Moss Physcomitrium patens'te Calcofluor Kullanarak Hücre Duvarı Dinamiğinin 3-D Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Özet

Bu makale, canlı yosun dokusunun 3 boyutlu hücre duvarı dinamiklerini görüntülemek için ayrıntılı bir protokol sunarak, ggb mutantlarında hücre duvarlarının ayrılmasının görselleştirilmesine ve uzun bir süre boyunca gelişim sırasında vahşi tipte hücre duvarı desenlerinin kalınlaştırılmasına izin vermektedir.

Özet

Floresan mikroskobu ile hızlandırılmış görüntüleme, hücresel ve hücre altı seviyelerde büyüme ve gelişmenin dinamik değişikliklerinin gözlemlenmesini sağlar. Genel olarak, uzun bir süre boyunca gözlemler için, teknik bir floresan proteininin dönüşümünü gerektirir; Bununla birlikte, çoğu sistem için genetik dönüşüm ya zaman alıcıdır ya da teknik olarak kullanılamaz. Bu makale, yosun Physcomitrium patens'te geliştirilen calcofluor boyası (bitki hücre duvarındaki selülozu boyayan) kullanılarak 3 günlük bir süre boyunca hücre duvarı dinamiklerinin 3 boyutlu hızlandırılmış görüntülenmesi için bir protokol sunmaktadır. Hücre duvarından gelen kalkoflor boya sinyali stabildir ve belirgin bir çürüme olmadan 1 hafta sürebilir. Bu yöntem kullanılarak, ggb mutantlarındaki hücrelerin ayrılmasının (protein geranilgeraniltransferaz-I beta alt biriminin nakavt edildiği) düzenlenmemiş hücre genişlemesi ve hücre duvarı bütünlüğü kusurlarından kaynaklandığı gösterilmiştir. Ayrıca, kalkoflor boyama kalıpları zamanla değişir; daha az yoğun boyanmış bölgeler, vahşi tipteki gelecekteki hücre genişlemesi / dallanma bölgeleri ile ilişkilidir. Bu yöntem, hücre duvarları içeren ve kalkoflor tarafından boyanabilen diğer birçok sisteme uygulanabilir.

Giriş

Bitki hücre duvarları, hücre genişlemesi ve gelişimi sırasında dinamik değişikliklere uğrar ^1,2,3. Hücre duvarı bütünlüğünün korunması, büyüme ve gelişme sırasında bitki hücresi yapışması ve çevresel sinyallere verilen yanıt için kritik öneme sahiptir. Canlı hücrelerin hücre duvarı dinamiklerini uzun bir süre boyunca görselleştirmek, gelişim sırasında hücre yapışmasının nasıl korunduğunu ve çevresel değişikliklere adaptasyonun nasıl korunduğunu anlamak için kritik öneme sahip olsa da, hücre duvarı dinamiklerini doğrudan gözlemlemek için mevcut yöntemler hala zordur.

Hücresel değişikliklerin hızlandırılmış görüntülemesi, yüksek çözünürlüklü bir floresan mikroskobu 4,5,6,7 kullanarak bir organizmanın bilgilendirici gelişimsel dinamiklerini sağlayabilir. Hızlandırılmış 3-D görüntüleme, büyüme ve gelişme sırasında hücre şeklindeki dinamik değişiklikleri incelemek için büyük bir potansiyele sahip olsa da, teknik normalde bir floresan proteininin ^4,5,6,7 dönüşümünü gerektirir. Bununla birlikte, çoğu sistem için genetik dönüşümler ya zaman alıcı ya da teknik olarak zordur. Alternatif olarak, hücresel bileşenlere bağlanan floresan boyalar uzun zamandır mevcuttur. Floresan boyalar, belirli bir dalga boyundaki ışıkla ışınlamadan sonra floresan ışık yayabilir. Yaygın örnekler Edu, DAPI, PI, FM4-64 ve calcofluor white ^8,9,10'dur. Bununla birlikte, önemli bir dezavantaj, bu boyaların tipik olarak yalnızca sabit dokuda veya kısa deneylerde, kısmen ^8,9,10 hücresine verdikleri zarar nedeniyle kullanılabilmesidir.

Burada sunulan protokolle, yosun P. patenlerindeki hızlandırılmış deneyler sırasında calcofluor beyazı ortam içinde karıştırıldığında calcofluor sinyalleri kararlıdır. Bu yöntem kullanılarak, ggb mutantlarındaki hücrelerin 3 günlük bir süre boyunca 3 günlük^{bir süre boyunca} 3 hızlandırılmış görüntüleme kullanılarak ayrılması gözlendi (Şekil 1). Bu yöntem, hücre duvarları içeren ve kalkoflor tarafından boyanabilen diğer birçok sisteme uygulanabilir.

Protokol

NOT: Malzeme ve ekipman listesi için Malzeme Tablosuna ve bu protokolde kullanılacak çözümlerin listesi için Tablo 1'e bakınız.

1. Cam tabanlı tabaklar için bitkilerin hazırlanması

1. BCDAT agar ortamındaki yosun protonemal dokusunu, büyüme odasında ²⁵° C'de 7 gün boyunca sabit beyaz ışık altında (~ 50 μmol ^{m-2 s-1) 13} cm'lik bir Petri kabında büyütün.
2. Kalkoflor beyazını filtreleyerek sterilize edin ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Reaktif birkaç ay boyunca stabildir.
3. 7 günlük yosun dokusunu 20 μL sterilize su içeren 1,5 mL'lik bir mikrotüp içine dağıtın. Yosun protonemal dokusunun suda küçük parçalar halinde yeterince dağıldığından emin olun. Vahşi tip (WT) için, protonemata'yı ayırmak için forseps kullanın; ggb mutantı için bir P-1000 pipet kullanın.
4. 1,5 mL mikrotüpe 10 μL sterilize edilmiş kalkoflor beyazı ekleyin ve mikrotüpü boyama için 2 dakika boyunca kaputta dik bırakın.
5. Boyama işleminden hemen sonra, bitkileri% 0.5 (w / v) glikoz ve% 0.4 (w / v) gellan sakızı ile desteklenmiş BCDAT ortamı içeren 200 μL soğutulmuş BCDATG ile karıştırın, P-1000 pipet ile beş kez pipetleyin.
   NOT: BCDATG ortamının, bitkilerin gerilmesini önlemek için yeterince soğutulduğundan emin olun (ortam katılaşmadan hemen önce).
6. Bitkileri ve BCDATG ortamını içeren karışımı 27 mm çapında bir cam taban kabına aktarın. Hücrelerin karıştırılması için BCDATG hacminin 200 μL'den fazla olmadığından ve numunelerle birlikte 200 μL'lik BCDATG'nin, ince bir film tabakası üretmek için 7 mm'lik cam alt kabın yüzeyine eşit olarak dağıtıldığından emin olun, böylece numuneler görüntüleme sırasında objektif çalışma mesafesi içinde olur.
7. Oda sıcaklığında 2 dakika katılaştıktan sonra, ince tabakayı 3 mL soğutulmuş BCDATG ile örtün ve tekrar katılaşması için 10 dakika bekletin.
   NOT: Kontaminasyonu önlemek için 1.2-1.5 adımlarının steril bir davlumbazda uygulandığından emin olun.
8. Çanağın alt kısmında, her biri paralel ve dik yönlerde dokuz çizgi çizin (Şekil 2). Satırları a'dan h'ye karakterlerle işaretleyin ve sütunları 1'den 8'e kadar sayılarla işaretleyin. Her karedeki konumları işaretlemek için üst, alt, sağ, orta ve sol kullanın. Örneğin, bir bitki ikinci satırda ve altıncı sütunda bir karede ise ve karenin sol üst kısmına yerleştirilmişse, bu bitkiye "b6_upper_left" adı verilir.
9. Bitkileri içeren cam alt kabı, büyüme odasında 25 ° C'de 5 gün boyunca kırmızı ışık altında ve daha sonra 3 güne kadar her gün hızlandırılmış görüntülemeye tabi tutulmadan önce 1-2 gün boyunca beyaz ışık altında önceden kültüre alın. WT için, protonemata'nın fototropik tepkisini indüklemek için bitkileri 5 gün boyunca yukarıdan zayıf kırmızı ışıkta (0.5 μmol ^{m-2 s-1}) önceden kültüre alın, böylece bitkiler bulaşıkların dibine yapışabilir¹¹.
   NOT: Zayıf kırmızı ışık, beyaz bir ışığın 3 mm kalınlığındaki kırmızı akrilik plastik filtreden ışık geçirmez kutulara geçirilmesiyle sağlanır. ggb mutantları için, ggb mutantlarının fototropik bir yanıtı olmadığından kırmızı ışıkta önceden kültürleme isteğe bağlıdır³.

