JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İn vitro kültür, canlı bakterilerin varlığı için doğrudan bir tespit yöntemidir. Bu protokol, Borrelia burgdorferi sensu lato kompleksi, tekrarlayan ateş Borrelia türleri ve Borrelia miyamotoi dahil olmak üzere çeşitli Borrelia spiroketlerinin kültürü için yöntemleri açıklamaktadır. Bu türler titiz ve yavaş büyür, ancak kültürlenebilir.

Özet

Borrelia, B. burgdorferi sensu lato (s.l.) olarak da bilinen ve yakın zamanda Borreliella, tekrarlayan ateş (RF) grubu Borrelia ve üçüncü bir sürüngen ilişkili spiroket grubu olarak yeniden sınıflandırılan Lyme borreliosis (LB) grubundan oluşan üç tür grubundan oluşur. Kültüre dayalı yöntemler, hem araştırma hem de klinik çalışmalar için bakteriyel enfeksiyonların laboratuvar tespiti için altın standart olmaya devam etmektedir, çünkü vücut sıvılarından veya dokularından patojenlerin kültürü, çoğalan patojenleri doğrudan tespit eder ve araştırma için kaynak materyal sağlar. Borrelia ve Borreliella spiroketleri titiz ve yavaş büyür ve bu nedenle klinik amaçlar için yaygın olarak kültürlenmezler; Ancak, araştırma için kültür gereklidir. Bu protokol, B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis ve RFspiroketleri, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis ve B. miyamotoi. LB ve RF spiroketlerinin yetiştirilmesi için temel ortam, yerleşik kültürlerde spiroketlerin büyümesini güvenilir bir şekilde destekleyen Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II veya BSK-H) ortamıdır. İnokulumda başlangıç spiroket sayısının düşük olduğu kene veya konakçı kaynaklı örneklerden yeni izole edilmiş Borrelia izolatlarını yetiştirebilmek için, modifiye Kelly-Pettenkofer (MKP) ortamı tercih edilir. Bu ortam aynı zamanda B. miyamotoi'nin büyümesini de destekler.RF spiroketlerin yetiştiriciliğinin başarısı da kritik olarak bileşenlerin kalitesine bağlıdır.

Giriş

Borrelia, üç ana kladeyi kapsayan bir spiroket bakteri cinsidir: Lyme borreliosis (LB) grubu, tekrarlayan ateş (RF) grubu ve görünüşte sürüngenlerle sınırlı olan daha az iyi karakterize edilmiş bir grup. Borrelia taksonomisi, diğer birçok taksonomik grup 1,2,3,4,5,6,7 için geçerli olduğu gibi, genom ve proteom karşılaştırmalarına izin veren moleküler metodolojilerin ortaya çıkmasıyla uyum içindedir. LB grubu (Lyme hastalığı grubu olarak da adlandırılır) geleneksel olarak en iyi karakterize edilen üyesi Borrelia burgdorferi sensu stricto'dan sonra Borrelia burgdorferi sensu lato olarak adlandırılmıştır.  Bu makale şu anda en yaygın kullanılan terminolojiyi kullanmaktadır: LB, RF ve sürüngenle ilişkili grup, LB ve RF grupları için kültür protokollerini açıklamaktadır.

Spirochaetaceae familyasının bir üyesi için beklendiği gibi, Borrelia, tipik olarak 20-30 μm uzunluğunda ve 0.2-0.3 μm genişliğinde, belirgin şekilde uzun ve ince spiral şeklini benimseyebilir. Bununla birlikte, Borrelia hücreleri oldukça pleomorfiktir ve karmaşık hücresel ve genetik yapılarının bir sonucu olarak hem kültürde hem de in vivo 1,8'de birçok başka şekli benimseyebilir. Spiroketal formunda, düzlemsel sinüs dalgası morfolojisi, iç ve dış zarlar arasındaki periplazmik boşlukta dönen eksenel endoflagellasından kaynaklanır. Bu yapı, hücrelerin konakçı dokularla etkileşime girmesini sağlayan proteinler içeren dış zar ile hücrelerin oldukça hareketli olmasını sağlar 9,10. Dış zar proteinlerinin ekspresyonu sıkı bir şekilde düzenlenir ve sadece konakçı doku invazyonunu değil, aynı zamanda konakçı bağışıklık sistemi ile etkileşimi de etkiler11. Bu karmaşık gen ekspresyonu, Borrelia hücrelerinin omurgalı konakçıların ve omurgasız vektörlerin çok farklı ortamları arasında mekik dokumasına izin verir. Borrelia'nın genomu, dairesel bir kromozomdan ziyade doğrusal bir kromozomdan oluşan prokaryotlar arasında olağandışıdır. Doğrusal kromozoma ek olarak, Borrelia türleri bazıları doğrusal ve bazıları dairesel olmak üzere 7-21 plazmid içerir. Plazmidler, konakçı adaptasyonu ve virülans için gerekli genlerin çoğunu barındırır ve profajlardan türetilen dairesel plazmidlerin, spiroketal hücreler arasındaki yatay gen akışının çoğunluğundan sorumlu olduğu düşünülmektedir12,13. Konakçı adaptasyonundaki rolüyle tutarlı olarak, Lyme borreliosis grubunun bazıları, muhtemelen çoğu veya tümü, kültür14'te plazmidleri kaybeder. B. burgdorferi'nin en iyi çalışılmış "laboratuvara uyarlanmış" suşu olan B31, bu türün vahşi izolatlarında bulunan dokuz plazmidden sadece yedisine sahiptir15. Benzer şekilde, B. garinii kültür16'da plazmidleri kaybeder. Bazı çalışmalar, RF türlerinin ve B. miyamotoi'nin kültürlendiğinde plazmidleri koruduğunu göstermiştir14,17, ancak son çalışmalar uzun süreli in vitro ekim ile değişmiş plazmidleri ve bulaşıcılık göstermektedir 18.

Kültüre dayalı yöntemler, hem araştırma hem de klinik çalışmalar için bakteriyel enfeksiyonların laboratuvar tespitinde altın standart olmaya devam etmektedir14,17. Vücut sıvılarından veya dokularından patojenlerin kültürü, çoğalan patojenleri doğrudan tespit eder ve araştırma için kaynak materyal sağlar14,17. Bu protokol, LB grubunun spiroketlerinin yanı sıra RF Borrelia ve B. miyamotoi'nin spiroşetlerini başarılı bir şekilde kültürlemek için gereken metodolojiyi ve tarifleri göstermektedir. Borrelia spiroketlerinin yetiştirilmesi için temel ortam, kirletici prokaryotların büyümesini azaltmak için antibiyotikli veya antibiyotiksiz Barbour-Stoenner-Kelly ortamıdır (BSK-II veya ticari olarak temin edilebilen BSK-H). Bu ortam, başlangıçta RF Borrelia19'u desteklemek için kullanılan bir ortamdan uyarlandı, Stoenner20 ve daha sonra Barbour21 tarafından daha da değiştirildi. O zamandan beri, her biri büyümeyi, bulaşıcılığı ve patojeniteyi etkileyebilecek bakteriyel fizyoloji üzerinde etkileri olan birçok modifikasyon geliştirilmiştir22. Bu ortam, yerleşik kültürlerde spiroketlerin büyümesini güvenilir bir şekilde destekler ve spiroketleri kene, memeli ve klinik örneklerden izole etmek için kullanılmıştır23. Daha yakın zamanda geliştirilen varyasyon, modifiye Kelly-Pettenkofer (MKP) ortamı, yeni Borrelia izolatlarını çevresel örneklerden izole ederken, kültürü tohumlamak için mevcut numunede bulunan spiroket sayısı düşük olduğunda daha iyi izolasyon başarısı, morfoloji ve motilite, 23,24 sağlayabilir. Her durumda, yetiştiriciliğin başarısı kritik olarak taze hazırlanmış ortama ve uygun bileşenlerin kullanımına bağlıdır; Tüm ticari bileşenler yüksek kaliteli ortam üretmez. Aşılanmış kültürler, az miktarda artık ortam oksijeni varlığında geleneksel bir 32-34 ° C inkübatörde sallanmadan rahatça inkübe edilebilir. Borrelia spiroketleri anaeroblardır, ancak doğada oksijen ve karbondioksit konsantrasyonlarındaki dalgalanmalara maruz kalırlar ve gen ekspresyonundaki değişikliklerle yanıt verirler26,27,28,29. Bu nedenle, gen ekspresyonu, büyüme ve diğer metabolik çalışmalar, oksijen kontrollü bir inkübatör veya anaerobik oda kullanılarak oksijen ve karbondioksit seviyelerini kontrol etmelidir. Kültürde, kültürler haftalık olarak veya daha sık, karanlık alan mikroskobu veya faz kontrast mikroskobu ile spiroketlerin varlığı açısından kontrol edilir. Kültür yaymaları gümüş lekeleri, immünohistokimya veya floresan etiketli suşların kullanımı ileboyanabilir 29,30. PCR'yi takiben DNA dizilimi, Borrelia türlerini30,31,32,33 tespit etmek ve genetik olarak tanımlamak veya doğrulamak için hassas ve spesifik bir yöntemdir.

BSK-II üzerinde birçok küçük varyasyon mevcuttur ve bazıları ticari olarak temin edilebilir. Burada bölüm 1'de açıklanan protokol Barbour (1984)21'den uyarlanmıştır. Sıvı MKP ortamı daha yeni geliştirilmiş bir ortamdır ve bölüm 2'de açıklanmıştır. BSK ortamına benzer şekilde iki adımdan oluşan daha önce bildirilen bir protokol33,34'e göre hazırlanır: temel ortamın hazırlanması ve tam ortamın hazırlanması. Borrelia kültür ortamı, bölüm 3'te açıklandığı gibi antibiyotikli veya antibiyotiksiz olarak hazırlanabilir; Antibiyotikler, bölüm 4'te açıklandığı gibi, klinik veya çevresel örneklerle aşılama sırasında ortaya çıkan kirletici bakterileri azaltmak için hareket eder; saf Borrelia sp. kültürü ile aşılanırsa, antibiyotiklere ihtiyaç duyulmayabilir. Uzun vadeli Borrelia stokları yapmak genellikle önemlidir ve bunu yapmak için bir protokol bölüm 5'te açıklanmıştır. Bölüm 6, saf Borrelia sensu lato klonlarını klinik veya çevresel örneklerden izole etmek için bu ortamların kullanılmasını açıklamaktadır. Olası bir dizi yaklaşım vardır36; Aşağıda etkili olduğu tespit edilen bir tanesi verilmiştir. Bu protokolde kullanılan kaplama ortamı, BSK-II kaplama ortamı 37 ve MKP ortamı34'ün bir modifikasyonudur (tavşan serumu% 10'a yükseltilmiş) 38).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

İnsan deneklerden elde edilen örnekleri içeren tüm çalışmalar, ilgili Üniversite ve/veya tıbbi tesisin Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmış ve örnekler toplanmadan önce katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Hayvanlardan alınan örnekleri içeren tüm çalışmalar Kurumsal Hayvan Etik Kurulu rehberliğinde onaylanmış ve yürütülmüştür. İlgili olduğunda, çevresel örnekleme için onaylar alınmıştır.

NOT: Kültürün başarısı kritik olarak bileşenlerin kalitesine bağlıdır. Ticari BSK ortamı mevcuttur ve laboratuarda uyarlanmış saf B. burgdorferi ve kültürü tohumlamak için yüksek doz inokulumun kullanılabileceği ilgili türlerin büyümesini sağlam bir şekilde desteklemektedir. Birincil biyolojik materyalden suşların izolatları için, taze hazırlanmış ortam tercih edilir ve sıklıkla gereklidir.

Borrelia sp. bilinen veya şüphelenilen patojenlerdir ve taranmamış insan veya hayvan dokuları da biyolojik tehlike oluşturabilir. Potansiyel olarak bulaşıcı malzemelerin taşınması, araştırmacı güvenliği için kişisel koruyucu ekipman ve steril teknik gerektirir. Ek olarak, ortam o kadar besin açısından zengindir ki, kültür kolayca kirlenir. Bu çalışma için genellikle biyogüvenlik seviye 2 muhafaza gereklidir ve Borrelia sp. veya numuneler ile yapılan tüm çalışmalar biyolojik bir güvenlik kabininde yapılmalıdır.

1. BSK-II ortamını yapmak için talimatlar

  1. Komple BSK-II ortamının hazırlanması
    1. Tablo 1'de gösterildiği gibi, ortamın 1 L'sini hazırlamak için reaktifler edinin.
      NOT: BSA saflığı (veya saflık eksikliği) optimum büyüme için kritik öneme sahiptir. Özellikle, BSA saflığı hem üretici hem de parti arasında farklılık gösterir. Daha fazla ve daha az başarılı ürünlerin bir listesi için lütfen Tablo 2'ye bakın. Farklı satıcılardan birkaç numune almak, bunları optimum büyüme için test etmek, daha sonra büyük miktarda en iyi partiyi satın almak, bu sorunu hafifletmek ve iyi bir ortam üretmek için etkili bir stratejidir.
    2. BSA'yı en az yarım saat sürecek olan suda karıştırarak bir beherde eriterek başlayın.
    3. Tüm kuru kimyasalları ekleyin ve çözünmelerine izin verin. Ardından CMRL'yi ekleyin.
    4. BSK-II ortamının pH'ını gerekirse 1 M NaOH ile 7,6'ya ayarlayın.
    5. BSK-II ortamına% 6 -% 10'luk bir konsantrasyonda tavşan serumu ekleyin. Filtre BSK-II ortamını sterilize eder (0,22 μm gözenek boyutunda). Gerekli serum miktarı Borrelia türlerine bağlıdır. RF türleri ve suşları ve Borrelia burgdorferi sensu lato için% 6 -% 7 kullanın. Büyüme güçlü değilse, ortama% 1 -% 2 steril tavşan serumu ekleyin.
    6. BSK-II ortamının stokunu 100 mL veya 400 mL alikotlarda dondurun.
    7. RF suşları için jelatin gereklidir. 400 mL BSK-II ortamına 100 mL% 7 steril jelatin (bir çözeltiye koymak için hafifçe ısıtılmış) ekleyin. Kültürü aşılamadan önce jelatinin erimesini sağlamak için BSK-II'yi jelatin ile 37 ° C'de ısıtın.
      NOT: Filtre sterilizasyonundan ve tavşan serumu ve jelatin ilavesinden (RF spiroketler için) önce veya filtre sterilizasyonu ve serum (ve jelatin) ilavesinden sonra ortam dondurulabilir (-20 °C). Ortam uzun süre dondurulduğunda kararlıdır. Bir buzdolabında saklandığında, ortamı 1 ay içinde kullanın. RF türleri, genellikle 1 haftadan daha eski olmayan taze ortamla en iyi şekilde büyür. Dondurulmamışsa, ortamın kalitesini bulanıklık açısından görsel olarak kontrol edin. Kirlenmiş, çökeltici bileşenler veya başka bir şekilde şüpheli görünen ortamı atın.
    8. Ortama antibiyotik eklenecekse, bunları taze yapılmış ortama veya önceden dondurulmuş alikotlara ekleyin; ikincisi daha esnek bir yaklaşımdır. Oliver ve ark.39 tarafından tarif edildiği gibi antibiyotik konsantrasyonları kullanın.
    9. Ortamın bir tüpünü çözerken, hassas bir terazi kullanarak antibiyotikleri steril (otoklavlanmış) 1,7 mL tüplere veya steril 15 mL konik tüplere tartın. Stok çözeltilerini aşağıdaki gibi hazırlayın: 25 mg amfoterisin B'yi 10 mL DMSO'da, 20 mg fosfomisin'i 1 mL otoklavlanmış damıtılmış suda ve 50 mg rifampisin 1 mL DMSO'da çözün.
    10. Filtre antibiyotikleri sterilize edin (0.2 μm şırınga filtreleri) ve bunları uygun boyutta yeni bir tüpe aktarın.
    11. Son konsantrasyonlarına ulaşmak için antibiyotikleri ortamın 1: 1000'i oranında seyreltin. 500 mL BSK için, 0.5 mL amfoterisin B stok çözeltisi (DMSO'da 2.5 mg / mL), 0.5 mL fosfomisin stok çözeltisi (sterilH2O'da 20 mg / mL) ve 0.5 mL rifampisin (US: rifampin) stok çözeltisi (DMSO'da 50 mg / mL) ekleyin.
    12. Antibiyotik takviyeli ortamı veya aliquot kullanın ve -20 ° C'de dondurun.
BileşenMiktar (/L)
BSA fraksiyonu V50 gr
CMRL-1066 (10x)100 mL
Neopepton5 gr
Hepes6 gr
Sitrik asit trisodyum tuzu dihidrat0.7 gr
Glikoz5 gr
TC Yeastolate2 gr
Pirüvik asit (Na tuzu)0.8 gr
N-asetil-D-glukozamin0.4 gr
Sodyum bikarbonat2.2 gr
Su (yüksek saflıkta)900 mL

Tablo 1: 1 L BSK-II ortamının bileşimi.

KaynakUygunluk
Serva GmbH, Heidelberg, AlmanyaEvet
Proliant Biologicals, Boone IA, ABDEvet
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, Amerika Birleşik DevletleriHayır

Tablo 2: BSA kaynakları ve BSK-II ortamına uygunluk.

2. MKP yapma talimatları

  1. Temel ortamın hazırlanması
    1. Aşağıda Tablo 3'te listelenen tüm toz haline getirilmiş bileşenleri, ddH2O'nun (yaklaşık 750 mL) son hacminin 3/4'ünde, ~1 saat süren tamamen çözünene kadar karıştırarak dikkatlice tartın ve çözün.
    2. Tamamen çözündükten sonra, pH'ı NaOH ile 7.6'ya ve hacmi 1000 mL'ye ayarlayın ve ardından filtreleme ile sterilize edin (0.22 μm filtre).
      NOT: Temel ortam -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir.
  2. MKP komple ortamın hazırlanması
    1. Tablo 4'te listelenen tüm bileşenleri steril bir şekilde karıştırın; Jelatini otoklavlayarak sterilize edin ve steril bir şekilde kullanın. Steril bir biyolojik güvenlik kabininde çalışın ve steril filtrelenmiş bir serum kullanın.
    2. 50 mL tüplerde Aliquot MKP. Birkaç gün boyunca 33 ° C'de küçük bir aliquot koyun, ardından kontaminasyon olup olmadığını karanlık alan mikroskobu altında kontrol edin.
      NOT: MKP'yi tam ortamda +4 °C'de en fazla 1 ay tutun ve dondurmayın. Komple ortam ayrıca 0,22 μm filtre kullanılarak filtreleme ile sterilize edilebilir.
BileşenMiktar (/L)
CMRL-1066 (glutamin olmadan 10x)100 mL (sıvı ise)/9,7 g/L toz halinde
Neopepton3 gr
Hepes6 gr
Sitrik asit0.7 gr
Glikoz3 gr
Pirüvik asit0.8 gr
N-asetilglukozamin0.4 gr
Sodyum bikarbonat2 gr

Tablo 3: 1 L bazik MKP (Modifiye Kelly-Pettenkofer) ortamının bileşimi.

BileşenMiktar (mL)
Temel ortam500
% 7 jelatin (H2O cinsinden) (taze otoklavlanmış ancak sıcak değil)100
Tavşan serumu36
%35 BSA17.5

Tablo 4: MKP (Modifiye Kelly-Pettenkofer) komple ortamının bileşimi.

3. Borrelia kültürü, antibiyotikli veya antibiyotiksiz

  1. Tüm deneysel adımları biyolojik bir güvenlik kabininde steril çalışma koşulları altında gerçekleştirin. Yüzeyi ve tüm malzemeleri %70 etanol ile dezenfekte edin ve derhal biyolojik güvenlik kabinine aktarın. UV, biyolojik güvenlik kabinindeki biyolojik olmayan tüm malzemeleri çalışmaya başlamadan önce 5 dakika boyunca sterilize eder.
  2. Mümkün olan en taze ortamı kullanın.
  3. Bir kültürü başlatmak için, ortamı (33 ° C - 37 ° C) bir inkübatörde önceden ısıtın. Gerekirse sallama uygulayın.
    NOT: Ortamın hacmine bağlı olarak, bu adım birkaç saat sürebilir.
  4. Daha önce -80 ° C'de depolanan ve sıvı olur olmaz oda sıcaklığında (RT) çözülen bir gliserol veya benzeri bir stoktan ~ 1 mL çözülmüş Borrelia kültürünü, 5-15 mL önceden ısıtılmış BSK ortamına ekleyin. Vidalı kapaklı ticari olarak temin edilebilen cam veya plastik şişeler kullanarak kültürü küçük bir hacme (5-15 mL BSK) aşılayın. Mikro veya anaerobik bir atmosfer oluşturmak için tüpleri neredeyse dolu doldurun. Tüpleri sıkıca kapatın; Bu şekilde kültürlenirse, CO2'ye gerek yoktur.
  5. RF türlerini (ve B. persica'yı) bir inkübatörde 37 ° C'de karıştırmadan veya ajitasyon yapmadan büyütün. B. burgdorferi sensu lato türlerini 33-34 °C'de yetiştirin.
  6. Borrelia kültürünün büyümesini faz kontrastı veya karanlık alan mikroskobu kullanarak 200x-400x büyütmede izleyin (Şekil 3). Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için kültürü serolojik bir pipetle karıştırın veya yukarı ve aşağı pipetleme yaparken 3 mL'lik bir transfer pipetiyle daha fazla karıştırma yapın.
    NOT: Borrelia en yüksek büyütmede (200X-400X) görülebilir, ancak en iyi hemositometre40'ta 200X büyütmede sayılabilir. Borrelia hareketi ve morfolojisi bu bakterilerin varlığının göstergesidir.
  7. Bakteriyel büyümeyi ölçmek için, hemositometrenin her iki tarafındaki ve ortalamanın on altı alanlı ızgara sayma alanındaki birkaç (10) ayrı küçük kareyi sayın. Küçük kare başına ortalama hücre sayısını, mL başına hücre sayısını belirlemek için kullanılan hemositometre için uygun dönüşüm faktörü ile çarpın.
  8. Bakteri üremesini 1-2 gün aralıklarla izleyin. Borrelia'nın üstel büyümesi canlılığa ve hücre yoğunluğuna bağlıdır ve 34 ° C'de 1 hafta veya daha uzun sürebilir. Hemositometreye yüklenmeden önce üstel faz kültürlerini 1: 2 veya 1: 4 oranında 1.7 mL'lik bir tüpteki ortamla seyreltin. Hücre sayısını belirlerken seyreltme faktörünün uygun şekilde dikkate alınmasını sağlayın. Kullanımdan sonra, yüzeylere ve hemositometreye seyreltilmiş ağartıcı (% 10) ve/veya % 70 etanol püskürtün.
    NOT: Borrelia , hücre konsantrasyonları 1-5 x 107 hücre / mL olduğunda üstel büyüme içindedir. Bu aralıkta, hücreler iyi büyür.
  9. Genişletilmiş kültür, besinleri tüketir ve orta pH'ı değiştirir, bu nedenle alt kültürleme gereklidir. Biyolojik bir güvenlik kabinindeki steril koşullar altında, kültür hacminin 1 / 10'unu yeni bir tüpe aktarın ve yeni ortamla doldurun (önceki geçişi büyütmek için kullanılan aynı ortamın taze bir aliquotu). 1:10 seyreltme en uygunudur. Kültür hacmi değiştirilecekse, inokulum miktarını buna göre ayarlayın ve inkübasyona devam edin. Her ortam değişiminde pasajların sayısı artar.
  10. DNA'nın ekstraksiyonu veya Borrelia hücrelerinin izolasyonu için, bakterileri pelet etmek için üstel faz Borrelia'yı 4000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı uygun biyolojik tehlike atıklarına atın. Peletlenmiş bakterileri ticari bir DNA ekstraksiyon kiti ile işleyin veya bakterileri amaçlanan deney için uygun bir ortamda yeniden askıya alın.
  11. Her manipülasyonun sonunda, tüm ekipmanı ekipmana uygun şekilde etanol ve UV radyasyonu ile sterilize edin. Aşırı kültür de dahil olmak üzere sıvı atıkları bir atık şişesinde toplayın ve% 10'luk bir son konsantrasyona çamaşır suyu ekleyin. Bu şişeyi atmadan önce -80 ° C'ye yerleştirin. Alternatif olarak, sıvı atıkları ve kültürü otoklavlama yoluyla ağartıcı veya alkol olmadan sterilize edin.

4. Borrelia kültürlerinin uzun süreli depolanması

  1. Borrelia kültürünün gliserol stoğunun hazırlanması
    1. Üstel faz kültürlerinin ~ 1.8 mL alikotlarını, hücre konsantrasyonlarını ~ 107-10 8 hücre / mL'yi alın ve% 10'luk bir nihai konsantrasyona steril gliserol ekleyin (% 5 -% 20 çalışma konsantrasyonları).
    2. 2 mL vidalı kapaklı kriyojenik şişelere yerleştirin. -80 °C'de saklayın.
    3. Dondurucuda her suşun en az 10 tüpünü içeren bir stok bulundurun.
  2. Kalıcı depolama için bir gliserol stoğu üretmek için alternatif bir depolama tarifi
    1. Borrelia kültürünün 2 / 3'ünü Brucella suyunda% 15 gliserolün 1 / 3'ü ile karıştırın. Steril filtrelenmiş (0.22 μm) 100 mLddH2O içinde çözülmüş 2.8 g Brucella suyu kullanın.
    2. Numunelerin gliserol stoğunu -70 °C ila -80 °C'de tutun.

5. Spiroketlerin çevresel veya klinik kaynaklardan izolasyonu

NOT: Materyal insan, hayvan veya çevresel kaynaklardan izole ediliyorsa, uygun olduğu şekilde araştırma etiği, hayvan bakımı veya ekolojik sertifika alınmalıdır.

  1. Borrelia'nın sert kenelerden yetiştirilmesi
    1. Yetişkin dişileri, erkekleri ve / veya nimf kenelerini toplayın.
    2. Tüm kene numunelerini 2 dakika boyunca %70 etanol içine batırarak ve biyolojik bir güvenlik kabininde hava ile kurutarak yüzey sterilize edin. Steril bir neşter ile ayrı ayrı birkaç parçaya ayırın. Parçaları, antibiyotiklerle desteklenmiş 1.5 mL ortam içeren 2 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    3. Kültürleri 34 ° C'de inkübe edin ve ilk 2 hafta boyunca haftada iki kez karanlık alan veya faz kontrast mikroskobu ile spiroketleri kontrol edin ve daha sonra 6 hafta boyunca haftada bir (RF spiroketleri için daha sık). Aynı ortamın 5 mL'sinde alt kültür kültürü pozitif örnekler.
      NOT: Kirlenmiş kültürler, 0,2 μm filtre kullanılarak filtrasyon yoluyla bir dereceye kadar saflaştırılabilir; Kontaminasyonu tamamen çözmek için antibiyotikler gerekebilir.
  2. Borrelia'nın kan örneklerinden yetiştirilmesi
    NOT: Kan örneği, malzemenin kaynağına bağlı olarak nitelikli bir tıbbi, veterinerlik veya araştırma uzmanı tarafından alınmalıdır. RT'de 24 saatten az bir süre numune arasında geçmelidir
    çıkarma ve laboratuvara varış.
    1. Asit sitrat dekstroz (ACD; "sarı üst") bir antikoagülan olarak. Oda sıcaklığında bırakın. Kan alımı ve aşılama arasında 24 saatten az bir süre geçmesi önerilir.
    2. Plazmayı kan hücrelerinden ayırmak için kanı 200-400 x g'de 10 dakika boyunca antikoagülanla santrifüj edin.
    3. Plazmayı tüpten yavaşça çıkarın ve 1 mL plazmayı 5 mL önceden ısıtılmış MKP tam ortamına aşılayın. MKP antibiyotiklerle desteklenebilir. Kültürleri günlük görsel muayene ve haftalık karanlık alan veya faz kontrast mikroskobu ile 33 ° C'de inkübe edin, borrelial büyüme fark edilene kadar (RF Borrelia için daha sık), bu da 9 haftaya kadar sürebilir.
      NOT: Daha büyük veya daha küçük aşılama hacimleri kullanılıyorsa, aşılayıcının orta seviyeye 1:5 oranını koruyun. Tam kan yerine serum veya plazma kullanın.
  3. Borrelia'nın cilt biyopsisinden yetiştirilmesi
    1. Yüzey cilt biyopsisini sterilize eder (ideal olarak 3 mm x 3 mm x 3 mm küp; yani% 70 etanol ve hidrojen peroksit ile). Biyopsi örneğini fizyolojik salin içine yerleştirin.
      NOT: Bir biyopsi örneği, malzemenin kaynağına bağlı olarak nitelikli bir tıbbi, veterinerlik veya araştırma uzmanı tarafından alınmalıdır. RT'de 24 saatten az bir süre, numunenin çıkarılması ile laboratuvara varış arasında geçmelidir.
    2. Fizyolojik saline batırılmışken steril bir cam Petri kabında steril bir tıraş bıçağı kullanarak numuneyi iki ila altı küçük parçaya bölün. Cilt biyopsisinin depolandığı tüm örnekleri ve ~ 1 mL'lik fizyolojik salin, antibiyotiklerle desteklenmiş 5 mL önceden ısıtılmış ortama aktarın ve 33 ° C'de inkübe edin.
    3. Kontamine edici bakterilerin aşırı çoğalması durumunda, yukarıdaki adım 1.1.10'daki gibi antibiyotik ekleyin veya iki tablet sülfametoksazol (23.75 mg; nihai konsantrasyon 5 mg / mL) + trimetoprim (1.25 mg; 0.25 mg / mL) veya Bactrim (minimum inhibitör konsantrasyon >128 μg / mL), iki tablet Amikasin (2 x 30 μg; nihai konsantrasyon 12 μg / mL) ekleyerek, ve iki tablet Fosfomisin (2 x 200 μg; nihai konsantrasyon 80 μg / mL).
      NOT: Her durumda, kültürün denendiği Borrelia türleri için bu antibiyotiğin minimum inhibitör konsantrasyonunun altında kaldığınızdan emin olun41,42,43.
    4. Kültür Borrelia için pozitifse, kültürü 3-4 gün daha veya Borrelia miktarı 40X hedefi kullanarak bir mikroskop alanında 10+ spirokete ulaşana kadar saklayın. Kalıcı depolama için bir gliserol stoğu oluşturun.

6. B. burgdorferi sensu lato spiroketes ve B. miyamotoi'nin monoklonal popülasyonlarının katı ortam üzerinde yetiştirilerek sıvı kültürlerden izolasyonu

  1. Plaka yapmak için, sıcak 300 mL 1.5X MKP komple ortam (jelatin olmadan). Ayrıca, ılık 200 mL% 1.7 agaroz (deiyonize suda otoklavlanır, RT'de depolanır ve kullanımdan önce mikrodalgada pişirilir) 55 ° C'ye kadar. Her iki sıvıyı da karıştırın.
  2. Pipetin 15 mL'lik bu karışımı içine 16 derin Petri kabının her birine alt agar oselayer yapın.
  3. Ortamın geri kalanını 55 ° C'de bir su banyosunda tutun.
    NOT: Borrelia , üst agaroz tabakasına karıştırılır.
  4. İlk olarak, bir hemositometre kullanarak Borrelia kültür yoğunluğunu ölçün ve sıvı bir ortamda istenen yoğunluğa seyreltin.
    NOT: Plaka başına 500, 200, 100 ve 50 spiroket iyi çalışır.
  5. Alt plakalar katılaştıktan sonra, kalan agaroz karışımının 10 mL'sini, uygun sayıda spiroket içeren 15 mL'lik bir tüpe ekleyin.
  6. Süspansiyonu, etiketli Petri kabındaki alt agarozun üzerine dökün.
    NOT: Borrelia spiroketleri yüksek sıcaklığa duyarlı olduğundan, bakterilerin uzun süre 55 ° C'ye maruz kalmamasına özen gösterilmelidir; Üst agarı, ortamdaki bakteri hücrelerine ekledikten hemen sonra dökün.
  7. Plakalar tamamen katılaştıktan sonra, Petri kaplarını kapatın ve% 2.5 CO2'de 34-35 ° C'de baş aşağı yerleştirin.
    NOT: İşlem başarılı olursa koloniler kaplamadan 1 hafta sonra ortaya çıkacaktır.
  8. Tek tek kolonileri taramak ve genişletmek için, plakalardan tek koloniler seçin ve bunları steril 2 mL kültür tüplerinde 1,5 mL modifiye sıvı MKP veya diğer uygun ortamlara koyun.
  9. Kültürleri 34 ° C'de inkübe edin ve karanlık alan veya faz mikroskobu ile spiroketleri inceleyin. Bu kültürleri, yukarıda açıklandığı gibi yapılan analiz veya stoklar için kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Borrelia kültür ortamı BSK ve MKP ve varyantları, sırayla hazırlanması ve sterilize edilmesi gereken bileşenlere sahip zengin kültür ortamlarıdır. Doğru hazırlandığında, BSK ortamı kırmızı-turuncu ve berrak olmalıdır (Şekil 1). Isınmadan sonra devam eden bulanıklık ve yağış, sorunlu içerikleri, orta üretimi veya kontaminasyonu gösterir; Böyle bir ortam en iyi şekilde atılır. BSK'ya ve MKP'ye jelatin eklenirse, ortam soğutulduğunda jelatinli ola...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bakterilerin laboratuvar kültürü, araştırma için sıçrama tahtasıdır. Kültür yeteneğinin sağladığı derin avantaj, bir yüzyıldan fazla bir süredir ancak son zamanlarda başarı ile sonuçlanan, sifilizin etiyolojik ajanı olan Treponema pallidum'un kültürüne verilen mücadeleyle örneklenmektedir44. Borrelia spiroketleri de kültüre meydan okuyor, ancak kültür mümkün 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Hiçbir çıkar çatışması ilan edilmedi.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendisliği Araştırma Konseyi ve Kanada Lyme hastalığı Vakfı (AB ve VL), İsveç Araştırma Konseyi (SB, M-LF ve IN), TAČR GAMA 2 projesi - "Biyoloji Merkezi CAS'ta uygulama potansiyeli doğrulama 2.0 desteği" (TP01010022) (MG ve NR) ve Çek Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı NV19-05-00191 (MG ve NR) tarafından desteklenmiştir. Şekil 4'teki görüntü için S. Vranjes'e (2021, Rudenko laboratuvarı) ve Şekil 5'teki görüntüler için J. Thomas-Ebbett'e (2021, Lloyd laboratuvarı) teşekkür ederiz. Alanında emeği geçen tüm araştırmacılara teşekkür ediyor, alan kısıtlılığı nedeniyle çalışmalarına atıf yapamadığımız araştırmacılardan özür diliyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL tubesVWR87003-294Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter VWR28145-501Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tipNeptuneBT10XLS3Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes Celltreat229011BStandard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tipNeptuneBT1000.96Standard item - any supplier will do
15 mL tubeCelltreat188261Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tipNeptuneBT20Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe BD309661Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tipNeptuneBT200Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture TubesFisher Scientific14-933CStandard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettesCelltreat229025BStandard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringeBD309657Standard item - any supplier will do
35% BSA SigmaA-7409Source is important - see note
5 mL Serological pipettes Celltreat229006BStandard item - any supplier will do
50 mL tubeCelltreat229421Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes SchottSchott Nr. 26 135 115Standard item - any supplier will do
AmikacineSigmaPHR1654Standard item - any supplier will do
Amphotericin BSigmaA9528-100MGStandard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazoleSigmaPHR1126-1GStandard item - any supplier will do
BBL Brucella broth BD211088Standard item - any supplier will do
Biosafety CabinetLabconco302419100Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD)Fisher ScientificBD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD)Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum] Darlynn biologicalsBB83-500Standard item - any supplier will do
centrifuge Eppendorfmodel 5430Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrateSigmaC-8532 100 gStandard item - any supplier will do
CMRLGibco BRL21540 500 mLStandard item - any supplier will do
CMRL-1066Gibco21-510-018Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene)Fisher Scientific5000-0020Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mmSigmaP7741Standard item - any supplier will do
Digital IncubatorVWRmodel 1545Standard item - any supplier will do
DMSOThermoFisherD12345Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilizationMillipore 0.22μm GPExpressPLUS MembraneSCGPU05REStandard item - any supplier will do
GelatinDifco BD214340 500 gStandard item - any supplier will do
Glass Culture TubesFisher Scientific99449-20Standard item - any supplier will do
GlucoseSigmaG-7021 1 kgStandard item - any supplier will do
GlycerolSigmaG5516Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge )LabwissenModel 3220Standard item - any supplier will do
HEPESSigma H-3784 100 gStandard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamineSigma A-3286 25 gStandard item - any supplier will do
NeopeptoneDifco  BD211681 500 gStandard item - any supplier will do
Neubauer HematocytometerSigma Z359629Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope LeitzStandard item - any supplier will do
PhosphomycinSigmaP5396-1GStandard item - any supplier will do
PhosphomycineSigmaP5396Standard item - any supplier will do
PipetboyIntegraStandard item - any supplier will do
Precision Standard BalanceOHAUSmodel TS200SStandard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt)SigmaP-8574 25 gStandard item - any supplier will do
Rabbit Serum Gibco16-120-032Source is important 
Rabbit Serum SigmaR-4505  100 mLSource is important 
RifampicinSigmaR3501-1GStandard item - any supplier will do
Sodium bicarbonateSigmaS-5761     500 gStandard item - any supplier will do
Sufametaxazole SigmaPHR1126Standard item - any supplier will do
TC YeastolateDifco  BD255752 100 gStandard item - any supplier will do
Transfer PipettesVWR470225-044Standard item - any supplier will do
TrimethoprimSigmaPHR1056Standard item - any supplier will do

Referanslar

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54(2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia. , Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022).
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432(2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos' et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397(2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W. Borreliella. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey,, Whitman, W. B. , John Wiley & Sons. 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268(2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587(2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089(2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622(2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309(2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090(2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188(2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153(2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127(2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016).
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66(2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865(2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16(2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926(2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766(2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638(2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386(2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87(2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33(2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554(2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır