Yeni Bir 3D Baskılı Tutucu Kullanarak Bozulmamış Ex Vivo Kürelerin Canlı Hücre Görüntülemesi

Özet

Bu çalışma, enüklee edilmiş kürelerin yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemesini sağlamak için 3D baskılı bir tutucu kullanan yeni bir deneysel protokolü açıklamaktadır. Bu protokol sayesinde, ex vivo kürelerden yaralı kornea epitelindeki hücresel kalsiyum sinyal aktivitesi gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Özet

Kornea epitelyal yara iyileşmesi, epitel hücrelerinde eksprese edilen pürinerjik reseptörlerin aktivasyonu ile başlayan bir göç sürecidir. Bu aktivasyon, hücreden hücreye yayılan, yara yatağına hücresel hareketliliği başlatmak için gerekli olan ve etkili yara iyileşmesini teşvik eden kalsiyum mobilizasyon olaylarıyla sonuçlanır. Trinkaus-Randall laboratuvarı, ex vivo murin kürelerinde kornea yarasının iyileşme yanıtını gerçek zamanlı olarak görüntülemek için bir metodoloji geliştirdi. Bu yaklaşım, sağlam bir küreyi, belirlenmiş protokollere göre ötenazi yapılmış bir fareden çekirdeksizleştirmeyi ve dünyayı derhal bir kalsiyum gösterge boyası ile inkübe etmeyi içerir. Hücrenin diğer özelliklerini lekeleyen bir karşı boya, görüntülemeye yardımcı olmak ve hücresel yer işaretlerini göstermek için bu aşamada uygulanabilir. Protokol, aktini boyamak için SiR aktinini ve hücre zarını boyamak için koyu kırmızı plazma zarı boyası da dahil olmak üzere karşı boyama için kullanılan birkaç farklı canlı hücre boyasıyla iyi çalıştı. Bir yaraya verilen cevabı incelemek için, kornea epiteli 25 G'lik bir iğne kullanılarak yaralanır ve küreler 3D baskılı bir tutucuya yerleştirilir. 3D baskılı tutucunun boyutları, deney süresince dünyanın hareketsiz kalmasını sağlamak için kalibre edilir ve farklı boyutlardaki gözlere uyacak şekilde değiştirilebilir. Yara yanıtının canlı hücre görüntülemesi, konfokal mikroskopi kullanılarak zaman içinde doku boyunca çeşitli derinliklerde sürekli olarak gerçekleştirilir. Bu protokol, konfokal mikroskopta 20x hava hedefi kullanarak yüksek çözünürlüklü, yayın kalitesinde görüntüler üretmemizi sağlar. Bu protokol için başka hedefler de kullanılabilir. Ex vivo murin kürelerde canlı hücre görüntüleme kalitesinde önemli bir iyileşmeyi temsil eder ve sinirlerin ve epitelin tanımlanmasına izin verir.

Giriş

Kornea
Kornea gözün ön yüzeyini kaplayan, görmeyi sağlamak için ışığı kıran ve gözün içini hasardan koruyan berrak, avasküler bir yapıdır. Kornea çevreye maruz kaldığından, hem mekanik nedenlerden (çizilme) hem de enfeksiyondan kaynaklanan hasarlara karşı hassastır. Aksi takdirde sağlıklı bir hastada kornea yaralanması tipik olarak 1-3 gün içinde iyileşir. Bununla birlikte, limbal kök hücre eksikliği ve tip II diyabet gibi altta yatan koşulları olan hastalarda, kornea yarası iyileşme süreci büyük ölçüde uzayabilir¹. Kornea oldukça innervatlı olduğundan, bu iyileşmeyen kornea ülserleri ve tekrarlayan kornea erozyonları çok ağrılıdır ve bunları yaşayan hastaların yaşam kalitesini büyük ölçüde azaltır¹.

Hücre sinyalizasyonu
Aksi takdirde sağlıklı bir kornea yaralandığında, yaraya bitişik hücrelerdeki kalsiyum sinyal olayları, yara yatağına hücresel göçten önce gelir ve hızlı bir şekilde göç eder, burada^yara izi ^2,3 riski olmadan yaralanmayı kapatırlar. Bu sinyal olayları, canlı hücre görüntüleme² kullanılarak kornea epitel hücre kültürü modellerinde iyi karakterize edilmiştir. Ön deneyler, diyabetik olmayan hücrelerde yaralanma sonrası diyabetik hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha fazla kalsiyum sinyallemesi olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, ex vivo kürelerdeki hücre sinyal olaylarının karakterizasyonunun teknik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır.

Canlı hücre görüntüleme
Önceki çalışmalar, kornea yara iyileşmesinin in vitro hücre kültürü modellerinden kalsiyum sinyal olaylarını başarıyla kaydetmiştir ^4,5,6. Bu sinyal olaylarının ex vivo dokuda yüksek kaliteli görüntülerini üretmek için bir metodoloji geliştirmek büyük ilgi çekicidir, çünkü bu olayların daha karmaşık ve gerçekçi bir sistemde incelenmesine izin verecektir. Önceki yaklaşımlar korneanın diseksiyonunu ve ardından UV kaynaklı PEG jeli 7,8,9'da immobilizasyonu içeriyordu. İmmobilizasyon, canlı doku ile çalışırken önemli ama zorlu bir adımdır, çünkü deney boyunca canlı ve hidratlı kalması gerekir. Ayrıca, immobilizasyon dokuya zarar vermemelidir. PEG çözeltisi dokuyu hareketsiz hale getirirken, üretilen görüntülerin çözünürlüğü ve kalitesi tutarlı değildi. Bu nedenle, daha az doku hasarı riski taşıyan daha yüksek kaliteli görüntüler üretmek için bozulmamış küreleri hareketsiz hale getirmek için 3D baskılı tutucular geliştirilmiştir.

Yaklaşım
Canlı hücre görüntüleme için bozulmamış ex vivo küreleri hareketsiz hale getirmek için benzersiz bir 3D baskılı tutucu geliştirilmiştir. Bu tutucu iki ana kaynaktan gelen hasarı önler: korneayı diseke etmeye gerek kalmadan enüklee edilmiş bir kürenin görüntülenmesini sağlar ve UV ışığına maruz kalmayı ortadan kaldırır. Bu hasar kaynakları olmadan, elde edilen görüntüler deneysel olarak yapılan çizik yaralanmalarına verilen cevabı daha doğru bir şekilde temsil ediyordu. Ayrıca, 3D baskılı tutucu, murin gözünün hassas boyutlarına göre kalibre edildi. Bu, PEG çözeltisinde immobilizasyondan çok daha iyi bir uyum sağladı ve doku hareketinin azalması nedeniyle daha düşük güçlü hedeflerde daha yüksek kaliteli bir görüntüye yol açtı. Tutucunun üst kısmına tutturulmuş bir kapak çubuğu, deney süresince dünyanın hareketsiz kalmasını ve hidrasyon ve canlılığı korumak için büyüme ortamı uygulandığında dünyanın yer değiştirmemesini sağlar. Tutucuyu hassas boyutlara basma yeteneği, yaş veya hastalık durumu nedeniyle farklı boyutlardaki murin gözleri için en uygun uyumu sağlamamızı sağlar. Bu teknoloji, boyutlarına göre farklı türlerin gözleri için tutucular geliştirmek için daha geniş çapta uygulanabilir.

Protokol

Hayvan denekleri içeren prosedürler, Oftalmik Bakım ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği ve Boston Üniversitesi IACUC protokolü (201800302) tarafından onaylanmıştır.

1. 3D baskılı tutucuların ve kapak çubuğunun tasarlanması

1. Fare kürelerinin ortalama çapını hesaba katan 3B baskılı tutucuları ve kapak çubuğunu tasarlayın ve tasarımı 3B yazdırın (Şekil 1A, B).
2. Bireysel farelerin farklı boyutlarını hesaba katmak için tutucunun iç duvarının çapını, dünyanın ortalama çapından biraz daha büyük tutun. Tutucunun yüksekliğini dünya çapının yaklaşık yarısında tutun ve 3D baskılı kapak çubuğu ile sabitlendiğinde dünyaya sıkıca oturmasını sağlayın.
3. Tutucu kapak çubuğunu, tutucu çapının 1/4 ila 1/2'si genişliğinde tutucunun dış çapının uzunluğuna göre boyutlandırın. Kapak çubuğu, hidrasyon ve deneyin sonunda gözün çıkarılması için tutucuya sabitlendiğinde küreye erişime izin verecek şekilde boyutlandırılmıştır.
4. Tutucuyu ve kapak çubuğunu yazdırın.

2. Örnek toplama

1. Ötenazi fareler (bu çalışma için 9-12 haftalık ve 27 haftalık erkek C57BL / 6 fareler kullanılmıştır) kurumsal kılavuzlara uygun olarak belirlenmiş protokolleri kullanarak. Bu protokol için, karbondioksit ile ötenazi ve ardından kafa kesme işlemini gerçekleştirin.
2. Fare kafasını çıkarın ve dokunun canlılığını korumak için hemen buzun üzerine yerleştirin. Doku hasarını önlerken diseksiyon aletleri kullanarak küreleri enüklee edin.
3. Cımbız kullanarak dünyayı proptozlayın. Optik siniri, cımbız tarafından tutulduğu yerin hemen altındaki diseksiyon makası kullanarak kırpın.
   NOT: Daha fazla önlem için, laminer akış başlığında aşağıdaki adımları uygulayın.
4. Düşük ışık koşullarına sahip 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde 1 saat boyunca kalsiyum göstergesi ve/veya hücre zarı lekesi içeren bir p35 hücre kültürü kabında_{küreleri 2} mL ortamda inkübe edin. Düzgün boyama için kürelerin boyama ortamına batırıldığından emin olun.
   1. Burada yapılan deneyler için, kalsiyum göstergesi, Fluo4-(1:100)2 ve hücre zarı karşı boyası, koyu kırmızı plazma membran boyası (1:10.000)2, aşağıdaki büyüme takviyeleri ile ² mL keratinosit serumsuz ortamda (KSFM) %1 (v/v) DMSO ve %0,1 (w/v) pluronik asit nihai konsantrasyonu ile: 25 μg/mL sığır hipofiz ekstresi, 0.02 nM epidermal büyüme faktörü, 0.3 mM CaCl₂ ve penisilin-streptomisin (sırasıyla 100 ünite / mL ve 100 μg / mL).
      NOT: Kuluçka koşulları ve süreleri, kalsiyum göstergesine, doku tipine ve numune hacmine bağlı olarak değişir. Pluronik asit kullanırken, dokuyu geçirgen hale getirdiği için dikkatli olunması önerilir. Bu protokol% 10 pluronik asit gerektirir. Daha düşük pluronik asit konsantrasyonlarının etkisiz olduğu deneysel olarak belirlenmiştir ve daha yüksek konsantrasyonlar dokuya zarar verme riski taşır.

3. Numune tutucuların hazırlanması

1. Tutucuları, daha önce kullanılmamış tutkalla temiz bir cam tabanlı kapak kapağına yapıştırın. Bu protokolde kullanılan yapıştırıcı, steriliteyi sağlamak için tek kullanımlık kaplardan gelir ve her seferinde yeni, açılmamış bir kap kullanılır.
2. Tutucuyu% 70 etanol içinde yıkayın. Tutucuya yapıştırıcı yerleştirin ve tutucuyu cam alt kapak kapağına yapıştırın. Tutkalın tutucunun iç alanında olmadığından emin olun, çünkü yapıştırıcı floresan yapabilir ve görüntülemeyi zorlaştırabilir.
3. Tutkal katılaşana kadar bekleyin. Tutucunun kapak fişine karşı güvenli olduğunu onaylayın.
   NOT: Bu makalede sunulan deneyler için cam tabanlı kapaklı P35 hücre plakaları kullanılmıştır. Diğer cam tabanlı slaytlar ve / veya plakalar, deneyin ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir.

4. Göz kürelerinin yaralanması

1. Küreleri steril göz damlalıkları kullanarak boyama çözeltisinden çıkarın, ilgilenilen bölgeye doku hasarını önlemeye özen gösterin. Fazla lekeyi çıkarmak için küreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca steril fosfat tamponlu salin kullanarak yıkayın ve küreleri mikroskopa taşımak için ortama yerleştirin.
2. İlgilenilen bölgede steril bir 25 G iğne kullanarak küreleri yaralayın.
   1. Steril bir göz damlalığı kullanarak, dünyayı gözün arkasından alın ve tutun. Bu, dünyayı sabit tutacak, yuvarlanmasını önleyecek ve tutarlı yaraların oluşmasına izin verecektir. Bu kurulumu kullanarak, optik sinir göz damlalığı nozulunun içinde olacak ve kornea dışa dönük olacaktır.
   2. Çizik yarası için, steril bir 25 G iğneyi açıkta kalan kornea boyunca yavaşça hareket ettirin. Delinme yarası için, iğneyi doğrudan merkezi korneaya hafifçe bastırın. Yaranın korneayı delmediğinden emin olun.
      NOT: Deney için bir yara yanıtı veya yaralı ortam gerekmiyorsa bu adımı atlayın. Önceki çalışmalar, bu yöntem kullanılarak yapılan murin kornealarına hem çizik yaralarının hem de delinme yaralarının hem çap hem de derinlik¹⁰ bakımından tutarlı olduğunu göstermiştir. Bağımsız küreler arasındaki yara boyutlarının doğrulanması, bir ilgi alanı analizi kullanılarak gerçekleştirildi.

5. Tutucuya numune yerleştirme

1. Kornea veya limbal bölgesi, tutucunun iç bölgesindeki örtü kapağının üzerine yerleştirin ve 3D baskılı kapağı kullanarak stabilize edin (Şekil 1C-H).
2. Dünyanın doğru konumlandırıldığını ve ilgilenilen alanın cam kapak fişi ile temas halinde olduğunu onaylayın. Dünya tutucuya yerleştirildikten sonra, dünyayı çıkarmaya çalışmayın, çünkü bu doku hasarına neden olabilir.
3. 3D baskılı kapağı tutkal kullanarak tutucuya yapıştırın ve stabilizasyonu sağlayın. Kapak çubuğunun küreye değil, tutucuya yapıştığından emin olun.
   NOT: Protokol ters çevrilmiş bir mikroskopta kullanılmak üzere yazıldığı için görüntülenecek alan aşağıya yerleştirilir. Protokol, daha küçük bir iç yarıçapa sahip tutucular ve kapak çubuğunun çıkarılması kullanılarak dik mikroskoplar için uyarlanabilir. Bu, daha az dünya istikrarı ile sonuçlanacaktır.

6. Örnek görüntüleme

1. Mikroskop ve çevre odasını açın ve odanın nemlendirildiğini doğrulayın. Deney süresince çevre odasını 35 °C ve %5 CO_2'ye ayarlayın.
   NOT: Dehidrasyonu önlemek ve dünyayı optimum sıcaklıklarda tutmak için bu prosedür için çevre odacıklı mikroskoplar tercih edilir, ancak gerekli değildir.
2. Canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak kapak kaymasını, tutucuyu ve stabilize edilmiş küreyi çevre odası ve görüntüsü içindeki mikroskop sahnesine yerleştirin⁹.
3. Dehidrasyonu önlemek ve doku canlılığını korumak için kapak kayması üzerine ilave büyüme ortamı ekleyin. Kuyuda, tutucudaki dünyayı örtmek için yeterli ortam olduğundan emin olun. Görüntüleme süresine bağlı olarak, deney boyunca gerektiğinde taze ortam ekleyin.
4. Canlı hücre görüntüleme tekniklerini ve protokollerini kullanarak deneylere başlayın. Uzun süreli deneylerde dokuyu korumak ve doku hasarını önlemek için düşük güçlü lazer ayarları kullanın. Uzun çalışma mesafeleri için uygun hedefleri kullanın. Bu makaledeki deneyler 20x hedefi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
   NOT: Lazerin gücü ve kazancı, deneysel süre, yer ve görüntüleme düzlemi, deneysel parametrelere bağlı olarak değişkenlerdir. Süresi 1 saat ile 4 saat arasında değişen bozulmamış küreler üzerinde yapılan görüntüleme deneyleri geçmiş yayınlarda başarıyla gerçekleştirilmiştir¹⁰.
5. Verileri tercih edilen dosya biçiminde kaydedin ve kaydedin. Mikroskop tarafından kullanılan yazılım, veri kaydı için .czi dosyaları üretir.
6. Küreleri, protokolün sonundaki standart kurumsal protokollere göre elden çıkarın.

Sonuçlar

Bu protokol sürekli olarak yayın kalitesinde veri ve görüntü üretmek için kullanılmıştır¹⁰. Elde edilen görüntüler önceki yaklaşımlara kıyasla önemli bir iyileşmeyi temsil etmektedir (Şekil 2). 3D baskılı tutucu kullanılarak, kornea katmanları boyunca görüntüler yakalanabilir ve farklı z-düzlemlerinde kalsiyum mobilizasyonu gözlemlenebilir (Şekil 3). Bu yaklaşım, genç ve yaşlı farelerde bir yarada apik...

Tartışmalar

Bu protokol, bozulmamış hayvan gözlerini stabilize etmek ve hareketsiz hale getirmek için 3D baskılı bir tutucu kullanan canlı bir hücre görüntüleme tekniğini tanımlar. Ex vivo kornea dokusunun önceki canlı hücre görüntüleme protokolleri ile tanınan birkaç önemli dezavantajı atlatmak için tasarlanmıştır. Bu protokol, bozulmamış kürelerin canlı hücre görüntülemesi için birçok avantaj sunar. Deneysel olarak indüklenen çizik yaralarına yara iyileşmesi tepkisine müdahale ede...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic	Creality (Shenzen, China)	N/A	Material for holder
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-14-C	Well for imaging.
Autodesk Fusion 360 software	Autodesk (San Rafael, CA).	N/A	Software used for printing the holders.
BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)	305124	For experimentally-induced wounds to the globes
CellMask DeepRed	Invitrogen (Carlsbad, CA)	C10046	Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Complete Home Super Glue	Walgreens (Deerfield, IL)	N/A	For attaching the holder to the imaging well
Ender 3 Pro 3D printer	Creality (Shenzen, China)	N/A	For printing the holder
FIJI/ImageJ	ImageJ (Bethesda, MD)	License Number: GPL2	Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis
Fluo-4	Invitrogen (Carlsbad, CA)	F14201	Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Keratinocyte Serum-Free Medium	Gibco (Waltham, MA)	17005042	25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium
Phophate-Buffered Saline (PBS)	Corning, Medlabtech (Manassas, VA)	21-040-CV	Used to wash excess stain off of corneas before imaging
Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan	Zeiss (Thornwood, NY)	N/A	20x magnification objective was used