2. Görüntüleme ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon

1. Bitkileri içeren cam alt kabı, cam taban hedefe bakacak şekilde ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop sahnesine yerleştirin. Kalkoflorun 20x objektif lensle görselleştirilmesi için konfokal bir mikroskop kullanın. 405 nm lazer, 1,0'da iğne deliği, 100'de HV kazancı, 0'da ofset-arka plan ayarı, %5-%7'de Lazer Gücü, 1.024 x 1.024 tarama boyutu ve 1/2 kare/sn tarama hızı ile görüntü çekin. Adım boyutu 1,0 μm olan 17-30 z serisi optik bölümleri toplayın. Adım 1.6'daki kodu kullanarak görüntüleri "b6_upper_left-day0" gibi adlandırın ve kaydedin.
   1. Edinme'de DAPI kanalını seçin ve ND Alımı'ndaki Z kutusunu işaretleyin. Z yığınının alt ve üst sınırlarını ayarlamak için Üst ve Alt düğmelerini tıklatın.
2. 3B görüntüleri yeniden oluşturmak için, .nd2 dosyasını açın (Şekil 3A; bkz. Malzeme Tablosu) ve Birim'i tıklatın (Şekil 3B).

3. Aynı bitkileri farklı zaman noktalarında görüntüleme

1. Her görüntülemeden sonra, cam taban kabını tekrar büyüme odasına koyun.
2. Görüntüleme ve 3B rekonstrüksiyon için adım 2.1'den itibaren tekrarlayın.
   NOT: Aynı bitkileri bulmak için, adım 1.6'da belirtilen kodu kullanın ve bitkilerin yaşına göre "b6_upper_left-gün1" veya "b6_upper_left-gün2" adını verin.

Sonuçlar

Bu yöntem, vahşi tip ve ggb mutantlarında gelişim sırasında hücre duvarı dinamiklerinin gözlemlenmesini sağlar (Şekil 1). Sonuçlar, hücre duvarının daha az kalınlaştığı bölgelerin, hücre genişlemesi / dallanma bölgeleri ile ilişkili olduğunu ve vahşi tipte genişleme / dallanma bölgelerinin tahmin edilmesine izin verdiğini göstermiştir (Şekil 1A). ggb mutantlarındaki hücre duvarlarının yüzeyi, kontrolsüz h?...

Tartışmalar

Hızlandırılmış 3-D rekonstrüksiyon veya 4-D görüntüleme, gelişimsel süreçler sırasında hücresel morfolojinin dinamiklerini gözlemlemek için güçlü bir araçtır. Bu protokolde, kalkoflor beyazının ortama karıştırılmasıyla, yosun P. patens'te 3-D hücresel morfolojinin dinamikleri gözlemlenebilir. Bu yöntemi kullanarak, ggb mutantlarındaki hücre duvarlarının yüzeyinin gelişim sırasında parçalandığını gözlemledik³. Ayrıca, hücre duvarlar?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-mm-thick red plastic light filter	Mitsubishi	no.102
27 mm diameter glass base dish	Iwaki	3930-035
Agar	Sigma	A6924
Calcofluor white	Sigma	18909-100ML-F	Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L
Confocal microscope	Nikon	A1	NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer
Fluorescence microscope	Nikon	TE200	Equipped with a DS-U3 camera;
Gellan gum	Nacali Tesque	12389-96
Plant Growth Chambers	SANYO	Sanyo MLR-350H
Sterilized syringe 0.22 μm filter	Millipore	SLGV033RS