterolog DNA'yı aldıkları iki mekanizma daha vardır: birbirleriyle doğrudan fiziksel temas halinde olan bakteriler arasındaki DNA değişimi olan konjugasyon ve bir bakteriyofaj21 tarafından aracılık edilen DNA değişimi olan transdüksiyon. Gerçekten de, bakteriyofajın HGT'ye aracılık etme yeteneği, bir dizi bakteri sistemi içindeki moleküler süreçleri incelemek için deneysel bir araç olarak kullanılmıştır22,23,24. B. burgdorferi, çıplak DNA'nın alımı için doğal olarak yetkin değildir ve B. burgdorferi'nin başarılı konjugasyonu teşvik etmek için gerekli aparatı kodladığına dair çok az kanıt vardır. Bununla birlikte, önceki raporlar, B. burgdorferi25,26,27,28'in ılıman bir bakteriyofajı olan φBB-1'in tanımlanmasını ve ön karakterizasyonunu tanımlamıştır. φBB-1, B. burgdorferi25'te bulunan 30 kb'lik bir plazmid ailesini paketler; bu ailenin üyeleri cp32s olarak belirlenmiştir. B. burgdorferi suşları arasında HGT'ye katılmada φBB-1'in rolüyle tutarlı olarak, Stevenson ve ark., aksi takdirde farklı cp32'lere sahip iki suşta bulunan özdeş bir cp32 bildirmiştir, bu da bu cp32'nin bu iki suş arasında, muhtemelen transdüksiyon29 yoluyla yakın zamanda paylaşıldığını düşündürmektedir. Ayrıca, aksi takdirde nispeten kararlı bir genom 30,31,32,33'te cp32'ler arasında HGT yoluyla önemli rekombinasyon kanıtı vardır. Son olarak, φBB-1'in hem cp32'leri hem de heterolog mekik vektör DNA'sını aynı suşun hücreleri arasında ve iki farklı suşun hücreleri arasında dönüştürme kabiliyeti daha önce27,28 gösterilmiştir. Bu bulgular göz önüne alındığında, φBB-1, B. burgdorferi'nin moleküler biyolojisinin diseksiyonu için geliştirilecek başka bir araç olarak önerilmiştir.

Bu raporun amacı, B. burgdorferi'den faj φBB-1'i indüklemek ve saflaştırmak için bir yöntemi detaylandırmak, ayrıca B. burgdorferi klonları arasında bir transdüksiyon testi yapmak ve potansiyel transdüktörleri seçmek ve taramak için bir protokol sağlamaktır.

Protokol

Rekombinant DNA ve BSL-2 organizmalarını kullanan tüm deneyler Quinnipiac Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. φBB-1 üretimi için B. burgdorferi kültürünün hazırlanması

  1. Barbour-Stoenner-Kelly besiyerini% 6.6 ısıda inaktive edilmiş normal tavşan serumu (BSK) ile desteklenmiş olarak hazırlayın 15. 1 L 1x BSK için, Tablo 1'de listelenen bileşenleri 900 mL suda birleştirin, 1 N sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7.6'ya ayarlayın ve 2-4 saat boyunca 4 ° C'de yavaşça karıştırın. Karıştırma tamamlandıktan sonra, gerekirse pH'ı kontrol edin ve 7.6'ya yeniden ayarlayın ve hacmi suyla 1 L'ye yükseltin. 0,22 μM'lik bir filtreden geçerek ortamı sterilize edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ≤2 ay boyunca taze kullanın veya 4 °C'de saklayın.
  2. Transdüksiyon protokolüne başlamadan üç ila beş gün önce, uygun B. burgdorferi klonlarının 150 μL'sini sıkıca kapatılmış steril konik santrifüj tüplerinde 15 mL 1x BSK'ya aşılayın (bkz. B. burgdorferi klon (lar) daki heterolog DNA'nın seçimi ve bakımı için ortamı uygun konsantrasyonda antibiyotik veya antibiyotik kombinasyonu ile destekleyin (Tablo 2).
    NOT: B. burgdorferi biyogüvenlik seviye 2 organizmasıdır. Bu organizma ile çalışırken tüm uygun önlemleri alın. B. burgdorferi'nin canlı kültürleri ile tüm çalışmaları sertifikalı ve uygun şekilde dezenfekte edilmiş sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. B. burgdorferi ve organizmaların kendileri ile temas eden tüm materyalleri CDC yönergeleri34'e dayanarak uygun şekilde imha edin.
  3. Kültürler ≥5 × 107 spiroket · mL−1 yoğunluğa ulaşana kadar kültürleri sallamadan 33 ° C'de inkübe edin, bu da yaklaşık 3-5 gün sürer.

2. B. burgdorferi kültür(ler)inin yoğunluğunu belirleyin (Samuels'ten modifiye edilmiştir)15

  1. 5 × 106 hücre·mL−1'in üzerinde olması beklenen yoğunluklar için, spektroskopi kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin.
    1. 1 mL kültürü 1,7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın.
    2. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 ve 1.8 mM KH2PO4) içinde yeniden askıya alın. Tüm hücre süspansiyonunu yarı mikro UV şeffaf bir küvete aktarın.
    3. Yeniden askıya alınan numunenin optik yoğunluğunu 600 nm (A600) dalga boyunda belirleyin. Spektrofotometreyi PBS'ye karşı sıfırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
    4. Orijinal kültürdeki spiroketlerin konsantrasyonunu hesaplamak için·mL−1 , A 600'deki optik yoğunluğu10 9'× 1,4 ile çarpın.
  2. 5 × 104 hücre · mL − 1 ve 5 × 106 hücre · mL − 1 arasında olması beklenen yoğunluklar için, spiroket sayısını doğrudan saymak için bir Petroff-Hausser sayma odası kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin ( bkz. Bu yöntem, uygun seyreltmeyi takiben daha yüksek yoğunluklar için de kullanılabilir.
    NOT: Canlı spiroketlerin görselleştirilmesi, karanlık alan kondenseri ile modifiye edilmiş bir mikroskop gerektirir.
    1. Sayım odasına 10 μL numune uygulayın ve uygun kapak camı ile örtün. 1 × 107'den daha yüksek yoğunluklar için, numuneyi PBS'de seyrelterek alan başına 50-100 spiroket elde edin.
    2. Karanlık alan mikroskobu kullanarak hücreleri 200x-400x büyütmede sayın. Tüm düzlemlerde 16 küçük karelik 25 grubun tüm alanını sayın.
    3. Orijinal kültürün hücreleri · mL − 1 elde etmek için seyreltme faktörü (varsa) ve 5 × 10 4 ile sayılan sayıyı çarpın.

3. B. burgdorferi fajının indüksiyonu φBB-1

NOT: Tüm cam eşyaları ve plastik eşyaları otoklavlama ile sterilize edin; 0,22 μM filtre ile otoklavlama veya filtreleme yoluyla tüm çözeltileri sterilize edin. Aşağıdaki adımlar 15 mL'lik hacimlere göre sunulmuştur, ancak yöntem, deneyin bireysel ihtiyaçlarına bağlı olarak daha küçük veya daha büyük hacimlere ölçeklenebilir.

  1. Fajın üretileceği B. burgdorferi kültürü için (donör), 2 × 108 spiroket · mL−1'in 4 mL'sini vermek için gereken başlangıç kültürünün hacmini belirlemek için adım 2'deki her iki yöntemle hesaplanan konsantrasyonu kullanın. Bu, iyileşme aşamasında 15 mL'de 5 × 107 spiroket · mL − 1 nihai konsantrasyonunu verecektir (aşağıdaki adım 3.6).
  2. Adım 3.1'de hesaplanan kültür hacmini 10 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj edin. Süpernatantı boşaltın ve peleti 4 mL taze BSK'da yeniden askıya alın. numuneyi, numuneyi minimum kafa boşluğu ile tutmak için mevcut en küçük steril tüpe aktarın.
  3. Faj üretimini indüklemek için 4 mL'lik bir kültür hacmine dayanarak önerilen konsantrasyona (Tablo 3) uygun miktarda indükleyici ajan ekleyin. Tüpü sıkıca kapatın ve iyice karıştırın.
  4. Numuneyi 2-4 saat boyunca 33 ° C'de inkübe edin.
  5. Kuluçkadan sonra, numuneyi 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi 10 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı dekant.
  6. Hücre peletini 15 mL'lik 1x BSK'da yeniden askıya alın.
    NOT: Fajın indüklenmesinden sonra, transdüksiyon testine devam etmenin iki farklı yolu vardır. Bu yöntemler Şekil 1'de ve adım 4 ve adım 6'da sunulmuştur.

4. Donörün indükleyici ajana maruz kalmasını takiben ko-kültür sırasında transdüksiyon (Şekil 1A)

NOT: Bu protokol yalnızca faj üreten suşun (donör) belirli bir antibiyotiğe direnci olduğunda ve dönüştürülecek suşun (alıcı) başka bir antibiyotiğe direnci olduğunda kullanılabilir.

  1. Yukarıdaki adım 1'de donör suşu için açıklandığı gibi, transdüksiyon tahlillerinde alıcı olarak kullanılmak üzere bir B. burgdorferi kültürü hazırlayın. Adım 2'de olduğu gibi belirlenen yoğunluğa dayanarak, 107 spiroket · mL−1 15 mL'lik 15 mL'lik × gereken hacmi hesaplayın.
  2. Adım 4.1'de hesaplanan kültür hacmini 10 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj edin. Süper natantı dekant.
  3. Peleti 1 mL kültürde adım 3.6'dan (yeniden askıya alınmış faj donörü) yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan alıcıyı donörle birlikte kültüre geri ekleyin. Antibiyotik takviyesi yapmayın. Her iki kültürü de içeren toplam hacim 15 mL'dir.
  4. 72-96 saat boyunca 33 ° C'de inkübe edin.
  5. Adım 7'de açıklandığı gibi ko-kültürden sonra katı faz kaplaması ile transdüktanların seçimini gerçekleştirin.

5. Transdüksiyon testinde kullanılmak üzere fajı geri kazanmak için polietilen glikol (PEG) çökeltisi

NOT: Bu protokol, faj üreten suşun (donör) belirli bir antibiyotiğe karşı direnci olduğu ve dönüştürülecek suşun (alıcı) antibiyotik direncinin veya başka bir antibiyotiğe direncinin olmadığı durumlarda kullanılabilir.

  1. Kültürü, adım 3.6'dan itibaren, Tablo 2'de belirtilen konsantrasyonda uygun antibiyotik ile destekleyin. Numuneyi 72-96 saat boyunca 33 ° C'de inkübe edin.
  2. PEG çökeltmesi için çözümler hazırlayın.
    1. 500 mL'lik 5 M NaCl hazırlayın. Otoklavlama ile sterilize edin ve kullanmadan önce soğumaya bırakın. Oda sıcaklığında saklayın.
    2. 200 g PEG8000'i 400 mL suda çözerek 500 mL% 40 PEG hazırlayın; Çözelti iyice karışana kadar karıştırırken hafifçe ısıtın. Hacmi suyla 500 mL'ye kadar getirin. PEG8000'i tamamen çözmek ve çözeltiyi sterilize etmek için, çözeltiyi otoklav edin ve kullanmadan önce soğutun. Oda sıcaklığında saklayın.
    3. 100 mL süspansiyon ortamı hazırlayın (SM; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4 ve 50 mM Tris-HCl [pH 7.5]). Otoklavlama ile sterilize edin. 4 °C'de saklayın.
  3. Donör B. burgdorferi klonundan (adım 3.6'dan itibaren) fajın PEG çökeltilmesi için, 72-96 saatlik inkübasyondan sonra, numuneleri 4 ° C'de 20 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj edin.
  4. Süpernatantı temiz bir 50 mL konik tüpe boşaltın; hücre peletini atın. 1 M'lik son konsantrasyona 5 M NaCl ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca yavaşça sallayın.
  5. Numuneleri 8.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı temiz bir 50 mL konik tüpe boşaltın; pelet küçük veya hiç olmayabilir. Süpernatanta% 40 PEG8000 çözeltisini% 10'luk bir nihai konsantrasyona ekleyin. İyice karıştırın ve gece boyunca 1 saatten fazla buz üzerinde ayarlayın.
    NOT: Daha uzun süreler, önemli ölçüde artmış faj geri kazanımı ile ilişkili görünmemektedir.
  6. Numuneleri 8.000 x g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve faj parçacıklarını içeren herhangi bir pelet kaybetmeden mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın.
  7. Pelet, şişenin kenarını yıkamak ve potansiyel faj parçacıklarını toplamak için SM'yi kullanarak minimum SM hacminde yeniden askıya alın. Önerilen oran, 10 mL orijinal süpernatan başına 400 μL SM'dir, ancak peletin boyutuna bağlı olarak, tam süspansiyon için az ya da çok SM gerekebilir.
  8. Geri kazanılan faj numunesini, resüsitasyon hacmine bağlı olarak eşit miktarda kloroform ile tedavi edin. Numuneyi iyice karıştırın ve ardından 10 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın. Sulu (üst) tabakayı temiz bir tüpe çıkarın ve kalın arayüz katmanlarından herhangi birini önleyin.
    NOT: φBB-1 zarfsız bir bakteriyofajdır ve kloroform tedavisine duyarlı değildir25. Bu adım, membrana bağlı herhangi bir yapıyı (yani hücreler veya blebler) daha da bozmak ve potansiyel hücresel kirleticileri öldürmek için yapılır. Kloroform uçucu bir organiktir ve sadece iyi havalandırılan bir duman davlumbazında kullanılmalıdır; kloroform içeren malzemeyi organik atık olarak atın.
  9. İlk kloroform işleminden sonra geri kazanılan hacmi belirleyin ve numuneyi tekrar bu hacmin% 10'una eşit miktarda kloroform ile tedavi edin. İyice karıştırın ve 10 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın. Sulu (üst) tabakayı çıkarın, herhangi bir arayüz veya organik tabakadan kaçınmaya dikkat edin. Sulu tabakayı temiz bir tüpe aktarın.
  10. Fajı hemen kullanın (adım 6'da açıklandığı gibi) veya 4 ° C'de saklayın.
    NOT: φBB-1 faj numunelerinin dondurulması önerilmez. φBB-1'in 4 ° C'deki stabilitesi titizlikle araştırılmamış olmasına rağmen, geri kazanımdan sonra 1 aya kadar 4 ° C'de saklanan örnekler transdüksiyon tahlillerinde başarıyla kullanılmıştır.

6. φBB-1'in PEG çökelmesini takiben transdüksiyon testi (Şekil 1B)

  1. Yukarıdaki adım 1'de donör suşu için açıklandığı gibi, transdüksiyon tahlillerinde alıcı olarak kullanılmak üzere B. burgdorferi kültürlerini hazırlayın. Adım 2'de olduğu gibi belirlenen yoğunluğa dayanarak, 107 spiroket · mL−1'in 15 mL'sini 15 mL'lik × için gereken alıcı kültür hacmini hesaplayın.
  2. Adım 6.1'de hesaplanan kültür hacmini 10 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj edin. Süpernatantı boşaltın ve peleti 14.5 mL taze BSK'da yeniden askıya alın.
  3. Alıcı klonun kültürüne ≤500 μL PEG çökeltilmiş faj örneği (adım 5'ten itibaren) ekleyin. İyice karıştırın ve 72-96 saat boyunca 33 ° C'de inkübe edin.
    NOT: PEG çökelmesi sırasında geri kazanılan faj miktarı, bir dizi faktöre bağlı olarak değişebilir. Bununla birlikte, indüklenmiş B. burgdorferi suşu CA-11.2A'nın 15 mL kültüründen, 500 μL tipik olarak 50-1.000 canlı faj28 içerir. Faj geri kazanım hacimleri ≥500 μL, muhtemelen SM'nin BSK'ya oranının artması nedeniyle B. burgdorferi büyümesini olumsuz yönde etkiler.
  4. Transdüktanların seçimini, adım 7'de açıklandığı gibi PEG çökeltilmiş faj ile karıştırdıktan sonra katı faz kaplaması ile gerçekleştirin.

7. Transdüktörlerin seçimi

NOT: Potansiyel transdüktanların katı faz kaplaması, ilk olarak Samuels15 tarafından tanımlanan protokolün tek katmanlı bir modifikasyonu kullanılarak gerçekleştirilir. B. burgdorferi kolonileri agar içinde büyür, bu nedenle katı faz kaplama ile transdüktanların seçimi için, plakalar dökülürken numuneler ortama eklenmelidir. 96 delikli plakalarda bir seyreltme yöntemi kullanılarak transformantların seçimi için alternatif bir yöntem de daha önce35 olarak tanımlanmıştır. Bu teknik, transdüktanların seçiminde de etkili olabilir, ancak bu amaç için henüz denenmemiştir.

  1. Transdüktör seçimi için gerekli plaka sayısını, transdüksiyon tahlillerinden ve kaplanacak kontrollerden alınan numune sayısına göre belirleyin.
    NOT: Tipik olarak, numune başına biri kültür hacminin yaklaşık% 10'una eşdeğer ve diğeri kültürün geri kalanını içeren iki plaka dökülür. Ek olarak, donör ve alıcı olarak kullanılan faj preparatının ve / veya ebeveyn klonlarının, seçim sırasında kullanılan antibiyotik (ler) in varlığında büyümediğini bireysel olarak test etmek için negatif kontroller görevi gören plakaları dökün. En az iki ekstra plaka için kaplama malzemesi hazırlanması da önerilir. Örneğin, kaplanacak numune ve kontrol sayısı sekiz ise, 10 plaka için yeterli kaplama karışımı hazırlayın.
  2. Aşağıda açıklandığı gibi kaplama için çözümler hazırlayın.
    NOT: Her plaka, kaplama için 20 mL 1,5x BSK ve 10 mL% 2,1 agarozdan (2:1 oranında) oluşan 30 mL olacaktır. Bu, son konsantrasyonları 1x BSK ve% 0.7 agaroz olan bir plaka verecektir. Örneğin, 10 plaka için, 200 mL 1.5x BSK ve 100 mL% 2.1 agarozdan oluşan toplam 300 mL'lik bir kaplama karışımı hazırlayın.
    1. Tablo 1'de 1,5x BSK için listelenen her bileşenin miktarlarını kullanarak adım 1.1'de 1x BSK için açıklandığı gibi 1,5x BSK'nın 1 L'sini hazırlayın. 1x BSK için açıklandığı gibi saklayın.
    2. Suda% 2.1 agaroz ve otoklav hazırlayın. Agaroz çözeltisini taze kullanın veya oda sıcaklığında saklayın. Oda sıcaklığında saklanırsa, kaplamadan önce tamamen eriyene kadar kapağı gevşek bir şekilde açık mikrodalga fırında pişirin.
    3. Tüm kaplama karışımına bağlı olarak uygun konsantrasyonu elde etmek için gereken antibiyotik (ler) hacmini belirleyin (Tablo 2).
      NOT: Son kaplama çözeltisinin toplam hacmi 300 mL ise, 300 mL'nin tamamının doğru nihai antibiyotik konsantrasyonuna sahip olduğundan emin olmak için 200 mL 1.5x BSK ve yeterli antibiyotik karıştırın. Transdüksiyon tahlilindeki hem donör hem de alıcı farklı antibiyotik direnci genlerine sahipse, kaplama karışımı her iki antibiyotiği de içermelidir. Donörden gelen PEG çökeltilmiş faj (adım 5'te hazırlandığı gibi) bir antibiyotik direnci belirtecini kodlarsa ve alıcıda hiç yoksa, kaplama karışımı sadece bir antibiyotik içermelidir.
  3. Dökülecek plaka sayısına bağlı olarak, uygun miktarda 1,5x BSK ve antibiyotik (ler) i tüm kaplama karışımını tutacak kadar büyük steril bir şişeye aktarın. 56 °C'de bir su banyosunda ≥15 dakika boyunca dengeleyin.
  4. Erimiş agarozu otoklav veya mikrodalgadan 56 ° C'lik bir su banyosunda ≥15 dakika boyunca dengeleyin.
  5. Dengelemeden sonra, belirlenen miktar% 2.1 agarozu şişeye 1.5x BSK (antibiyotikli) ile ekleyin ve kaplama çözeltisini 10-15 dakika boyunca 42 ° C'de su banyosuna geri koyun.
    NOT: Daha yüksek sıcaklıklar spiroketlere zarar verebilir veya onları öldürebilir36. Yukarıdaki gibi aynı su banyosunu kullanıyorsanız, denge için zamanlayıcıyı başlatmadan önce su banyosunu 42-45 ° C'ye soğutun. Kaplama çözeltisinin 42 ° C'de 20 dakikadan fazla dengelenmesine izin vermeyin, aksi takdirde plakaları dökerken katılaşmaya başlayacaktır.
  6. Dengeleme sırasında, kaplanacak B. burgdorferi örneklerini hazırlayın. Kaplanacak miktarı steril 50 mL konik santrifüj tüpe aktarın (bkz.
    1. 1,5 mL'den (son 30 mL'lik plaka hacminin %<5'i) daha az bir miktar kaplanıyorsa, numuneyi yeni boruya aktarın ve kaplama sırasında kaplama karışımını doğrudan numuneye ekleyin.
    2. Daha büyük hacimler için, istenen kültür hacmini yeni tüpe aktarın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantın 100-500 μL hariç hepsini boşaltın ve geri kalanını kaplamadan önce peleti tamamen askıya almak için kullanın.
    3. Ko-kültürü takip eden kontrol plakaları için, steril 50 mL konik santrifüj tüplerine donör veya alıcı klonlarının ≥107 hücrelerini ekleyin. Hacim 1,5 mL'nin üzerindeyse, peleti 7.6.2. adımda olduğu gibi santrifüj edin ve yeniden askıya alın. PEG-çökeltilmiş faj kullanılarak bir transdüksiyon testi yapılmışsa, alıcı klonuna ek olarak, faj örneğinin 100-250 μL'sini kaplama için steril bir 50 mL konik tüpe ekleyin.
  7. Kaplama çözeltisi 10-15 dakika boyunca 42-45 ° C'de dengelendikten sonra, kaplama çözeltisinin 30 mL'sini uygun numune ile bir tüpe aktarın; hemen kaplama karışımını ve numuneyi etiketli bir plakaya dağıtın. Kaplanacak her numune için taze bir pipetle tekrarlayın.
  8. Plakaların 15-20 dakika boyunca katılaşmasına izin verin ve% 5 CO2 ile desteklenmiş 33 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Döküldükten sonra plakaları en az 48 saat ters çevirmeyin.
  9. Alıcı klonun arka planına bağlı olarak, kolonilerin 10-21 günlük inkübasyondan sonra seçim plakalarındaki agaroz içinde görünüp görünmediğini kontrol edin. Borosilikat pipetinde sterilize pamuk tıkaçlı 5.75 kullanarak her iki antibiyotik varlığında plakada yetişen en az 5-10 koloni seçin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları uygun antibiyotik (ler) ile 1.5 mL 1x BSK'ya aşılayın.
  10. Aşılanmış kolonileri, 3-5 gün boyunca adım 1.3'te olduğu gibi 33 ° C'de veya karanlık alan mikroskobu kullanarak 200x büyütmede alan başına yaklaşık 20-40 spiroket yoğunluğuna ulaşana kadar büyütün.
    NOT: Elendikten sonra (bkz. adım 8), spiroketler 0,22 μm'lik bir filtreden filtrasyonla sterilize edilmiş %60 gliserol ve %40 1x BSK karışımı ile eşit hacimli bir kültür karışımı karıştırılarak -80 °C'de uzun süreli depolama için dondurulabilir.

8. Potansiyel transdüktanların doğrulanması

NOT: Beklenen (alıcı) arka planda gerçek transdüktanları temsil ettiklerini doğrulamak için iki antibiyotik varlığında plakalar üzerinde büyüyen klonları tarayın. Bu yöntemler, polimeraz zincir reaksiyonu ile belirli bölgelerin amplifikasyonuna ve potansiyel olarak dizilenmesine dayanır. B. burgdorferi'de PCR gerçekleştirmenin ayrıntılı protokolleri ve uygulamaları başka bir yerde açıklanmıştır (yakın tarihli bir örnek için bakınız Seshu ve ark.37). Kullanılan suşlara göre transdüktanları taramak için kullanılan primerleri seçin. Transdüktörlerin taranmasına nasıl yaklaşılacağına dair bazı öneriler aşağıda açıklanmıştır.

  1. PCR taraması için B. burgdorferi lizatlarını hazırlayın.
    NOT: Aşağıdaki protokol, PCR ile DNA'nın derhal analizi için adım 7.9'da olduğu gibi yetiştirilen kültürlenmiş hücrelerden yıkanmış B. burgdorferi lizatları üretmek için kullanılır. Bu yöntem, BSK'daki potansiyel inhibitörlerin girişimini en aza indirmek için tasarlanmıştır, ancak dizileme veya depolama için yüksek kaliteli DNA üretmek için önerilmez. Bu amaçla, toplam genom ekstraksiyonu için bir protokol veya kit kullanın (bakınız Malzeme Tablosu). Ana klonlardan (hem donör hem de alıcı suşları) lizatların da her analize dahil edilmek üzere aynı anda hazırlanması şiddetle tavsiye edilir.
    1. Adım 7.10'da olduğu gibi seçilen ve kültürlenen her potansiyel transdüktörün 500 μL'sini temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    2. Kültürleri oda sıcaklığında 8.000 x g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    3. Süpernatantı çıkarın ve her peleti 500 μL TE (10 mM Tris Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH 8.0) içinde yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 8.000 x g'da 5 dakika santrifüj.
    4. Süpernatantı çıkarın ve her peleti 50 μL PCR kalitesinde suda yeniden askıya alın. Numuneleri 10 dakika kaynatın. Kısa bir süre soğumaya bırakın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın.
    5. Her PCR için, santrifüjlü numunenin üstünden hemen 2 μL kullanın; peleti rahatsız etmekten kaçının.
  2. PCR kullanarak antibiyotik direncini kodlayan spesifik genler için potansiyel transdüktanları tarayın. Transdüksiyon tahlillerinde yaygın olarak kullanılan antibiyotik direnci belirteçlerinin taranması için primerler için Tablo 4'e bakınız.
    NOT: Deneyimlerimize göre nadir olmakla birlikte, B. burgdorferi'de heterolog DNA seçimi için kullanılan aminoglikozit antibiyotiklerine spontan mutasyon meydana gelebilir.
  3. Arka planın alıcınınki olduğunu doğrulamak için başka bir gerinim veya klon işaretçisi kullanarak potansiyel transdüktörleri de tarayın. Bu analizlere hem donör hem de alıcı ebeveyn klonlarını dahil edin. Kullanılan suşlara dayalı diziler ve gerinim bütünlüğünü belirlemek için bireysel laboratuvar protokollerini kullanarak gerinime özgü belirteçlerin taranması.
  4. Kene vektörü veya memeli konağı içinde kullanılmak üzere veya başka bir klonla doğrudan karşılaştırmak için virülan klonlara dönüştürülmeye çalışılırsa, transdüktanların ve ana klonların tam plazmid içeriğini belirleyin. Bu, karşılaştırmalı suşunkiyle aynı plazmid içeriğini veya enzootik döngü içinde yayılım için gerekli genetik elementlerin varlığını sağlamak için yapılır, başka bir yerde açıklandığı gibi 18,19,37,38,39.

Sonuçlar

DNA'yı daha kolay dönüştürülebilir B. burgdorferi suşları veya elektrotransformasyona inatçı klonlar arasında hareket ettirmek için bakteriyofajın kullanılması, Lyme hastalığının belirleyicilerinin devam eden moleküler araştırması için başka bir aracı temsil eder. Burada tarif edilen transdüksiyon testi, potansiyel transdüktanların seçimi için bir veya iki antibiyotik kullanılarak DNA'nın ilgili klonlar arasındaki hareketini kolaylaştırmak için gerektiğinde değiştirilebili...

Tartışmalar

Transdüksiyonun kullanımı, B. burgdorferi1,4,13,37'nin elektrotransformasyonu ile ilişkili biyolojik ve teknik engellerin en azından bir kısmının üstesinden gelmenin bir yöntemini temsil edebilir. Birçok sistemde, bakteriyofaj, konakçı (profaj olmayan) DNA'yı, genelleştirilmiş veya uzmanlaşmış transdüksiyon22,23,24,49,50

Açıklamalar

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazar, yararlı tartışmaları için Shawna Reed, D. Scott Samuels ve Patrick Secor'a ve teknik yardımları için Vareeon (Pam) Chonweerawong'a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, Biyomedikal Bilimler Bölümü ve Quinnipiac Üniversitesi Sağlık Bilimleri Fakültesi'nden Christian H. Eggers'a fakülte araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)Millipore SigmaS2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)USA Scientific1450-0810holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)Millipore SigmaCAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)Thermo Fisher Scientific13-678-8Aautoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LEDot Scientific inc.AGLE-500
Bacto NeopeptoneGibcoDF0119-17-9
Bacto TC YeastolateGibco255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)Gemini Bio-Products700-104P
Chloroform (for molecular biology)Thermo Fisher ScientificBP1145-1CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)US BiologicalC5900-01cell culture grade
ErythromycinResearch Products International CorpE57000-25.0
Gentamicin reagent solutionGibco15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)Thermo Fisher ScientificBP350-500
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-500
Kanamycin sulfateThermo Fisher Scientific25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)Millipore SigmaSLGSM33SSto filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin CThermo Fisher ScientificBP25312CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamineMP Biomedicals, LLC100068
Oligonucleotides (primers for PCR)IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)G Biosciences786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)Thermo Fisher ScientificFB0875712
Petroff-Hausser counting chamberHausser scientificHS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glassHausser scientificHS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)Thermo Fisher ScientificBP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)Pel-Freez Biologicals31119-3heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettesUSA Scientific9750-9150
Sodium bicarbonateThermo Fisher ScientificBP328-500
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificBP358-1
Sodium pyruvateMillipore SigmaP8674-25G
Spectronic Genesys 5Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solutionMillipore SigmaS6501-50G
Trisodium citrate dihydrateMillipore SigmaS1804-500Gsodium citrate for BSK

Referanslar

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066 (2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195 (2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131 (1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331 (2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi.. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61 (2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165 (2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994 (2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7 (2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298 (1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S., Saier, M. H., Garcia-Lara, J. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. , 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. . Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 187Borrelia burgdorferibakteriyofajyatay gen transferitransd ksiyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır