JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, kemirgen veya insan yağ dokusundan izole edilen mikrovasküler fragmanların işlevsel, vaskülarize bej yağ dokusunun mühendisliğine basit bir yaklaşım olarak kullanımını özetleyen ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

Mühendislik termojenik yağ dokusu (örneğin, bej veya kahverengi yağ dokuları), metabolik hastalıklar için potansiyel bir tedavi olarak veya sağlık taraması ve ilaç testi için kişiselleştirilmiş mikrodokuların tasarımı için araştırılmıştır. Mevcut stratejiler genellikle oldukça karmaşıktır ve termojenik yağ dokusunun çok hücreli ve fonksiyonel özelliklerini tam olarak tam olarak tasvir edememektedir. Yağ dokusundan izole edilen arteriol, venüller ve kılcal damarlardan oluşan küçük bozulmamış mikrodamarlar olan mikrovasküler fragmanlar, vaskülarizasyon ve yağ dokusu oluşumunu sağlayan tek bir otolog hücre kaynağı olarak işlev görür. Bu makalede, mikrovasküler fragmanların yağ dokusu ve kültür koşullarından izole edilmesine yönelik protokoller de dahil olmak üzere, mikrovasküler fragmanlardan üç boyutlu, vaskülarize ve fonksiyonel termojenik yağ dokularının üretilmesini sağlamak için kültür koşullarını optimize etme yöntemleri açıklanmaktadır. Ek olarak, mühendislik dokularını karakterize etme teknikleri gibi en iyi uygulamalar tartışılmakta ve hem kemirgen hem de insan mikrovasküler fragmanlarından numune sonuçları sağlanmaktadır. Bu yaklaşım, obezite ve metabolik hastalıklara yönelik tedavilerin anlaşılması ve geliştirilmesi için kullanılma potansiyeline sahiptir.

Giriş

Bu protokolün amacı, potansiyel olarak otolog tek bir kaynaktan, mikrovasküler fragmandan (MVF) vaskülarize bej yağ dokusu geliştirmek için bir yaklaşımı tanımlamaktır. Kahverengi ve bej yağ dokularının metabolik regülasyon ile ilgili faydalı özellikler gösterdiği gösterilmiştir; Bununla birlikte, yetişkinlerde bu yağ dokusu depolarının küçük hacmi, özellikle obezite veya tip 2 diyabet 1,2,3,4,5,6,7 gibi hastalıklı durumlarda, sistemik metabolizma üzerindeki potansiyel etkiyi sınırlar. Obezite ve komorbiditeleri ile bağlantılı zararlı metabolik etkilerin önlenmesinde terapötik bir hedef olarak kahverengi / bej yağa önemli bir ilgi vardır 8,9,10,11,12.

MVF'ler, yağ dokusundan doğrudan izole edilebilen, kültürlenebilen ve uzun süre üç boyutlu bir konfigürasyonda tutulabilen damar yapılarıdır13,14,15. Grubumuzun ve diğerlerinin önceki çalışmaları, MVF'lerin çok hücreli ve çok güçlü kapasitesini, özellikle yağ dokusu oluşumu16,17,18 ile ilgili olarak kullanmaya başlamıştır. Bu çalışmanın bir birikimi olarak, yakın zamanda sağlıklı ve tip 2 diyabet19'un kemirgen modellerinden ve insan deneklerden (50 yaşın üzerindeki yetişkinler)20 türetilen MVF'lerin, termojenik veya bej yağ dokusu oluşturmak için indüklenebilen hücreler içerdiğini gösterdik.

Burada, sadece bej yağ dokusu oluşturmakla kalmayıp aynı zamanda ilişkili ve kritik vasküler bileşenini de oluşturabilen tek bir kaynak MVF'nin kullanıldığı yenilikçi bir yaklaşımbulunmaktadır 21. Bu tekniğin kullanımı, termojenik yağ dokusu oluşumu için basit bir doku mühendisliği yaklaşımı arayan çalışmalar için büyük değer taşıyabilir. Bej yağ dokusu 22,23,24,25,26,27,28'in mühendisliğini amaçlayan diğer yöntemlerin aksine, bu çalışmada açıklanan süreç çoklu hücre tiplerinin veya karmaşık indüksiyon rejimlerinin kullanılmasını gerektirmez. Kemirgen ve insan kaynaklarından kaynaklanan MVF'ler ile vaskülarize bej ve beyaz yağ modelleri oluşturulabilir ve bu da büyük çeviri potansiyeli gösterir. Bu protokolün son ürünü, kahverengi yağ dokusu ile karşılaştırılabilir bir yapıya ve metabolik fonksiyona sahip, tasarlanmış bir bej termojenik yağ dokusudur. Genel olarak, bu protokol, kolayca erişilebilen ve muhtemelen otolog bir kaynak MVF'nin metabolik bozuklukları incelemek için değerli bir terapötik müdahale ve araç olabileceği fikrini sunmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışma, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ilkelerine uygun olarak Hayvan Refahı Yasası ve Hayvan Refahı Yönetmeliğinin Uygulanmasına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan prosedürleri, San Antonio'daki Teksas Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

NOT: Aşağıda açıklanan adımlar için erkek Lewis Sıçanları kullanılmıştır. Bir dişi için hafif protokol ayarlamaları yapılmalı ve fare mikrovasküler fragmanı (MVF) koleksiyonu29. İnsan MVF'lerini (h-MVF'ler) kullanan protokoller için gereken tek adım, üreticinin protokolünü takiben h-MVF'lerin yeniden askıya alınması, büyüme ortamı hazırlığı (1.3), fibrin hidrojellerin oluşumu (5) ve kültürlemedir (6). Protokole genel bir bakış için lütfen Şekil 1'e bakın.

figure-protocol-970
Şekil 1: Deneysel taslak. MVF kullanılarak termojenik yağ dokusunun oluşumu için analizden önce altı temel adımın parçalanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. Reaktif hazırlama

NOT: Aşağıdaki reaktifler, bir biyobaşlık içinde tartılmış ve yapılmış bir sıçana karşılık gelir.

  1. PBS'de sığır serum albümini (BSA) hazırlayın.
    1. PBS'de 10 mg/mL (%1.0) BSA'yı yıkama adımları (1 mg/mL, %0.1) ve sindirim (4 mg/mL, %0.4) için seyreltilmek üzere hazırlayın.
    2. Adım 1.1.1'de belirtildiği gibi, 1.1.3-1.1.5 adımlarını izleyerek farklı BSA konsantrasyonları hazırlayın.
    3. PBS'de 10 mg/mL BSA (PBS'de %1 BSA)
      1. 50 mL'lik bir konik tüpe 500 mg BSA ve 500 mL PBS ekleyin ve BSA'yı çözmek için çözeltiyi vorteks.
      2. Aşırı kabarcıklar oluşursa, çözeltiyi 2 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj edin. Filtre: çözeltiyi 0,22 μm naylon net filtre ile sterilize edin.
    4. PBS'de 1 mg/mL BSA (PBS'de %0.1 BSA)
      1. PBS'de 15 mL 10 mg/mL BSA'yı 500 mL'lik steril bir şişede 135 mL PBS'ye ekleyerek PBS ile PBS 1:10'da 15 mL 10 mg/mL BSA'yı seyreltin ve homojen bir karışım elde etmek için şişeyi hafifçe çalkalayın.
    5. PBS'de 4 mg/mL BSA (PBS'de %0.4 BSA)
      1. PBS'de 35 mL 10 mg/mL BSA + 100 mL steril şişede 57,5 mL PBS ekleyerek PBS ile 35 mL 10 mg/mL BSA seyreltin ve homojen bir karışım elde etmek için şişeyi hafifçe çalkalayın.
  2. Kıyılmış yağ yastıklarının sindirimi için BSA'da kollajenaz hazırlayın.
    1. 6 mg/mL kollajenaz hazırlayın.
      1. 50 mL'lik bir konik tüpte, 72 mg kollajenaz ağırlığında ("Epi için" etiketi).
      2. Üç adet 50 mL konik tüpte, her biri 144 mg kollajenaz ("Ing 1 için", "Ing 2 için" ve "SubQ için" etiketi) ağırlığındadır.
      3. Tartılmış kollajenazı kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
        NOT: Sindirimden hemen öncesine kadar BSA/PBS eklemeyin.
      4. 72 mg kollajenaz içeren tüpe PBS'de 12 mL 4 mg / mL BSA ekleyin.
      5. 144 mg kollajenaz içeren tüplere PBS'de 24 mL 4 mg/mL BSA ekleyin.
      6. Homojen bir çözelti elde etmek için tüpleri çalkalayın ve filtreyi 0,22 μm naylon net filtre ile sterilize edin.
  3. İzole MVF'yi beslemek / ayırt etmek için Aminokaproik Asit (ACA) ile desteklenmiş büyüme ortamı hazırlayın.
    1. Büyüme ortamı (GM): DMEM'i% 20 FBS,% 1 penisilin-streptomisin (kalem strep),% 0.2 mikoplazma profilaktiği ve 1 mg / mL ACA ile destekleyin.
    2. Beyaz adipojenik ortam (WAM) hazırlayın.
