IDG-SW3 Üç Boyutlu Hücre Dışı Matriste Hücre Kültürü

Özet

Burada, IDG-SW3 hücrelerini üç boyutlu (3D) hücre dışı bir matriste kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Osteositler, osteoblastlardan terminal olarak farklılaşan proliferatif olmayan hücreler olarak kabul edilir. Kemik hücre dışı matrikste (osteoid) gömülü osteoblastlar, hücresel dendritler oluşturmak ve preosteositlere dönüşmek için Pdpn genini eksprese eder. Daha sonra, preosteositler, matriks mineralizasyonunu teşvik etmek ve böylece olgun osteositlere dönüşmek için Dmp1 genini eksprese eder. Bu sürece osteositogenez denir. IDG-SW3, osteositogenezin in vitro çalışmaları için iyi bilinen bir hücre hattıdır. Önceki birçok yöntem, kollajen I'i kültür matrisinin ana veya tek bileşeni olarak kullanmıştır. Bununla birlikte, kollajen I'e ek olarak, osteoid ayrıca hücresel büyümeyi, yapışmayı ve göçü teşvik etmede önemli bir bileşen olan bir öğütülmüş madde içerir. Ek olarak, matris maddesi şeffaftır, bu da kollajen I-oluşturulan jelin şeffaflığını arttırır ve böylece görüntüleme teknikleri yoluyla dendrit oluşumunun araştırılmasına yardımcı olur. Bu nedenle, bu makale, IDG-SW3'ün hayatta kalması için kollajen I ile birlikte hücre dışı bir matris kullanarak bir 3D jel oluşturmak için bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu çalışmada, osteositogenez sırasında dendrit oluşumu ve gen ekspresyonu analiz edilmiştir. 7 günlük osteojenik kültürden sonra, floresan konfokal mikroskop altında geniş bir dendrit ağı açıkça gözlendi. Gerçek zamanlı PCR, Pdpn ve Dmp1'in mRNA seviyelerinin 3 hafta boyunca sürekli arttığını gösterdi. 4. haftada, stereomikroskop, X-ışını floresan (XRF) testi ile tutarlı olarak mineral parçacıklarla dolu opak bir jel ortaya çıkardı. Bu sonuçlar, bu kültür matrisinin osteoblastlardan olgun osteositlere geçişi başarılı bir şekilde kolaylaştırdığını göstermektedir.

Giriş

Osteositler, osteoblastlardan^(1,2) türetilen terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir. Osteoblast osteoid tarafından gömüldükten sonra, osteositogeneze uğrar ve preosteositler oluşturmak için Pdpn genini^{, osteoidi mineralize etmek} için Dmp1 genini ve kemik dokusunda olgun bir osteosit olarak işlev görmek için Sost ve Fgf23 genlerini eksprese eder³. Burada, osteositogenez sürecinde dendrit uzantısını ve işaretleyici gen ekspresyonunu tanımlamak için bir 3D kültür sistemi tanıtılmıştır.

IDG-SW3 hücreleri, transgenik farelerden türetilen ölümsüzleştirilmiş bir birincil hücre hattıdır ve farklı ortamlarda kültürlendiğinde osteoblastı geç osteosit farklılaşmasına kadar genişletebilir veya çoğaltabilir⁴. MLO-A5, MLO-Y4 ve diğer hücre dizileri ile karşılaştırıldığında, fonksiyonel proteinlerin ekspresyon profili, kalsiyum tuzu biriktirme yeteneği ve IDG-SW3 hücrelerindeki çeşitli hormonlara verilen yanıtların, kemik dokusundaki primer osteositlerinkilerle aynı olma olasılığı daha yüksektir⁴.

2D sistemlerle karşılaştırıldığında, 3D kültür sistemleri, besin gradyanı, düşük mekanik sertlik ve çevreleyen mekanik aralık dahil olmak üzere in vivo hücresel büyüme ortamını taklit etme konusunda daha yeteneklidir (Tablo 1). Osteoblastik hücrelerin bir 3D sistemde kültürlenmesi için önceki yöntemlerin çoğu, ^4,5,6 formülasyonlarında benzersiz bileşen olarak kollajen I'i kullandı^, çünkü kollajen I lifleri kalsiyum ve fosfor birikimi bölgesi olarak hizmet eder. Bununla birlikte, osteoidde vazgeçilmez bir bileşen olan hücre dışı matriks, hücresel büyümeyi, yapışmayı ve göçü ^7,8 destekleyen geniş bir hücresel faktör grubu içerir ve görüntüleme gözlemi için şeffaf ve uygundur. Bu nedenle, bu protokol, osteositogenez çalışması için ikincil bir bileşen olarak Matrigel'i (bundan sonra bazal membran matrisi olarak anılacaktır) kullanır.

Protokol

Bu protokol, 24 oyuklu plakadan oluşan dört kuyucukta hücrelerin kültürlenmesi için uygundur. Birden fazla numune veya plaka hazırlıyorsanız, reaktiflerin miktarları buna göre artırılmalıdır.

1. Kollajen I karışımının hazırlanması

NOT: Kollajen I ve bazal membran matrisi oda sıcaklığında hızlı bir şekilde jelleşir. Bu nedenle, kolajen buz üzerinde (2 °C ila 8 °C) işlenmelidir. Kullanılan tüm uçlar ve tüpler, aksi belirtilmedikçe önceden soğutulmalıdır. Tüm prosedürler bir güvenlik başlığında gerçekleştirilmelidir.

1. Tüm reaktifleri ve santrifüj tüplerini buzun üzerine yerleştirin.
2. 0.48 mL kollajen I (5 mg/mL) ve 0.1 mL 10x minimum esansiyel ortam (MEM) (fenol kırmızısı ile) buz üzerinde tutulan steril 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yavaşça pipetleyin. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
3. Fenol kırmızı göstergesinin renk paletine göre, fenol kırmızı göstergesini turuncuya ayarlamak için uygun bir %7,5 (a/h)_NaHCO3 (yaklaşık 0,2 mL) hacim kullanın, bu da pH değerinin 7,0-7,4 aralığında olduğunu gösterir.
   NOT: Ortamın pH'ına bağlı olarak, pH'ı yaklaşık 7.0-7.4'e getirmek için bir hacim NaHCO3 kullanılır. Ek olarak, pH nötralizasyonu için NaOH kullanılır.
4. Uygun hacimde_ddH2Oekleyerek karışımın son hacmini 1 mL'ye getirin. Kullanıma hazırlamak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
   NOT: ddH2O'nunson hacmi, adım 1.3'te kullanılan NaHCO3 veya NaOH miktarına bağlı olacaktır.

2. Hücre-matris karışımının hazırlanması

1. 0.9 mL bazal membran matrisini buz üzerinde yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne yavaşça pipetleyin.
2. IDG-SW3 hücrelerini, 33 ° C'de 50 U / mL INF-γ ile desteklenmiş 4 mL tam ortam (% 10 fetal sığır serumu [FBS] içeren alfa-MEM) içeren bir T25 şişesinde kültürleyin.
3. IDG-SW3 hücreleri %90 birleşmeye ulaştığında, ortamı çıkarın ve hücreleri bir pipetle fosfat tamponlu salinle (PBS, protokol boyunca pH 7.4) yıkayın. Hücreleri 0.5 mL %0.25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 37 °C'de 30 saniye sindirin.
4. 3.5 mL tam ortam (% 10 fetal sığır serumu [FBS] içeren alfa-MEM) ekleyerek tripsini inaktive edin. 4 mL hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
5. Hücre süspansiyonunu 300 °C'de 5 dakika boyunca 4 × g'da döndürün. Süpernatanı atın ve hücre peletini buz üzerinde tam ortamın 1 mL'sinde yeniden süspanse edin.
6. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve son hücre yoğunluğunu tam ortamla birlikte 4 × 10⁵ hücre / mL'ye ayarlayın. Adım 2.1'den hücre dışı matrisin 0.9 mL'sine hazırlanan hücre süspansiyonunun 0.1 mL'sini ekleyin. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
   NOT: Hücresiz bir kontrole ihtiyaç duyulursa, negatif kontrol olarak 0.9 mL hücre dışı matrise 0.1 mL tam ortam ekleyin.

3. Hücre-jel karışımının kaplanması

1. Adım 2.6 ve adım 1.4 ila 2 mL'deki iki karışımı buz üzerinde yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça iyice karıştırın. Her bir oyuğa son karışımın 0,5 mL'sini pipetleyin (24 oyuklu bir plakanın dört oyuğu). Bir hücre-jel karışımı oluşturmak için 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
2. 37 ° C'de osteojenik farklılaşmayı başlatmak için her bir oyuktaki hücre-jel karışımına 0.5 mL osteojenik ortam (50 μg / mL askorbik asit ve 4 mM β-gliserofosfat içeren tam ortam) (osteojenik indüksiyon ortamı olarak da bilinir) ⁴ ekleyin. Bunu Gün 0 olarak düşünün.
3. Her 2 günde bir, ortamın yarısını 37 ° C'de tutulan taze osteojenik ortamla değiştirin. 35 gün boyunca kültüre devam edin.

4. Konfokal mikroskop kullanarak hücre canlılığını ve hücresel dendritleri tanımlamak

1. Hücre boyama
   NOT: Kalsein asetoksimetil ester (kalsein), hücre canlılığını belirlemek için kullanılabilen, hücre tarafından kullanılan bir boyadır. Etidyum homodimer-I (EthD-1), bozulmamış/canlı hücrelerin^zarını geçmez 9. Bu nedenle, kalsein / EthD-1, hücre canlılığını ve hücresel dendritleri tanımlamak için kullanılabilir.
   1. Kültürün 1. ve 7. günlerinde, kalsein stok çözeltisini (DMSO'da 4 mM) ve EthD-1 stok çözeltisini (DMSO/H₂O 1:4 [v/v]'de 2 mM) dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmalarına izin verin.
      NOT: Mineralize matris güçlü bir otofloresan sinyaline sahiptir, bu nedenle kültürlenmeden sonraki 7 gün içinde Dmp1 ekspresyonu olmayan preosteosit aşaması⁴ hücre lekelenmesinin gözlemlenmesi için daha uygundur.
   2. 2 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (D-PBS) 4 μL 2 μL 2 mM EthD-1 stok çözeltisi ve 5 μL 4 mM kalsein stok çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Bu, çalışma çözümleri olarak yaklaşık 2 μM kalsein ve 4 μM EthD-1 verir.
   3. Çalışma çözeltisinin 0,5 mL'sini 24 oyuklu plakadaki kuyucuklara pipetleyin. Hücre-jel matrisini boyamak için oda sıcaklığında 30-45 dakika inkübe edin.
   4. İnkübasyondan sonra, 35 mm'lik yeni bir cam tabanlı kültür kabına yaklaşık 0,5 mL taze D-PBS ekleyin. Numunelerin kirlenmesini veya kurumasını önlemek için tabağın üzerini örtün.
   5. Dirsek uçlu forseps kullanarak, 4.1.3 adımındaki lekeli hücre-jel matrisini 4.1.4 adımındaki 35 mm'lik kültür kabına dikkatlice aktarın. Hücre-jel matrisine zarar vermekten veya kesmekten kaçının.
   6. Etiketli hücreleri bir lazer konfokal floresan mikroskobu altında görüntüleyin.
2. Mikroskop tarama seti
   1. 35 mm'lik çanağı sahneye yerleştirin. 10x objektif kullanarak göz merceğinden taranacak hücre-jel matrisinin bölgelerini seçin. Genişletilmiş dendritlerin boyutu nedeniyle daha yüksek büyütme hedefleri önerilmez.
   2. Optik filtreleri seçin. Calcein, standart bir floresein bant geçiren filtre ile yeşil olarak görüntülenebilir ve EthD-1, propidyum iyodür veya Texas Red boya filtreleriyle kırmızı olarak görüntülenebilir. Tarama için "çizgi modunu" seçin ve "iğne deliğini" 2 μm'ye ayarlayın.
   3. 8 bit veri derinliği ve 1.024 piksel x 1.024 piksel görüntü çözünürlüğü seçin.
   4. Optimum lazer ve dedektör ayarlarıyla sıralı çizgi taraması kullanan görüntü (olası foto ağartmayı önlemek için minimum lazer enerjisi tutun).
      NOT: Optimum dedektör ayarı, son floresan sinyallerine bağlıdır.
3. Görüntülerden oluşan bir "z-yığını" toplama
   1. Yeşil kanal sinyaline göre, sürekli tarama yaparken numuneye odaklanarak taranacak hücre-jel matrisinin üst ve alt konumlarını tanımlayın, .
   2. Örneğin üst ve alt kısımları belirtildikten sonra, istediğiniz tarama çerçevesini seçin. Taramayı başlatın. Örnek, 4.2. adımdan seçilen ayarlarla yukarıdan aşağıya doğru taranacak ve bir görüntü galerisi oluşturulacaktır.
4. Hücre canlılığının tanımlanması.
   1. Adım 4.3'ten bir dilim seçin. Yeşil ve kırmızı kanallar sırasıyla canlı ve ölü hücreleri gösterir.
5. Hücre dendrit tanımlaması.
   1. Görüntü alma yazılımıyla 3B rekonstrüksiyonlar oluşturmak için tek yeşil kanalı seçin. Derinlik bilgisi, bir dizi gökkuşağı sahte renkli görüntü olarak görüntülenir. Jelin altında bulunan dendritler kırmızı renkte, üsttekiler ise mavi renkte gösterilir.

5. Stereomikroskop kullanarak görünümü tanımlama

1. Kültürün 1. gününde, 7. gününde, 21. gününde ve 35. gününde, kültür ortamını çıkarın ve jelleri plakada D-PBS ile iki kez yıkayın. Hücre-jel matrisini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca plakaya sabitlemek için kuyuya D-PBS'de 0,5 mL %4 (h/h) paraformaldehit ekleyin.
2. Kuyucuktaki paraformaldehiti çıkarın ve hücre-jel matrisini plakadaki D-PBS ile iki kez daha yıkayın. Görüntüleme için her kuyucukta 0,5 mL D-PBS bırakın.
3. Plakayı sahneye yerleştirin ve 0,5x objektif kullanarak göz merceğinden en uygun konumu seçin. Parlak alan altında "otomatik pozlama" kullanarak plakadaki hücre-jel matrisinin tam alan görünümünü ayrı ayrı görüntüleyin.

6. XRF tahlili ile mineral birikiminin belirlenmesi

1. Kültürün 35. gününde, sıvı nitrojenin yeterli olup olmadığını kontrol edin. XRF sistemini başlatın. Numune odasını açın ve dirsek uçlu forsepsli jelleri plakadan aletin numune aşamasının ortasına aktarın. Numune odasını kapatın ve kullanmadan önce cihazın soğuması için 30 dakika bekleyin.
2. Çekim kurulumu için "Pozlama süresini" 35 ms'ye, "Spektrum aralığını" 0-40 keV'ye ve "Elektrik akımını" 770 μA'ya ayarlayın.
3. Örnek aşamayı hareket ettirerek analiz için üç ila beş tarama alanı seçin.
4. Algılama için elemanları (Ca ve P) seçin. Algılamayı başlatın ve sonuçları dışa aktarın.
   NOT: Ca ve P , hidroksiapatitte en bol bulunan elementlerdir.

7. Fonksiyonel gen ekspresyonunun tanımlanması

1. Kültürün 1. gününde, 7. gününde, 21. gününde, 28. gününde ve 35. gününde, kültür ortamını çıkarın ve hücre-jel matrisini plakada buz gibi soğuk D-PBS ile iki kez yıkayın.
2. Dirsek uçlu forsepsli jelleri plakadan 2.0 mL'lik bir tüpe aktarın (kültür süresine göre, hücre-jel matrisi 35. günde kademeli olarak yaklaşık 0.1 mL'ye küçülür). Bir jelin bir tüpe yerleştirildiğinden emin olun. Her tüpe 1 mL fenol-kloroform ve iki steril paslanmaz çelik çırpma boncuğu (4 mm, bir lizasyon matrisi olarak) ekleyin. Tüpleri simetrik olarak mekanik çırpma homojenizatörünün önceden soğutulmuş numune yuvasına yerleştirin.
3. Toplamda altı döngü ile 10 saniyelik bir duraklama ile her 1 dakikalık mekanik vuruşta çırpmayı 55 Hz frekansa ve 1 cm genliğe ayarlayın. Boncuk çırpmaya başlayın.
4. Fenol-kloroform-izoamilachohol yöntemini kullanarak hücre-jel matrisinden toplam RNA'yı çıkarın. Rastgele heksamer primerleri ile 2 μg toplam RNA'yı cDNA'ya ters çevirin.
5. Gerçek zamanlı PCR için β-aktin, Pdpn, Dmp1, Sost ve Fgf23'ü hedefleyen primerler tasarlayın (Tablo 2). β-Aktin, normalizasyon için kullanılan temizlik genidir. Pdpn¹⁰ ve Dmp1 11 genleri esas olarak pre-osteositlerde ve mineralize osteositlerde eksprese edilirken, Sost¹² ve Fgf23 ¹³ esas olarak olgun osteositlerde eksprese edilir.
6. Tüpü, ısıtılmış kapağı 105 °C'ye ayarlanmış bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki PCR döngü ayarlarını kullanarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirin: 5 saniye boyunca 95 °C ve 35 döngü için 30 saniye boyunca 60 °C, 5 dakika boyunca 95 °C'de bir ilk denatürasyon adımı ve 30 saniye boyunca 60 °C'de bir son uzatma adımı. Kıvrım değişikliklerini ΔΔCt yöntemi ile analiz edin.

Sonuçlar

Canlı/ölü hücre boyamadan sonra, hücreler konfokal lazer mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Tüm hücreler kalsein-pozitifti (yeşil renk) ve sahada neredeyse hiç EthD-1-pozitif hücre (kırmızı renk) yoktu, bu da bu yöntemle yapılan jel sisteminin osteositogenez için oldukça uygun olduğunu gösteriyor (Şekil 1A, sol). Hücrelerin uzamsal dağılımını daha iyi belirlemek için, hücre dendritlerini jelin farklı derinliklerinde görüntülemek için sahte renkli bir g...

Tartışmalar

Bu protokoldeki kritik bir nokta, spontan pıhtılaşmayı önlemek için 1. ve 2. adımların buz üzerinde gerçekleştirilmesi gerektiğidir. Bu yöntemde, nihai kollajen I konsantrasyonu 1.2 mg / mL idi. Bu nedenle, çeşitli üreticilerin farklı kollajenlerine uyacak şekilde optimal bir ddH₂O hacmi hesaplanmalıdır.

İn vivo osteositogenez, osteoblastların yüzeyden trabeküler kemiğin^{içine polar hareketini içerir 14}. Bu protokol, hücrel...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422