Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Özet

Burada, karaciğer kanseri dokusundan elde edilen küçük hücre dışı veziküllerin optimize edilmiş bir diferansiyel ultrasantrifüjleme yöntemi ile zenginleştirilmesini açıklıyoruz.

Özet

Dokudan türetilen küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler), kaynak hücrelerin fonksiyonel durumunu ve dokunun interstisyel boşluğunun özelliklerini yansıtabilir. Bu sEV'lerin verimli bir şekilde zenginleştirilmesi, biyolojik işlevlerinin incelenmesi için önemli bir önkoşuldur ve klinik tespit tekniklerinin ve terapötik taşıyıcı teknolojisinin geliştirilmesinin anahtarıdır. SEV'leri dokudan izole etmek zordur, çünkü genellikle ağır kirlenirler. Bu çalışma, karaciğer kanseri dokusundan yüksek kaliteli sEV'lerin hızlı bir şekilde zenginleştirilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Yöntem dört aşamalı bir işlem içerir: sindirim enzimlerinin (kollajenaz D ve DNaz Ι) doku ile inkübasyonu, 70 μm hücre süzgecinden filtrasyon, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve 0.22 μm membran filtresi ile filtrasyon. Diferansiyel ultrasantrifüjleme adımının optimizasyonu ve bir filtreleme adımının eklenmesi sayesinde, bu yöntemle elde edilen sEV'lerin saflığı, klasik diferansiyel ultrasantrifüjleme ile elde edilenden daha yüksektir. Doku kaynaklı sEV'lerin incelenmesi için önemli bir metodoloji ve destekleyici veriler sağlar.

Giriş

Küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) yaklaşık 30 nm ila 150 nm çapındadır ve çeşitli hücreler tarafından salgılanır¹. Doku hücreleri ile iletişim kurabilir ve lipitler, proteinler, DNA ve RNA gibi önemli biyolojik molekülleri çeşitli organlara, dokulara, hücrelere ve hücre içi parçalara taşıyarak yerel veya uzak mikro ortamı düzenleyebilirler. Böylece, alıcı hücrelerin davranışını da değiştirebilirler ^2,3. Belirli sEV'lerin izolasyonu ve saflaştırılması, hastalığın gelişimi ve seyri sırasında biyolojik davranışlarını incelemek için gerekli bir ön koşuldur. Altın standart olarak kabul edilen diferansiyel ultrasantrifüjleme, sEV'leri normalde bulundukları dokulardan ayırmak için yaygın olarak kullanılır⁴. Doku kalıntıları, hücre kalıntıları, büyük veziküller ve apoptotik cisimler bu teknikle çıkarılabilir ve sadece sEV'ler bırakılabilir.

Kollajenaz D ve DNaz I'in, hücrelerin veya veziküllerin moleküler özelliklerini etkilemediği, her iki enzimin özelliklerinin hücre dışı matris ^5'teki veziküllerin salınımına katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Bu enzimler, insan metastatik melanom dokusundan, kolon kanseri dokusundan ve kolonik mukozal dokudan sEV'leri çıkarmak için kullanılmıştır ^5,6,7. Bununla birlikte, bu yöntemlerde kollajenaz D ve DNaz I'in konsantrasyonu ve sindirim süresi farklılık göstermekte ve tutarsız sonuçlara yol açmaktadır. Diğer sEV alt tiplerinin kopyalanmasını önlemek için, araştırmacılar filtrasyon ve / veya diferansiyel santrifüjleme⁸ ile daha büyük hücre dışı vezikülleri (0.1 μm veya 0.2 μm çapında) çıkardılar. Kaynak dokuya bağlı olarak, farklı izolasyon ve saflaştırma yöntemleri gerekebilir ^9,10.

Karaciğer dokusundan sEV'leri çıkarmak için geleneksel diferansiyel ultrasantrifüjleme yönteminin kullanılması, özelliklerini belirlemenin herhangi bir yolu olmadan, süpernatanın yüzeyinde bir beyaz madde tabakası ile sonuçlanır. Önceki bir çalışmada¹¹, bu beyaz madde tabakasının sEV'lerin saflığını etkilediği bulunmuştur. Geleneksel yöntemle izole edilen numunelerin partikül sayısı ve protein konsantrasyonu mevcut yöntemden daha yüksek olmasına rağmen, varyasyon katsayısı büyüktü, çünkü muhtemelen birçok kirletici sonuçların zayıf tekrarlanabilirliğine yol açabilir. Yani, deterjan kullanarak (yani,% 1 Triton X-100'deki parçacıkların çözünürlüğünü tespit ederek), bu yöntemle elde edilen sEV'lerin saflığının daha büyük olduğunu bulduk. Bu nedenle, proteomik araştırmalar için kolorektal kanser dokusundan türetilen sEV'leri izole etmek ve saflaştırmak için bu yöntemi kullanıyoruz.

Şu anda, karaciğer kanserinde sEV'ler üzerine yapılan araştırmalar esas olarak serum, plazma ve hücre kültürünün süpernatantı^12,13,14'e odaklanmıştır. Bununla birlikte, karaciğer kanseri dokusundan türetilen sEV'ler, fizyolojik patolojiyi ve karaciğer kanserinin çevresindeki mikro ortamı daha doğru bir şekilde yansıtabilir ve diğer EV'lerin bozulmasını ve kirlenmesini etkili bir şekilde önleyebilir^15,16. Diferansiyel ultrasantrifüjleme kullanımı ile, bu yöntem verimi zenginleştirebilir ve yüksek kaliteli sEV'ler elde edebilir ve karaciğer kanserinin daha ileri çalışmaları için önemli bir temel sağlar. Bu yöntem, karaciğer kanseri dokusunun keskin bir ayırma ile ayrılmasını ve kollajenaz D ve DNaz I ile ayrışmasını sağlar. Daha sonra, hücresel enkaz, büyük veziküller ve apoptotik cisimler filtrasyon ve diferansiyel ultrasantrifüjleme ile daha da uzaklaştırılır. Son olarak, sEV'ler daha sonraki çalışmalar için izole edilir ve saflaştırılır.

Protokol

İnsan karaciğer kanseri dokusu, Gannan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'nde karaciğer malignitesi teşhisi konan hastalardan toplandı. Tüm hastalar bilgilendirilmiş onam formu imzaladı ve insan doku örneklerinin toplanması Gannan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'nin etik komitesi tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Hazırlık

1. Aktarım renk giderici çalkalayıcıyı inkübatöre yerleştirin ve sıcaklığı 37 ° C'ye ayarlayın. Gerekli diğer tüm ekipmanlar için Şekil 1'e bakın.
2. Neşter ve forsepsleri %75 alkol püskürterek temizleyin.
3. 6 mg kollajenaz D (4 mg / mL) ve 24 μL DNaz Ι (80 U / mL) ölçerek ve bunları 1.5 mL RPMI-1640 bazik ortama ekleyerek sindirim çözeltisini hazırlayın. Katkı maddeleri tamamen çözünene kadar nazik ters çevirme ile karıştırın.
4. Önceden, 70 μm ve 0.22 μm hücre süzgeçlerini 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile nemlendirin.
5. Buz çözüldükten sonra karaciğer dokularını tutmak için buz kutusunun üzerine 100 mm'lik steril bir hücre kültürü kabı yerleştirin.
6. Hepatosellüler karsinom doku izolasyonundan sonraki 15 dakika içinde, doku bloğunun yüzeyindeki kanı PBS ile durulayın, dokuyu steril dondurulmuş bir tüpe aktarın ve deneye kadar 2 haftadan fazla olmamak üzere -80 ° C'de saklayın.

2. Doku ayrışması

1. Doku örneğini -80 °C dondurucudan çıkarın ve 2 mm x 2 mm x 2 mm parçalar halinde kesilmiş mendilin yaklaşık 400 mg'ını buz kutusundaki 10 cm'lik hücre kültürü kabına yerleştirin.
2. Dokuyu 1.5 mL sindirim çözeltisi ile 6 delikli bir plakaya taşıyın; Daha sonra, karaciğer kanseri dokusunun tamamen ayrışması ve sEV'lerin salınması için 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe etmek için plakayı transfer renk giderici çalkalayıcıya (20 rpm / dak) yerleştirin.
3. 6 delikli plakayı inkübatörden çıkarın ve buz kutusuna yerleştirin. Sindirimi durdurmak için 80 μL fosfataz inhibitörü ve 200 μL tam proteaz inhibitörü çözeltisi ekleyin.
4. Sindirim solüsyonunu 70 μm hücre süzgecine aktarın ve büyük doku kalıntılarını gidermek için yavaşça filtreleyin. Filtreyi toplayın ve 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.

3. Diferansiyel ultrasantrifüjleme

NOT: Tüm santrifüjleme adımlarını 4 °C'de gerçekleştirin.

1. Filtratı 10 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir 2 mL santrifüj tüpünde toplayın. Küçük doku kalıntılarının çoğu daha sonra çıkarılabilir.
2. Hücre kalıntılarını gidermek için süpernatantı 20 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüj edin. Pipetin ucu yüzeydeki beyaz maddeye temas etmek üzere olana kadar süpernatantı dikkatlice yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
3. Kalan sıvıyı 3 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin; Daha sonra, veziküllerin toplanmasını kolaylaştırmak için süpernatantı aspire edin. EV'lerin saflığını sağlamak için, beyaz maddenin aspire edilmediğinden emin olun.
4. Toplanan süpernatantı 20 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj edin ve süpernatantın 900 μL'sini 4.7 mL'lik bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Kalan sıvıyı 3 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj edin ve ardından her iki süpernatantı da aynı ultrasantrifüj tüpünde toplayın ve karıştırın. Tüpü tamamen PBS ile doldurun.
5. Süpernatantları 60 dakika boyunca 100.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve ultra santrifüj tüpünü PBS ile doldurarak ve 60 dakika boyunca 100.000 × g'da tekrar santrifüj yaparak peleti yeniden askıya alın. Pelet 50 μL PBS ile tekrar askıya alın.
6. 1 mL steril şırınga kullanarak sEV süspansiyonunu aspire edin ve 0,22 μm membran filtresinden filtreleyin. Filtratı 600 μL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve daha fazla analiz için -80 ° C'de saklayın.

4. Zenginleştirme kalitesinin değerlendirilmesi

1. Bir transmisyon elektron mikroskobu altında sEV'lerin morfolojisini gözlemleyin.
   1. Ardından, 10 μL sEV numunesini bakır bir ağ üzerine bırakın, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve fazla sıvıyı gidermek için emici kağıt kullanarak steril damıtılmış suyla temizleyin.
   2. 1 dakika boyunca negatif boyama için bakır ağın üzerine 10 μL% 2 uranil asetat damlatın. Bakır ağın yüzeyindeki sıvıyı emmek için filtre kağıdı kullanın ve bir akkor lamba altında 2 dakika kurutun.
   3. Bakır ağı bir transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemleyin ve 80 kV'de görüntü alın.
2. sEV'lerin boyut dağılımını ve saflığını belirlemek için bir nanopartikül akış sitometresi kullanın.
   1. Makine çalışmaya başlamadan önce, 200 μL kalite kontrol, 200 μL silika nanosfer, 2 x 200 μL ultra saf su, 2 x 200 μL temizleme çözeltisi ve 200 μL PBS içeren tüpler hazırlayın.
      NOT: sEV numunelerini test etmeden önce, cihaz üzerinde kalite kontrolü yapmak ve partikül boyutu standardını test etmek gerekir (boyut dağılımı, aynı algılama koşulu altında farklı çaplarda [68-155 nm] birkaç nanomikrosfer ile oluşturulan standart eğriler kullanılarak hesaplanmalıdır). QC boncukları ve silika nanosferleri, toplam 200 μL hacimde ultra saf su ile 100x seyreltildi.
   2. Temizleme çözeltisinin hacmini (>10 mL) kontrol edin ve kılıf sıvısının seviyeleri ile atık sıvının (20-30 cm) seviyeleri arasındaki farkı not edin.
   3. Cihazın ana güç kaynağını kapatın; 20 saniye sonra, bilgisayarı açın ve yazılımı çalıştırmak için cihazın düzgün bir şekilde bağlandığını gösteren bip seslerini bekleyin.
   4. Kamerayı, lazeri ve hava pompasını açmak için Başlat'a tıklayın.
   5. Sheath Flow-Start Up'a tıklayın ve yükleme platformuna ultra saf su yerleştirin. 4 dakika sonra (cihazın geri sayımı), Numune Artırma | Numune-Boşaltma.
   6. 30 saniye sonra, boş tüpü yükleme platformuna yerleştirin ve Numune Artırma | Numune-Boşaltma. Ardından, ultra saf suyu tutan tüpü yükleme platformuna yerleştirin ve aynı anda Numune Güçlendirme | Kılıf Akış-Temizleme.
   7. Manuel Çalıştırma'ya tıklayın ve partikül konsantrasyon tüpünü yükleme platformuna yerleştirin. Ardından, 1 dakika boyunca Sample-Boosting'e tıklayın ve aynı anda "SAMP . İnf."
   8. Numune Örnekleme'ye tıklayın ve SPCM'ye tıklayarak dedektörü açın.
      NOT: Bu noktada, gerçek zamanlı sinyal dalga formu görülebilir.
   9. Otomatik Örnekleme'ye tıklayın ve basıncı 1 KPa'da sabitlemek için Örnekleme SET'ine 1.0 girin. Araç çubuğuna tıklayın ve Büyük Sinyal'i seçin.
   10. Lazerin yatay konumunu ayarlayın ve lazeri 2 μm'ye ayarlayın; Ardından, sinyalin güçlü ve düzgün olduğundan emin olmak için L veya R'ye tıklayın.
   11. Tamamlandığında otomatik olarak Arabelleğe atlayacak olan verileri toplamak için Kayıt Süresi'ne tıklayın. Ardından, verileri bir Naf Dosyasına kaydedin ve Sample-Unload'a tıklayın.
   12. Temizleme çözeltisi tüpünü yükleme platformuna yerleştirin, Numune Artırma'ya tıklayın ve 1 dakika sonra Numune Boşaltma'ya tıklayın. Artık temizleme solüsyonunu kılcal uçtan çıkarmak için ultra saf su kullanın.
   13. Partikül boyutundaki standart tüpü yükleme platformuna yerleştirin ve 1 dakika boyunca Numune Güçlendirme'ye tıklayın.
   14. "SAMP. Inf" ve Sample-Sampling'e (Örnek-Örnekleme) tıklayın. Ardından, araç çubuğuna tıklayın ve Küçük Sinyal'i seçin.
   15. Tamamlandığında otomatik olarak Arabelleğe atlayacak olan verileri toplamak için Kayıt Süresi'ne tıklayın. Ardından, verileri bir Naf Dosyasına kaydedin ve Sample-Unload'a tıklayın.
   16. Temizleme çözeltisi tüpünü yükleme platformuna yerleştirin, Numune Güçlendirme'ye tıklayın ve 1 dakika sonra Numune Boşaltma'ya tıklayın. Artık temizleme solüsyonunu kılcal uçtan çıkarmak için ultra saf su kullanın.
   17. PBS tüpünü yükleme platformuna yerleştirin; 1 dakika boyunca Numune Artırma'ya tıklayın.
   18. "SAMP. Inf" ve Sample-Sampling'e (Örnek-Örnekleme) tıklayın. Ardından, araç çubuğuna tıklayın ve Küçük Sinyal'i seçin.
   19. Veri toplamak için Kayıt Süresi'ne tıklayın, bu da bittiğinde otomatik olarak Arabelleğe atlayacaktır. Verileri bir Naf Dosyasına kaydedin ve Sample-Unload'a tıklayın.
   20. Temizleme çözeltisi tüpünü yükleme platformuna yerleştirin, 1 dakika sonra Numune Artırma ve Numune Boşaltma'ya tıklayın. Artık temizleme solüsyonunu kılcal uçtan çıkarmak için ultra saf su kullanın.
   21. Örnek bilgileri daha önce 4.2.17-4.2.20 adımlarında açıklandığı gibi kontrol edin; PBS'yi (adım 4.2.17) sEV örneği olarak değiştirin ve verileri analiz edin.
3. EV'leri batı lekesi ile daha fazla tanımlayın.
   1. Üreticinin talimatlarına göre BCA protein niceleme kitini kullanarak sEV'lerin ve dokuların protein konsantrasyonlarını belirleyin.
   2. Bu nicel sonuçlara dayanarak sEV'lerin yükleme hacmini hesaplayın (örneğin, kuyu başına 5 μg protein için). 1:4 oranında yükleme tamponu ekleyin ve karışımı vorteksleyin.
   3. 100 ° C'lik bir metal banyosunda (kuru termostat) 10 dakika boyunca denatürasyondan sonra, proteini 80 dakika boyunca 60 V'ta% 12'lik bir poliakrilamid jel üzerinde ayırın.
   4. Jeli, transfer tamponu (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 20 metanol) kullanarak 2 saat boyunca 220 mA'da 0.22 μm poliviniliden diflorür membran üzerine aktarın.
   5. Membranı Tris tamponlu salin Arasında (TBST) oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 yağsız kuru sütle bloke edin ve 4 ° C'de bir gecede birincil antikor (tavşan monoklonal anti-insan CD9 antikoru, tavşan monoklonal anti-insan CD63 antikoru, tavşan monoklonal anti-insan TSG101 antikoru, fare monoklonal anti-insan GM130 antikoru) ile inkübe edin. Birincil antikorları %5 yağsız sütte 1:1.000'de seyreltin.
   6. TBST ile üç yıkamadan sonra, zarı yaban turpu peroksidaz (HRP) - konjuge ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
   7. ECL lekeleme substratını kullanarak HRP'ye bağlı antikoru tespit edin ve ardından görüntüleri toplayın ve analiz edin.

Sonuçlar

İnsan karaciğer kanseri dokularından elde edilen sEV'ler, karaciğer kanserli hastaların tanı, tedavi ve prognozunda çok önemli bir rol oynamıştır. Bu yöntem, karaciğer kanseri dokularından türetilen sEV'leri izole etmek ve saflaştırmak için yaygın laboratuvar araçlarını kullandı; bu, sEV'lerin incelenmesi için metodolojik destek sağlayabilir. Şekil 2, karaciğer kanseri dokularından sEV'leri zenginleştirmenin genel sürecini göstermektedir. Dokuların hücreler a...

Tartışmalar

Bu protokol, karaciğer kanseri dokusundan sEV'leri çıkarmak için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar. Yüksek kaliteli sEV'ler keskin doku izolasyonu, sindirim enzimleri ile tedavi, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve 0.22 μm filtre membranı filtrasyonu ve saflaştırılması ile elde edilir. Aşağı akış analizi için, sEV'lerin yüksek saflığını sağlamak son derece önemlidir. Diferansiyel santrifüjleme sürecinde, süpernatanın yüzeyinde bir beyaz madde tabakası (bilinmeyen bileşim) görünecekti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Membrane Filter Unit	Millex	SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2% Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube	Beckman Coulter	361621
6-well Cell cuture plate	LABSELECT	11110
50 mL Beaker	Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company	CF2100800
70 µm Cell strainer	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish	CELL TER	CS016-0128
600 µL Centrifuge tube	Axygen	MCT060C
BCA protein quantification kit	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman	A95761
BioRad Mini trans-blot	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean	Bio-Rad	1645050
CD63 Antibody	Abcam	ab134045
CD9 Antibody	Abcam	ab263019
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428HQ527333
Cleaning Solution	NanoFCM	C1801
Collagenase D	Roche	11088866001
Copper net	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
Dry Thermostat	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody	Elabscience	E-AB-F1086C
Glycine	Solarbio	G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody	Proteintech	SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody	Proteintech	SA00001-2
Methanol	Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)	Roche	4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)	Servicebio	G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Solarbio	ISEQ00010
QC Beads	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 basic medium	Biological Industries	C11875500BT
Scalpel	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
Silica Nanospheres	NanoFCM	S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8	Kylin-Bell	E0018
Transmission Electron Microscope	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101 Antibody	Proteintech	28283-1-AP
Tweezer	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X