      1. WAM indüksiyonu:% 20 FBS,% 1 kalem strep,% 0.2 mikoplazma profilaktiği, 10 μg / mL insülin, 10 μm forskolin, 1 μm deksametazon ve 1 mg / mL ACA ile DMEM / F12 takviyesi.
        NOT: h-MVF'ler için, ek olarak, 125 μM indometasin ekleyin.
      2. WAM bakımı:% 20 FBS,% 1 kalem strep,% 0.2 mikoplazma profilaktiği, 5 μg / mL insülin ve 1 mg / mL ACA ile DMEM / F12 takviyesi.
        NOT: h-MVF'ler için, insülin konsantrasyonunu 10 μg / mL olarak değiştirin.
    3. Bej adipojenik ortam (BAM) hazırlayın.
      1. BAM indüksiyonu:% 20 FBS,% 1 kalem strep,% 0.2 mikoplazma profilaktiği,% 10 μg / mL insülin, 10 μm forskolin, 1 μm deksametazon, 1 μm rosiglitazon, 20 nM 3,3′,5-Triiodo-L-tironin (T3) ve 1 mg / mL ACA ile DMEM / F12 takviyesi.
        NOT: h-MVF'ler için, T3 konsantrasyonunu 120 nM olarak değiştirin.
      2. BAM bakımı:% 20 FBS,% 1 kalem strep,% 0.2 mikoplazma profilaktiği,% 5 μg / ml insülin, 10 μm forskolin, 1 μm rosiglitazon, 20 nM T3 ve 1 mg / mL ACA ile DMEM / F12 takviyesi.
        NOT: h-MVF'ler için, insülin konsantrasyonunu 10 μg / mL ve T3 konsantrasyonunu 120 nM olarak değiştirin.
  4. Pıhtılaşma maddesinin fibrin jellerde kullanılmasını sağlamak için trombin hazırlayın (sadece stok aliquoted çözeltisi mevcut değilse yapılması gerekir).
    1. ddH2O'da 10 U/mL trombin:
      1. Üreticiden şişede 1-5 mL ddH2O kullanarak trombin tozunu tekrar askıya alın ve resüspansiyonu 250 mL'lik bir behere aktarın.
      2. Çözeltiyi 100 mL'ye getirin ve homojen bir karışım elde etmek için çözeltiyi birçok kez yukarı ve aşağı pipetin. Çözeltiyi 15 mL konik tüplere (~ 10 mL / tüp) aliquot edin ve aliquotları -20 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.
        NOT: Kullanmak için, trombini oda sıcaklığında (RT) çözün.

2. Alet / malzeme hazırlama

NOT: Tüm enstrümantasyon kullanımdan önce otoklavlanmalı/sterilize edilmelidir.

  1. Epididim/inguinal/subkutan yağ izolasyonu (tanımlanmış bir cerrahi alanda yapılacak cerrahi)
    1. PBS'de tek kullanımlık alt pedlerin, iki makasın, bir hemostatın (isteğe bağlı), iki forsepsin ve 10-15 mL'lik 1 mg / mL BSA'ya (% 0.1) sahip dört adet 50 mL konik tüpün mevcudiyetini sağlayın.
  2. Mikrovasküler fragman izolasyonu
    1. Kıyma için (bir biyobaşlıkta yapılacak), üç kaplamasız steril 100 mm Petri kabının, bir çift forsepsin ve bir çift kavisli makasın bulunduğundan emin olun.
    2. Sindirim ve izolasyon için (bir biyobaşlıkta yapılacak), bir çift makas, bir çift forseps, sekiz kaplanmamış steril 100 mm Petri kabı, üç kaplanmamış steril 35 mm Petri kabı, kollajenaz tartılmış ve 4 ° C'de, dört adet 250 mL şişenin, merkezinde delikli bir plastik tutucunun, dört adet 500 μM elek (yuvarlak karelerde 3'e bölünmüş) bulunduğundan emin olun, dört adet 37 μM elek (yuvarlak kareler halinde 3 adet kesilmiş) ve 11 adet 50 mL konik tüp.
  3. Fibrin resüspansiyonu
    1. Fibrin hidrojeller için (bir biyobaşlıkta yapılacak), fibrinojen, trombin ve büyüme ortamının (reaktif hazırlama sırasında yapılan) mevcut olduğundan emin olun.

3. Yağ izolasyon protokolü

  1. Ön adımlar
    1. Cerrahi aletleri kullanmadan önce yıkamak ve sterilize etmek için bir kabı etanol ile doldurun. Daha sonra, masayı sıçanı işlemek için hazırlayın ve tıraş adımı sırasında üretilen kürkü aspire etmeye hazır bir vakuma sahip olun.
    2. Her biri 10 mL 1 mg/mL BSA içeren önceden hazırlanmış 50 mL konik tüplerin yerleştirileceği buzlu bir kova hazırlayın. Tüpleri uygun şekilde etiketleyin.
      NOT: Kasık yağı için iki ayrı konik tüpe sahip olmak gerekebilir, çünkü iki tarafın çıkarılması gerekir ve bu bölgeden toplanan yağ miktarı epididim ve posterior subkutan ile karşılaştırıldığında en büyük olma eğilimindedir.
    3. Gerekli cerrahi aletlerle tanımlanmış cerrahi alanda ötenazi bir sıçan ile başlayın. Genel olarak, CO2 , IACUC protokollerini takip eden sıçanları ötenazi yapmak için kullanılır.
    4. Saç kesme makinelerini kullanarak, fareyi ilgi alanının etrafında tıraş edin. Spesifik olarak, epididim ve inguinal yağ izolasyonu için kasıklar ve karın yarısı arasında tıraş edin (bu bölgedeki kürk için daha küçük tıraş makinesini kullanın). Skapula arasında bulunan posterior deri altı yağını elde etmek için tüm sırtı tıraş edin (kürk sıçanın arka tarafında daha kalın olduğu için daha büyük bir tıraş makinesi kullanmak en iyisidir).
    5. Aseptik olarak% 70 etanol ile sıçan püskürterek sıçanı hazırlayın. Genel olarak, kesilecek alanın iki kez temizlenmesi önerilir.
  2. Farklı yağ depolarının izolasyonu
    1. Kasık (deri altı)
      1. Sırtüstü pozisyonda, cildi penisin altına bir çift makasla kaldırın. Kesiye makasla başlayın, merkezden başlayıp yanal olarak kesin, bir "V" şekli oluşturun ve tüm yağ deposuna erişmek için sıçanın arka tarafına ilmek atın. Aşağıdaki yağın bozulmaması için yüzeysel olarak kesmeyi unutmayın. Kesme adımında birbirine bağlı fasya dokusunu keserek cildin yağdan ayrılmasını sağlayın (Şekil 2A).
      2. Fasya uygun şekilde kesildikten sonra, kasık yağının iki tarafının görünür olduğundan emin olun (kasık yağı kasık bölgesinden arkaya doğru uzanır). Daha sonra, 10 mL 1 mg / mL BSA içeren iki ayrı konik tüpte iki taraftan yağı çıkarın (Şekil 2B).
    2. Epididim (viseral)
      1. Karın derisini keserek ve testisleri çevreleyen ince tabakadan dikkatlice geçerek epididim yağını toplayın (Şekil 2C).
      2. Forseps ile, yağ dokusunu yavaşça dışarı çekin ve makas kullanarak kesin. Herhangi bir önemli görünür kan damarını diseksiyondan kaçının (testis ve epididimis hasat edilirse, biyobaşlıktaki temizleme adımı sırasında bunları çıkarın).
      3. Çıkarılan yağı, PBS'de 10 mL 1 mg / mL BSA ile 50 mL'lik bir konik tüpe dikkatlice yerleştirin.
        NOT: Epididim yağının çıkarılması kasık yağı alındıktan sonra yapılmalıdır. Epididim yağı genellikle hacim olarak daha küçüktür ve kasık yağının altında, testis ve epididimiyi çevreleyen karın derisinin altında bulunur.
    3. Posterior subkutan
      1. Sıçan eğilimini (sırt tarafı yukarı) çevirin ve büyük makas kullanarak, sırtın derisini (bu bölgedeki cilt kalındır) kafa derisine kadar kesin, cildin hemen altında çok derin kesmemeye dikkat edin (Şekil 2D).
      2. Cildi dokuya bağlayan fasyayı kesin; Yağ interskapuler bölgede bulunur. Subkutan yağı kahverengi yağdan ayırt etmek / ayırmak için not alın. Kahverengi yağ omurgaya daha yakındır (Şekil 2E).
      3. PBS'de 10 mL 1 mg / mL BSA ile karşılık gelen 50 mL konik tüp (ler) e yağı izole edin ve yerleştirin.

figure-protocol-10890
Şekil 2: Farklı yağ dokusu depolarının izolasyonu . (A) Kasık yağ dokusunun eksizyonu için gerekli olan ilk insizyonlar. (B) Kasık yağ deposunun yeri. (C) Epididim yağ deposunun yeri, erişim için gerekli olan dış derinin insizyonunu not etmek. (D) Fareler yerleştirildikten sonra ek yağa erişmeye eğilimli ek insizyonlar gereklidir. (E) Posterior subkutan yağ deposunun yeri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Mikrovasküler fragman izolasyon protokolü

  1. Sıçandan eksize edilmiş yağ içeren 50 mL konik tüp (ler) i biyokaputa yerleştirin.
  2. Forseps kullanarak, yağı standart bir 100 mm Petri kabına yerleştirin (dokuyu nemli tutmak için PBS'de ~ 0.5 mL 1 mg / mL BSA ile).
  3. Görünür kan damarlarını ve kas / yabancı dokuları yağdan temizleyin ve çıkarın.
  4. Yağı ~ 10 dakika boyunca makasla kıyın (10 mL pipetle aktarılabilecek kadar kıyın).
  5. PBS'de ~ 0.5 mL 1 mg / mL BSA ekleyerek topakları kontrol edin; gerekirse kıymaya devam edin.
  6. Kıyılmış yağı 10 mL pipet ile steril 250 mL'lik bir şişeye aktarın.
    NOT: Pipet kullanarak hacme dikkat edin.
  7. Yeterli BSA (1 mg / mL) ekleyin, böylece son hacim 20 mL'dir.
  8. PBS'de kollajenaza 4 mg / mL BSA ekleyin (kollajenaz nihai konsantrasyonu: 6 mg / mL) (yani, 72 mg kollajenaz için 12 mL veya 144 mg kollajenaz için 24 mL).
    NOT: Zamana duyarlı olduğundan kıyma işlemi tamamlanana kadar eklemeyin.
  9. Homojen bir çözelti sağlamak için konik tüpü yavaşça çalkalayın ve filtreyi 0,22 μm naylon net filtre ile sterilize edin.
  10. Epididim yağı için, ~ 8-10 dakika sindirin; Kasık ve arka deri altı yağları için, 37 ° C'lik bir su banyosunda ~ 15-20 dakika sindirin, şişeyi dairesel bir hareketle sallayın (yağın sadece birkaç kümenin kaldığı yere ulaştığı anda durun).
  11. Sindirilen yağı 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın (~ 30 mL / tüp olmalıdır) ve tüpü "sindirilmiş yağ" olarak etiketleyin.
  12. Tüpü 4 dakika boyunca 400 x g'de döndürün; eğirme sonrası pelet kırmızı olmalıdır (Şekil 3A).
  13. Döndürme sırasında, steril 37 μM elek ve 500 μM elekleri, kullanımdan önce ön ıslatmak için PBS'de 5 mL 1 mg / mL BSA içeren steril bir Petri kabına yerleştirin.
  14. Dönüşten sonra, süpernatantı "atık" olarak etiketlenmiş 50 mL'lik bir konik tüpe boşaltın. Yüzeysel yağları çıkarmak ve MVF'lerden yapılmış peleti rahatsız etmemek için dekantasyonu yavaşça yapın.
  15. Pelet ("sindirilmiş yağ") içeren tüpe PBS'de 10 mL 1 mg/mL BSA ekleyin. Pelet 2x'i tritüre edin (yukarı ve aşağı borulayın).
  16. Parçaları bozmamak için pelet üzerinde çok sert olmaktan kaçının.
  17. 500 μM ekranı, plastik ekran tutucunun üzerindeki yeni bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 3B).
  18. "Sindirilmiş pelet" tüpünden 10 mL'lik pipet, eşmerkezli daireler kullanarak 500 μM'lik bir ekran üzerinde (Şekil 3C).
  19. Filtreyi PBS'de ilave 5 mL 1 mg/mL BSA ile yıkayın. İstenilen hücreler Petri kabına filtrelenecektir; bu nedenle, 500 μM ekranı atın, ancak filtrelenmiş sıvıyı Petri kabının içine kaydedin.
  20. 37 μM ekranı, plastik ekran tutucunun üzerindeki yeni bir Petri kabına yerleştirin.
  21. 37 μM ekranı kullanmadan önce herhangi bir kümelenmeyi ortadan kaldırmak için pipeti değiştirin.
  22. İlk filtrasyondan elde edilen sıvıyı 37 μM ekran üzerinden eşmerkezli daireler kullanarak pipetleyin.
  23. Filtreyi PBS'de ilave 5 mL 1 mg/mL BSA ile yıkayın. İstenilen hücreler filtrede kalacaktır, bu nedenle filtrelenmiş sıvıyı atın, ancak 37 μM ekranı kaydedin.
  24. 37 μM ekranı PBS'de 5 mL 1 mg/mL BSA içeren yeni bir Petri kabına kaydırın.
  25. Parçaları yerinden çıkarmak için konik bir tutucuya dokunarak çanağı sallayın. Çok kuvvetli bir şekilde sallamayın, çünkü sıvı / hücreler Petri kabından dökülebilir.
  26. Filtreyi PBS'de ilave 5 mL 1 mg/mL BSA ile durulayın. İstenilen hücreler Petri kabında sıvı çözelti içinde kalacaktır. Aşağıdaki adımlar için 37 μM ekranı ve Petri kabının içindeki sıvıyı içeren yerinden çıkmış parçayı kaydedin.
  27. Sıvı içeren BSA + parçasını steril bir 50 mL konik tüpe aktarın.
  28. 37 μM ekranın durulanmasını birkaç kez daha tekrarlayın (her seferinde PBS'de ~5 mL 1 mg/mL BSA ile) ve konik tüpe ekleyin. Toplanan toplam hacim ~ 15-20 mL olana kadar tekrarlayın. Sonuçta, istenen hücreler Petri kabındaki sıvı çözeltiden toplanacak ve konik bir tüpe yerleştirilecektir; Bu noktada, son durulamadan sonra 37 μM ekranı atın, ancak 50 mL konik tüpün içinde sıvı içeren yerinden çıkmış parçaları saklayın.
  29. Makas kullanarak 200 μL pipet ucunun ucunu klipsleyin. 50 mL'lik tüpü yavaşça çalkalayın, 20 μL'lik iki numuneyi çıkarın ve temiz bir 35 mm Petri kabına koyun.
  30. İzole edilen toplam MVF sayısını elde etmek için Petri kabındaki her numunedeki parça sayısını sayın.
    Toplam Parça Sayısı = figure-protocol-16235
  31. MVF'yi toplamak için 50 mL'lik bir konik tüpte sıvı içeren kalan yerinden çıkmış parçayı 4 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.

figure-protocol-16547
Şekil 3: MVF'lerin izolasyonu. (A) Yağ dokusunun sindiriminden sonra, bir spin-down'u takiben pelet ve süpernatant içeren MVF'lerin ayrılmasının tasviri. (B) MVF'lerin filtrelenmesi ve tuzaklanması için sarf malzemelerinin yerleşimi. (C) Filtreleme/yıkama adımları için eşmerkezli daire yönteminin gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

5. Fibrin hidrojellerin oluşumu

  1. Örnek hesaplamalar:
    NOT: Aşağıda, ~ 15.000-20.000 MVF / mL'de tohumlanan MVF'ler ve 2: 5'te fibrinojen: trombin jel oranı, 20 mg / mL konsantrasyonda kullanılan fibrinojen ile yapılan hesaplamalar verilmiştir.
    1. Beş adet 250 μL jel yapmak için toplam 1.250 μL hacim gereklidir. Pipetleme hatalarını her zaman hesaba katın, bu nedenle 1,5 mL jel için yeterli miktarda yapın.
      1. Gerekli fibrinojen hacmini aşağıdaki gibi hesaplayın:
        figure-protocol-17739, X1 = 428.57 μL fibrinojen
      2. Gerekli trombin hacmini aşağıdaki gibi hesaplayın:
        figure-protocol-17932, X2 = 1.071,43 μL trombin
      3. Gerekli 428.57 μL hacim için, aşağıdaki gibi 500 μL fibrinojen yapın:
        20 mg/mL * 0.5 mL = 10 mg fibrinojen. Bunu 500 μL DMEM'de yeniden askıya alın
      4. Her jeli elde etmek için, fibrinojen ve trombin hacmini aşağıdaki gibi hesaplayın:
        1. Fibrinojen:
          figure-protocol-18338, X1 = 71.43 μL fibrinojen (DMEM cinsinden) + MVF
        2. Trombin:
          figure-protocol-18512, X2 = 178.57 μL trombin
  2. MVF fibrin jel döküm
    1. 50 mL konik tüpteki bükülmüş parçadaki sıvının çoğunu boşaltın. Konik tüpün kenarına takılan az miktarda sıvıyı çıkarmak için bir pipet kullanın.
    2. Jellerin yapılacağı kuyucuklara trombin ekleyin (Şekil 4A).
    3. 200 μL'lik bir pipet ucunun ucunu kırpın ve jelde bir kez ~15.000-20.000 MVF/mL'lik bir nihai yoğunluk elde etmek için fibrinojen kullanarak MVF'leri nazikçe askıya alın.
    4. 200 μL pipet ucunun ucunu ve MVF+Fibrinojen pipetinin ucunu trombin çözeltisine nazikçe kırpın. Homojen bir karışım elde etmek için hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı borulayın. Tüm jeller yapılana kadar tekrarlayın (Şekil 4B).
    5. Jel çapraz bağlanmasına izin vermek için kuyu plakalarını ~ 15 dakika boyunca bir inkübatöre (37 ° C,% 5 CO2) yerleştirin (Şekil 4C).
    6. Her bir kuyucuğa 100-150 μL büyüme ortamı ekleyin.

figure-protocol-19747
Şekil 4: MVF fibrin jellerinin oluşumu . (A) 5/7 parçalı trombin karışımı ilgili kuyucuğa pipetlenir. (B) Daha sonra, kırpılmış bir pipet ucu ile (MVF'leri rahatsız etmemek için), 2/7 parçalı bir fibrinojen + MVF karışımı kuyucuğa pipetlenir ve yavaşça karıştırılır. (C) Son olarak, tamamlanan tüm jeller 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirilir ve ortam üstüne yerleştirilmeden önce hidrojelin tamamen katılaşmasını sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. MVF'lerin kültürleme koşulları

  1. Vaskülarize olmayan beyaz ve bej yağ dokusunu (+ GM Kontrolü) kültürlemek için, Şekil 5'te gösterilen19 zaman çizelgesini kullanın.
  2. Vaskülarize beyaz ve bej yağ dokusunun (+ GM Kontrolü) kültürlenmesi için, Şekil 6'da gösterilen19 zaman çizelgesini kullanın.
  3. Hidrojeller, çalışma için kültür süresi boyunca bir inkübatörde (37 ° C,% 5 CO2) muhafaza edilmeli ve ortam her geçen gün değiştirilmelidir. Analiz için numunelerin sabitlenmesi ve işlenmesi için, daha önce yayınlanmış çalışmalarabakın 16,19,20.

figure-protocol-21424
Şekil 5: Vaskülarize olmayan yağ dokusu oluşumu için zamanlama. Bu rakam Acosta ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-21930
Şekil 6: Vaskülarize yağ dokusu oluşumunun zamanlaması. Bu rakam Acosta ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bej / kahverengi yağ dokusunun birkaç önemli fenotipik morfolojik özelliği vardır: multilokülerdir / küçük lipit damlacıkları içerir, çok sayıda mitokondriye sahiptir (karakteristik olarak "kahverengimsi" görünümünün nedeni in vivo), buna bağlı olarak yüksek oksijen tüketim oranına / mitokondriyal biyoenerjetik özelliklere sahiptir, yüksek vaskülarize olmuş, lipoliz / insülin ile uyarılmış glikoz alımını arttırmıştır ve en ünlüsü, termojenik solunumda rol oynayan mitok...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kahverengi/bej yağ dokusu mühendisliği alanı büyük ölçüde olgunlaşmamış 22,23,24,25,26,27,28 olup, beyaz yağ dokusu için yağ modellerinin büyük kısmıgeliştirilmektedir 8,22,31. M...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.

Teşekkürler

Dr. Acosta, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından CA148724 ve TL1TR002647 hibeleri ile desteklenmektedir. Dr. Gonzalez Porras, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü tarafından F32-0DK122754 Ödül Numarası altında desteklenmektedir. Bu çalışma, kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüleri (5SC1DK122578) ve San Antonio'daki Teksas Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Rakamlar kısmen Biorender.com ile oluşturulmuştur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Aminocaproic AcidSigma AldrichA2504-100GAdded in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped ScissorsFisher scientific12-000-172Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA)Millipore126575-10GMDiluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1Fisher scientificNC9633623Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
DexamethasoneThermo ScientificAC230302500Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpadsFisher scientific23-666-062For fluid absorption during surgery
Dissecting ScissorsFisher scientific08-951-5Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)Fisher scientific11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)Sigma AldrichD8062
Fetal Bovine Serum Fisher scientific16140089Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen Sigma AldrichF8630-25GSolubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mLFisher scientificFB500250Allows for digestion of fat using a large surface area
ForcepsFisher scientific50-264-21Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
ForskolinSigma AldrichF6886Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVFAdvanced Solutions Life Scienes, LLChttps://www.advancedsolutions.com/microvesselsHuman MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. 
Indomethacine Sigma AldrichI7378Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreasSigma AldrichI5523Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZapFisher scientificNC9023832Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic 
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)Fisher scientific15140122Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).Fisher scientific3510293 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).Fisher scientific50-202-036For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS)Fisher scientific14-190-250Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)Fisher scientificNC0854141
RosiglitazoneFisher scientificR0106200MGDiluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
ScissorsFine Science Tools14059-111 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM Carolina Biological Supply Company652222RCut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM Carolina Biological Supply Company652222FCut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated HemostatFisher scientific12-000-171Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm MilliporeSE1M179M6
ThrombinFisher scientific6051601KUDiluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3)Sigma AldrichT2877Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male Charles Riverhttps://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.

Referanslar

  1. Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
  2. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  3. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).
  4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).
  5. Kim, S. H., Plutzky, J. Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders. Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).
  6. Lizcano, F., Vargas, D. Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity. International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061(2016).
  7. Mulya, A., Kirwan, J. P. Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).
  8. Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease. BMC Biomedical Engineering. 1, 27(2019).
  9. Srivastava, S., Veech, R. L. Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight. Frontiers in Physiology. 10, 38(2019).
  10. Samuelson, I., Vidal-Puig, A. Studying brown adipose tissue in a human in vitro context. Frontiers in Endocrinology. 11, 629(2020).
  11. Wang, C. -H., et al. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  12. Kaisanlahti, A., Glumoff, T. Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes. Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).
  13. Sato, N., et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells. Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).
  14. Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. Microvascular fragments: More than just natural vascularization units. Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).
  15. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).
  16. Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments. Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).
  17. Acosta, F. M., et al. Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle. Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).
  18. Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments. Biofabrication. 13 (3), 035022(2021).
  19. Acosta, F. M., et al. Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions. Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337(2022).
  20. Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Engineering human beige adipose tissue. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395(2022).
  21. Herold, J., Kalucka, J. Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells. Frontiers in Physiology. 11, 1861(2021).
  22. McCarthy, M., et al. Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).
  23. Klingelhutz, A. J., et al. Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery. Scientific Reports. 8 (1), 523(2018).
  24. Yang, J. P., et al. Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells. Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).
  25. Vaicik, M. K., et al. Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue. Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).
  26. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).
  27. Tharp, K. M., et al. Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue. Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).
  28. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
  29. Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).
  30. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  31. Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells. Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).
  32. Dani, V., Yao, X., Dani, C. Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).
  33. Xu, X., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration. Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).
  34. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).
  35. Gealekman, O., et al. Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity. Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).
  36. Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation. Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).
  37. Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner. Biomaterials. 119, 23-32 (2017).
  38. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).
  39. Später, T., et al. Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).
  40. Später, T., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687(2021).
  41. Laschke, M. W., Menger, M. D. The simpler, the better: tissue vascularization using the body's own resources. Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).
  42. Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model. Bioengineering. 7 (3), 114(2020).
  43. Pilkington, A. -C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview. Frontiers in Endocrinology. 12, 599134(2021).
  44. Chiou, G., et al. Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geri ekmeSay 192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır