JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, gen ekspresyonu ve histolojik analizler için fare endometriyal epitel organoidlerini oluşturma metodolojilerini açıklamaktadır.

Özet

Endometriyal doku uterusun iç boşluğunu kaplar ve östrojen ve progesteronun döngüsel kontrolü altındadır. Luminal ve glandüler epitel, stromal kompartman, vasküler ağ ve kompleks immün hücre popülasyonundan oluşan bir dokudur. Fare modelleri, endometriyumu incelemek için güçlü bir araç olmuştur ve implantasyonu, plasentasyonu ve kanseri kontrol eden kritik mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. 3D endometriyal organoid kültürlerin son zamanlardaki gelişimi, endometriyal biyolojinin altında yatan sinyal yollarını incelemek için son teknoloji ürünü bir model sunmaktadır. Genetiği değiştirilmiş fare modellerinden endometriyal organoidler oluşturmak, transkriptomlarını analiz etmek ve morfolojilerini tek hücreli bir çözünürlükte görselleştirmek, endometriyal hastalıkların incelenmesi için çok önemli araçlardır. Bu makale, farelerden endometriyal epitelin 3D kültürlerini oluşturma yöntemlerini özetlemekte ve gen ekspresyonunu ölçmek ve organoidlerin histolojisini analiz etmek için teknikleri açıklamaktadır. Amaç, endometriyal epitel organoidlerinin gen ekspresyonunu ve morfolojik özelliklerini oluşturmak, kültürlemek ve incelemek için kullanılabilecek bir kaynak sağlamaktır.

Giriş

Endometriyum - uterus boşluğunun iç astar mukozal dokusu - bir kadının üreme sağlığında kritik rol oynayan benzersiz ve oldukça dinamik bir dokudur. Üreme ömrü boyunca, endometriyum, yumurtalık hormonlarının - östrojen ve progesteronun uyumlu etkisiyle koordine edilen yüzlerce proliferasyon, farklılaşma ve parçalanma döngüsüne girme potansiyeline sahiptir. Genetiği değiştirilmiş fareler üzerinde yapılan çalışmalar, hormonlara endometriyal yanıtı ve embriyo implantasyonunun, stromal hücre desidualizasyonunun ve gebeliğin kontrolünü destekleyen temel biyolojik mekanizmaları ortaya çıkarmıştır1. Bununla birlikte, in vitro çalışmalar, geleneksel 2D hücre kültürlerinde transforme edilmemiş primer fare endometriyal dokularının korunmasındaki zorluklar nedeniyle sınırlandırılmıştır 2,3. 3D organ sistemleri veya organoidler olarak endometriyal dokuların kültüründeki son gelişmeler, endometriyal hücre rejenerasyonunu ve farklılaşmasını kontrol eden biyolojik yolları araştırmak için yeni bir fırsat sunmaktadır. Fare ve insan endometriyal organoid sistemleri, çeşitli matrislerde kapsüllenmiş saf endometriyal epiteldengeliştirilmiştir 4,5, insan endometriyumu ise iskelesiz epitel / stromal ko-kültürler 6,7 ve daha yakın zamanda kollajen kapsüllü epitel / stromal assembloidler8 olarak kültürlenmiştir. . Epitelyal organoid kültürlerin büyüme ve rejeneratif potansiyeli, organoidlerin büyümesini ve rejenerasyonunu en üst düzeye çıkarmak için ampirik olarak belirlenmiş büyüme faktörleri ve küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanmış bir kokteyli ile desteklenmektedir 4,5,9. Ayrıca, endometriyal organoidleri dondurma ve çözme yeteneği, endometriyal organoidlerin farelerden ve insanlardan gelecekteki çalışmalar için uzun vadeli bankacılığına izin verir.

Genetiği değiştirilmiş fareler, erken gebelik ve desidualizasyonu kontrol eden karmaşık sinyal yollarını ortaya çıkarmış ve gebelik kaybı, endometriyal kanser ve endometriozis modelleri olarak kullanılmıştır. Bu genetik çalışmalar, özellikle kadın üreme dokularında aktif olan cre rekombinazları kullanılarak loxP yan alellerinin ("floksed") hücreye özgü delesyonuyla büyük ölçüde elde edilmiştir. Bu fare modelleri, endometriyal epitel ve stromal dokularda güçlü rekombinaz aktivitesine sahip olan yaygın olarak kullanılan progesteron reseptörü-cre10'u, yetişkin farelerde endometriyal epitel rekombinasyonunu indükleyen laktoferrin i-cre11'i veya Müllerian türevi dokularda epitelyal spesifik delesyonu tetikleyen Wnt7a-cre'yi içerir12 . Genetiği değiştirilmiş fare modellerinden endometriyal dokuların 3D organoidler olarak kültürlenmesi, endometriyal biyolojiyi araştırmak ve endometriyal hücre yenilenmesini ve farklılaşmasını kontrol eden büyüme faktörlerinin ve sinyal yollarının tanımlanmasını kolaylaştırmak için mükemmel bir fırsat sağlamıştır13,14. Literatürde fare endometriyal dokusunun izolasyonu ve kültürü için yöntemler tanımlanmış ve endometriyal epitel organoidlerinin daha sonraki kültürlenmesi için uterus epitelinin izolasyonu için çeşitli enzimatik stratejilerin kullanımı bildirilmiştir4. Önceki literatür endometriyal epitel organoid kültür protokolleri 4,5,6 için eleştirel bir çerçeve sağlarken, bu makale bu organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi, işlenmesi ve analiz edilmesi için açık ve kapsamlı bir yöntem sunmaktadır. Bu tekniklerin standardizasyonu, kadın üreme biyolojisi alanındaki ilerlemeleri hızlandırmak için önemlidir. Burada, bir jel matriks iskelesinde endometriyal organoidlerin sonraki kültürü için fare endometriyal epitel dokusunun enzimatik ve mekanik saflaştırılması için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Ayrıca, jel matriks kapsüllü fare endometriyal epitel organoidlerinin aşağı akış histolojik ve moleküler analizleri için metodolojileri de açıklıyoruz.

Protokol

Fare kullanımı ve deneysel çalışmalar, Baylor College of Medicine Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu tarafından oluşturulan kılavuzlar kapsamında gerçekleştirilmiştir.

1. Uterus epitelinin enzimatik ve mekanik yöntemler kullanılarak farelerden izole edilmesi

NOT: Bu bölümde, jel matris iskelesi kullanarak farelerden epitelyal endometriyal organoidlerin kurulması, geçişi, dondurulması ve çözülmesi için gereken adımlar açıklanmaktadır. Önceki çalışmalar, fare endometriyal organoidlerinin optimal kültürlerinin, vajinal sürüntü15'in sitolojik incelemesiyle belirlenebilen östrus fazı4 sırasında farelerden kurulduğunu belirlemiştir. Tüm deneyler için yetişkin dişi WT fareleri (6-8 haftalık, hibrid C57BL / 6J ve 129S5 / SvEvBrd) kullanıldı. Fareler, IACUC onaylı kılavuzlara göre, izofluran sedasyonu ve ardından servikal dispartikülasyon kullanılarak insani olarak ötenazi yapıldı. Fareler ötenazi yapıldıktan sonra, aşağıdaki adımlar izlenmelidir. Bu protokolde kullanılan malzemeler ve çözümlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

  1. Jel matrisinin kullanımdan önce yaklaşık 1-2 saat boyunca buz üzerinde çözülmesine izin verin.
  2. Fareyi diseke etmek için, karın üzerinde orta çizgide bir kesi yapmak için makas kullanın ve altta yatan periton tabakasını ortaya çıkarmak için cildi yavaşça geri soyun. Peritoneal tabakayı tutmak için forseps kullanın ve karın içeriğini ortaya çıkarmak için makasla lateral kesikler yapın.
    1. Karın yağ yastıklarını hafifçe bir kenara iterek uterus boynuzlarını bulun. Önce servikal kavşakta tutarak ve mezenterik yağ boyunca kesmek için makas kullanarak onları disseke edin. Fare uterusunun diseksiyonunu takiben, uterus boynuzundan yağ dokusunu küçük makasla iyice çıkarın.
      NOT: Kullanmadan önce tüm ameliyat aletlerini sterilize ederek hücre izolasyonu sırasında steriliteyi koruyun, fare karnına% 70 etanol püskürtün ve steril bir doku kültürü başlığı altında diseksiyonu takip eden tüm adımları uygulayın.
  3. Her uterus boynuzunu her biri yaklaşık 4-5 mm ölçülen küçük parçalar halinde kesin.
  4. Tüm uterus parçalarını bir uterustan 0.5 mL% 1 Tripsin içeren 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Enzimatik çözeltinin uterus lümenine girmesine izin vererek, endometriyal epitelin altta yatan stromadan enzimatik olarak ayrılmasına neden olur.
  5. 24 delikli plakayı 37 °C nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe yaklaşık 1 saat boyunca inkübe edin.
  6. 1 saatlik inkübasyondan sonra, uterus fragmanlarını 1 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu çözeltisini (DPBS) içeren 35 mm'lik bir doku kültürü plakasına aktarın.
  7. Diseksiyon mikroskobu altında, uterus epitelini uterus tüpünden mekanik olarak ayırmak için ince forseps ve 1 mL'lik bir pipet kullanın. Forsepslerle uterus parçasının bir ucunu tutarken, pipet ucunu yavaşça parça boyunca uzunlamasına çalıştırın ve epiteli uterus tüpünün diğer ucundan sıkın. Diseksiyon mikroskobu altında uterus fragmanından ayrılmış epitel tabakalarını gözlemleyin.
  8. Epitel tabakalarını toplamak ve nazikçe 1,5 mL'lik bir tüpe aktarmak için 1 mL pipeti kullanın.
  9. Kalan uterus parçaları için işlemi tekrarlayın, tüm epitel tabakalarını aynı toplama tüpüne aktarın.
  10. Ayrışmış epitel tabakalarını 375 × g'da 5 dakika santrifüjleme ile toplayın.
  11. Hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatantı dikkatlice çıkarın.
  12. Hücre peletini 0.5 mL 2.5 mg / mL kollajenaz + 2 mg / mL DNaz çözeltisinde yeniden askıya alın. Pipetleri yaklaşık 10 kat yukarı ve aşağı veya tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar yukarı ve aşağı doğru yapın.
  13. 0.5 mL DMEM / F12 +% 10 fetal sığır serumu (FBS) + antibiyotik ekleyin ve hücreleri 375 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    NOT: Hücre kültürü için kullanılan geniş spektrumlu antibiyotik hakkında daha fazla bilgi için, Malzeme Tablosuna bakın.
  14. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 1 mL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotik içinde yeniden askıya alın. Hücreleri 375 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın.

2. Stromal bölmenin işlenmesi

NOT: Bu bölümde, fare endometriyumunun stromal bölmesini izole etmek için gerekli protokoller özetlenmektedir. Epitel / stromal ko-kültür deneylerine artan ilgi göz önüne alındığında, organoidleri üretecek epitel hücrelerine ek olarak stromal hücre popülasyonlarını da işleyebilmek önemlidir.

  1. Tüm epitel uterus fragmanlarından enzimatik ve mekanik olarak ayrıldıktan sonra, kalan tüp benzeri yapılar "stromal / miyometriyel" bölmelerdir. Bu dokuyu HBSS çözeltisinde 2.5 mg / mL kollajenaz + 2 mg / mL DNaz içinde toplayın.
  2. Stromal / myometriyal numuneyi 15 dakika boyunca 37 ° C'lik bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
  3. Kuluçkayı takiben, fare başına 500 μL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotik ekleyin ve ayrışmamış parçaları 40 μm hücre filtresinden filtreleyin.
  4. Hücreleri 375 × g'da 5 dakika santrifüjleme ile toplayın.
  5. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 1 mL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotik içinde yeniden askıya alın. Karışımı 10 cm'lik bir hücre kültürü plakasına 10 mL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotiklere damla damla ekleyin. Plakayı nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
  6. Fare endometriyal epitel ve stromal hücrelerinin ortak kültürlerini oluşturmak için, iskelesiz veya kollajen matriks sistemleri kullanarak insan endometriyal organoidleri için açıklanan yöntemleri izleyin 6,8.
    NOT: Bu teknikler fareler için henüz yayınlanmamış olsa da, insan endometriyumu ile yayınlanan protokollere dayanarak uyarlanabilirler.

3. Organoidleri oluşturmak için uterus epitelinin jel matrisine kapsüllenmesi

NOT: Jel matrisini kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.

  1. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini, hücre peletinin 20 katı olan bir jel matrisi hacminde yeniden askıya alın (yani, hücre peleti 20 μL ise, hücreleri 400 μL jel matrisi ile yeniden askıya alın). Kabarcıkların ortaya çıkmasını önlemek için peleti dikkatlice askıya alın.
  2. Jel matris/hücre süspansiyonunun oda sıcaklığında ~ 10 dakika boyunca yerleşmesine izin verin.
  3. Jel matris/hücre süspansiyonu yarı katı bir jel haline geldiğinde, jel matris/hücre süspansiyonunun 25 μL'sini nazikçe aspire etmek için geniş delikli 200 μL uçlu bir P200 mikropipet kullanın. 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğu başına üç ayrı 25 μL kubbe dağıtın ve jel matrisinin 37 ° C nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe 15 dakika boyunca sertleşmesine izin verin.
  4. Jel matrisi kürlendikten sonra, jel matris kubbeleri içeren her bir kuyucuğa 750 μL organoid ortam ekleyin. Nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Organoid ortam formülasyonu Malzeme Tablosunda belirtilmiştir. Organoidler tipik olarak ilk kültürden sonraki 4 gün içinde oluşur.

4. Östradiol ile tedaviyi takiben endometriyal organoidlerin gen ekspresyon analizi

NOT: Bu bölümde, östradiol ile tedaviyi takiben gerçek zamanlı qPCR kullanarak endometriyal epitel organoidlerinin gen ekspresyonunun profilini çıkarmak için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır (E2; bakınız Tablo 1). Endometriyum, yumurtalık hormonu E2'nin döngüsel kontrolü altında olduğundan, organoidlerin E2'ye duyarlılığını test etmek, fizyolojik fonksiyonun önemli bir ölçüsüdür. Yüksek kaliteli RNA elde ettik ve endometriyal epitel organoidlerimizden qPCR ve / veya RNA dizilimini kullanarak gen ekspresyonunu profillemek için yeterli mRNA ürettik. Bu bölümde, organoidlerin nasıl toplanacağı ve gen ekspresyonunun aşağı akış analizi için nasıl işleneceği açıklanmaktadır. Seçilen tedavi ortamı, kültürlenmiş endometriyal hücreleri tedavi etmek için kullanılanı yansıtır. Bununla birlikte, bu tedavi ortamının, insan endometriyal 3D kültürlerinin 8,16,17 hormonlarıyla tedavisi için yapıldığı gibi, buna göre optimize edilebileceği belirtilmelidir.

  1. Kültür yukarıda tarif edildiği gibi endometriyal organoidler.
  2. Organoid ortamı çıkarın ve tohumlamadan dört gün sonra 750 μL açlık ortamı ile değiştirin. Gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  3. Ertesi sabah, açlık ortamını çıkarın. Araç veya 10 nM E2 içeren 750 μL arıtma ortamı ekleyin. 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
  4. Kit üreticisinin protokolünü izleyerek RNA izolasyonuna devam edin.

5. Endometriyal organoidlerin histolojik analizi

NOT: Endometriyal organoidlerin morfolojik özelliklerinin görüntülenmesi, büyüme faktörlerinin, genetik manipülasyonların veya küçük molekül inhibitörlerinin hücresel etkisini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir. Bu bölümde histolojik boyalar ve antikor immünofloresan boyama kullanılarak endometriyal epitel organoidlerinin fiksasyonu, işlenmesi ve görüntülenmesi için kullanılan teknikler açıklanmaktadır.

  1. 1x PBS'de 1 mL% 4 paraformaldehit içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Onları buzun üzerine yerleştirin.
  2. Ortamı, organoidleri içeren 12 delikli plakanın kuyucuklarından aspire edin.
  3. Kesilmiş uçlu 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak, her bir oyuğa 500 μL% 4 paraformaldehit aktarın ve jel matris kubbelerini plakanın altından yavaşça ayırın.
  4. Tüm jel matris kubbelerini pipet ucuna nazikçe aspire edin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Organoidleri gece boyunca 4 ° C'de bir rotatöre yerleştirerek sabitleyin.
  6. Ertesi sabah, organoidleri peletlemek için tüpü 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüj edin. % 4'lük paraformaldehit çözeltisini bir pipetle nazikçe çıkarın ve atın. Organoidleri% 70 etanol ile 2 kat yıkayın.
  7. Son yıkamadan sonra, tüpten 50-100 μL etanol hariç hepsini çıkarın. Tüpü bir kenara koyun.
  8. Jeli eritmek için bir su banyosuna ve mikrodalgaya bir numune işleme jeli tüpü yerleştirin. Jelin kıvamını izleyerek numune işleme jelinin kaynamadığından emin olun.
    NOT: Numune işleme jeli eritildikten sonra, ancak sıcak kaynatılmadığında, organoidleri kapsüllemek için hızlı bir şekilde çalışın.
  9. Kalıbın tüm yüzeyini (yaklaşık 250 μL) kaplayacak kadar numune işleme jeli aktarın.
  10. Numune işleme jeli hala erimiş durumdayken, organoidleri içeren 50 μL% 70 etanol çözeltisini hızlı bir şekilde aktarın. Organoidlerin kalıbın alt kısmına batırıldığından veya itildiğinden emin olun.
  11. Histoloji kalıbını bir kova buz üzerine yerleştirin ve numune işleme jelinin soğumasını ve katılaşmasını bekleyin.
  12. Numune işleme jeli tamamen kuruduktan sonra, numune işleme jeli karesini dikkatlice bir numune torbasına aktarın ve organoidlerin bulunduğu düzlemi takip edin.
  13. Torbayı bir histoloji kasetine yerleştirin ve formalin fiksasyonu ve dokuların parafin gömülmesi için kullanılan standart yöntemleri kullanarak işlemyapın 18.
  14. Fiksasyon ve parafine gömülmeyi takiben, bir mikrotom19 kullanarak 5 μm kesitlere bölün. Aşağıda belirtildiği gibi standart hematoksilin ve eozin (H & E) boyama veya immün boyama prosedürlerine devam edin.

6. Hematoksilin ve eozin boyama

  1. Bölümleri aşağıdaki gibi deparaffinize edin: ksilen, 2 x 10 dakika; %100 etanol, 2 x 3 dakika; % 80 etanol, 3 dakika; % 60 etanol, 3 dakika; dH 2 O,2x 3 dakika; Hematoksilinde 1 dakika; musluk suyu (3 x 5 s); Eozin'de 1 dakika.
  2. Bölümleri aşağıdaki gibi kurutun:% 60 etanol, 3 dakika; % 80 etanol, 3 dakika; % 95 etanol, 3 dakika; %100 etanol, 2 x 3 dakika; ksilen, 2 x 15 dk.
  3. Montaj ortamı kullanarak monte edin.

7. İmmünofloresan boyama

  1. Bölümleri adım 6.1'de açıklandığı gibi ayrıştırın.
  2. Antijen alımı gerçekleştirin
    1. Slaytları antijen alma çözeltisine mikrodalgada güvenli bir kaba batırın.
    2. Mikrodalgayı 20 dakika boyunca yüksek ısıda, çözeltinin kaynamamasını sağlamak için 5 dakikalık aralıklarla kullanın.
  3. 20 dakikalık antijen alma adımı tamamlandıktan sonra, slaytların 40 dakika boyunca buz üzerinde soğumasına izin verirken, antijen alma tamponuna batırılmış halde bırakın.
  4. Slaytları 3 dakika boyunca 1x TBST ile yıkayın
  5. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST'de% 3 BSA'da inkübe ederek slaytları bloke edin.
  6. Birincil antikor inkübasyonu
    1. TBST'de antikoru% 3 BSA ile seyreltin (Ab'ye bağlı olarak 1:50-1:1,000).
    2. Nemlendirilmiş bir odada 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
    3. TBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  7. İkincil antikor inkübasyonu
    1. Antikoru% 3 BSA (TBST'de) (1:250) veya% 5 normal eşek serumunda seyreltin.
    2. Antikor bir florofora konjuge edildiğinden, karanlıkta oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
  8. Nükleer boyama
    1. TBST'de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:1,000 seyreltin.
    2. RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
    3. TBST ile 2 x 5 dakika yıkayın.
  9. Montaj
    1. Kapak kapağını monte etmek için bir damla montaj ortamı kullanın.
    2. Ertesi gün oje kullanarak kapak kapağını kapatın.

Sonuçlar

Fare endometriyal organoidlerinin faz kontrast görüntüleri
Ekli protokolde açıklandığı gibi WT fare endometriyal epitelinden organoidler oluşturduk ( Şekil 1'deki şemaya bakınız). Fare endometriyal epitelinin enzimatik ayrışmasını takiben, epitel tabakaları uterus stromal hücrelerinden mekanik olarak ayrıldı ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için kollajenaz ile ayrıştı. Doğru yapılırsa, bu epitel ve stromal hücre ayırma yöntemi, k...

Tartışmalar

Burada, fare endometriyumundan endometriyal epitel organoidleri üretme yöntemlerini ve bunların aşağı akış analizi için rutin olarak kullanılan protokolleri açıklıyoruz. Endometriyal organoidler, endometriozis, endometriyal kanser ve implantasyon başarısızlığı gibi endometriyal ilişkili hastalıkları kontrol eden mekanizmaları incelemek için güçlü bir araçtır. 2017 yılında yayınlanan dönüm noktası çalışmaları, fare ve insan epitelinden endometriyal organoidlerin uzun vadeli ve yenile...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Dr. Stephanie Pangas ve Dr. Martin M. Matzuk'a (M.M.M.) makalemizin eleştirel okuması ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Çalışmalar, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü hibeleri R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.), ve R01-HD110038 (M.M.) ve NCI- P30 Kanser Merkezi Destek Hibesi (NCI-CA125123) tarafından desteklenmiştir. Diana Monsivais, Ph.D. Burroughs Wellcome Fund'dan Yeni Nesil Hamilelik Ödülü'ne sahiptir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Organoid Media Formulation
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-freeCorning354230100%
Trypsin from Bovine PancreasSigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 supplementLife Technologies175020481X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165-5G1.25 mM
L-glutamineLife Technologies250300242 mM
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01Tocris2939500 nM
Recombinant human EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
Recombinant human NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
Recombinant human FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
Recombinant human HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR&D systems5036-WN200 ng/mL
Other supplies and reagents
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher14190-2501X
HBSS, no calcium, no magnesiumThermoFisher141701121X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)Fisher Scientific#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)Fisher Scientific#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µmFisher Scientific#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)Genesee Scientific11-331
Trizol reagentInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol redThermoFisher11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal strippedSigma AldrichF6765-500ML2%
Estratiol (E2)Sigma AldrichE1024-1G10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM GradeVWR157104%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue CassettesFisher Scientific1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base MoldsFisher Scientific64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount Mounting MediumFisher Scientific50-277-97
Epredia Nylon Biopsy BagsFisher Scientific6774010
HistoGel Specimen Processing GelVWR83009-992
Hematoxylin solution PremiumVWR95057-844
Eosin Y (yellowish) solution PremiumVWR95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7.4GenDEPORTT80561X
Citric acid Sigma AldrichC0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI Solution (1 mg/mL)ThermoFisher622481:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LabsH-1000-10
Clear Nail PolishFisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific22037246
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I) DSHBTROMA-I 1:50 dilution
Vimentin AntobodyCell Signaling5741S1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-212061:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo MicroscopeZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital cameraZEISS
Primer SequenceForward (5'-3')Reverse (5'-3')_
Lipocalin 2 (Lcn2)GCAGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)TGAGGCCCTTGGACTCTGTACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTCTAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)CAATGTGTCCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCACCTTCTT

Referanslar

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 191endometriyumorganoidlerk s rl kuterusrejenerasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır