Tibet Tıbbında Rhodiola Granüllerinde Çok İndeksli Bileşenlerin In Vitro Çözünme Tayini

Özet

Burada, Rhodiola granüllerinin (RG) in vitro çözünmesini test ediyoruz, ultra saf suda salidrosid, gallik asit ve etil galatın çözünme eğrilerini çiziyoruz ve eğrileri farklı matematiksel modellere uyguluyoruz. Bu protokol, RG'nin in vivo biyoeşdeğerliği ve in vivo-in vitro korelasyon çalışmaları için bilgi ve rehberlik sağlar.

Özet

Tibet tıbbı Rhodiola granüllerinin (RG) bileşimi karmaşıktır ve RG'nin genel kalitesini belirlemek zordur. Bu nedenle, RG'nin çok bileşenli in vitro çözünmesini belirlemek için bir yöntem oluşturmak, kalite kontrol için büyük önem taşımaktadır. Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi'nin (USP) 2. aparatı ile uyumlu olan Çin Farmakopesi'nden (2020 baskısı) dördüncü genel kural 0931'in ikinci kürek yöntemini kullanmaktadır. Çözünme aparatı, çözünme ortamı olarak ultra saf su ile 100 rpm'lik bir dönme hızına ayarlandı. Her zaman noktasında 1 mL'lik bir örnek hacmi toplandı. Ayrıca, gallik asit, salidrosid ve etil gallik asidin RG'de farklı zaman noktalarında kümülatif çözünmesi, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile belirlenmiştir. Son olarak, çözülme eğrileri çizildi ve eğriler GompertzMod, Gompertz, Lojistik ve Weibull denklemlerine takıldı. Sonuçlar, RG'deki gallik asidin kümülatif çözünmesinin 1 dakikada% 80'in üzerinde olduğunu, salidrosid ve etil gallik asidin kümülatif çözünmesinin 5 dakikada% 65'in üzerinde olduğunu ve her bir indeks bileşeninin kümülatif çözünmesinin 30 dakika sonra azaldığını göstermiştir. Eğri uyumu, GompertzMod denkleminin RG'nin her bir indeks bileşeni için en uygun model olduğunu gösterdi. Sonuç olarak, bu protokolde açıklanan çözünme testi yöntemi basit, doğru ve güvenilirdir. RG'deki indeks bileşenlerinin in vitro çözünme davranışını karakterize edebilir, bu da RG'nin kalite kontrolü ve diğer etnik bileşiklerin kalite değerlendirmesi için metodolojik bir referans sağlar.

Giriş

Çin'de, kardiyovasküler hastalıkların prevalansı artmaya devam ediyor ve kardiyovasküler hastalıkların morbidite ve mortalite oranları Çin sakinleri arasında ilk sırada yer alıyor¹. Koroner kalp hastalığının anjina pektorisi, koroner ateroskleroza bağlı luminal darlıktan kaynaklanır ve bu da nispeten yetersiz koroner kan akımına ve miyokard iskemisi ve hipoksiye yol açar². Son yıllarda, geleneksel Çin tıbbının koroner kalp hastalığının tedavisinde iyileştirici etkisi birçok doktor tarafından kabul edilmiştir³.

Geleneksel Çin tıbbı, klinik semptomların hafifletilmesinde ve hastaların yaşam kalitesinin iyileştirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır⁴. Rhodiola granülleri (RG), Tibet Platosu şifalı bitkisi Rhodiola rosea L'den ekstrakte edilir ve rafine edilir. RG'nin ana bileşenleri salidrosid, rodosin ve flavonoidler ^5,6'dır. RG, Qi^7'yi destekleme ve ağrıyı hafifletmek için kan dolaşımını aktive etme ve teşvik etme etkisine sahiptir. Klinik olarak, Qi eksikliği ve kan stazı, koroner kalp hastalığı, anjina pektoris^8'in neden olduğu göğüs tıkanıklıklarını tedavi etmek için kullanılır. İçerik tayini tek başına ilaçların içsel kalitesini tam olarak yansıtmaz, çünkü in vitro olarak hem parçalanma hem de çözünme ilaçların biyoyararlanımını ve etkinliğini etkileyebilir ^9,10. Çin tıbbının çözülmesi için muayene yöntemleri arasında dönen sepet yöntemi, kürek yöntemi ve küçük fincan yöntemi bulunur. Dönen sepet yönteminin dezavantajı, dönen sepetin yalnızca dış kısmının, gerçek dünyadaki çözünme davranışını yansıtmayan dönme sırasında çözünme ortamıyla temas etmesidir. Kürek yöntemi, yukarıdaki eksikliğin üstesinden gelebilir, bu da onu bazı katı Çin tıbbı preparatları için sepet yönteminden daha uygun hale getirir¹¹. Şu anda, RG'nin in vitro çözünme analizi hakkında bir rapor bulunmamaktadır. RG'nin kalitesini daha kapsamlı bir şekilde kontrol etmek için, RG'deki üç indeks bileşeninin (gallik asit, salidrosid ve etil gallat) çözünme davranışı araştırılmıştır. Bu çalışma, RG'nin kalite kontrolü için veri ve diğer etnik bileşik preparatlarının kalite değerlendirmesi için metodolojik bir referans sunmaktadır.

Protokol

1. Çözelti hazırlama

1. Referans madde stok çözeltisini hazırlayın: Elektronik analitik terazide 10,6 mg salidrosid, 5,24 mg gallik asit ve 5,21 mg etil gallik asidi ayrı ayrı tartın ve bunları ayrı ayrı 5 mL hacimsel şişeye ekleyin. Daha sonra, çözünmesi ve 5 mL'ye seyreltilmesi için HPLC sınıfı metanol ekleyin. Son olarak, sırasıyla 2.120 mg / mL, 1.048 mg / mL ve 1.042 mg / mL kütle konsantrasyonlarına sahip referans madde stok çözeltisini elde etmek için iyice çalkalayın.
   NOT: Referans madde stok çözeltisi, sonraki standart eğride her bir çözeltinin stok çözeltisi olarak 2.120 mg/mL salidrosid, 1.048 mg/mL gallik asit ve 1.042 mg/mL etil galat içerir.
2. Test örneği çözümünü hazırlayın. 30 dakika boyunca ultrasonik temizleme makinesi (Güç: 200 W, frekans: 40 kHz) kullanarak 10 mL HPLC sınıfı metanol ile 2,8 g RG (Malzeme Tablosu) çıkarın ve ardından sistem uyarlanabilirlik testi için 0,22 μm filtre ile filtreleyin.
3. 0.590 mg/mL salidrosid, 2.030 mg/mL gallik asit ve 1.930 mg/mL etil galat içeren karışık bir referans çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Her standart (2.950 mg salidrosid, 10.150 mg gallik asit ve 9.650 mg etil gallik asit), çözünme ortamı olarak HPLC sınıfı metanol içinde 5 mL hacimsel şişede çözülür.
4. Ultra saf su ekstraksiyonu için RG'nin her bir karakteristik bileşeninin teorik içeriğini elde edin.
   1. 500 mL'lik konik bir şişeye 2,8 g RG yerleştirin, 200 mL ultra saf su ekleyin ve 60 dakika boyunca ultrasonik olarak ekstrakte edin (Güç: 200 W, frekans: 40 kHz). Ardından, 0,22 μm'lik bir filtreyle filtreleyin.
   2. Aşağıdaki deneyde elde edilen doğrusal denkleme göre test çözeltisinin içeriğini belirleyin.

2. Kromatografik durum

1. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi için kromatografik koşulları Tablo 1'de gösterildiği gibi ayarlayın. Kullanılan cihaz hakkında ayrıntılı bilgi için, Malzeme Tablosuna bakın.

3. Sistem uyarlanabilirlik testi

1. Doğrusal ilişkiyi araştırın.
   1. Standart bir eğri çizmek için gradyan konsantrasyon çözeltisini elde etmek için gallik asit ve etil galatın referans stok çözeltilerini 5, 10, 25, 50 ve 125 kez ve salidrosidin referans stok çözeltilerini 2, 4, 8, 16 ve 32 kez seyreltin.
      NOT: Standart eğrinin seyreltme oranını, numune işleminin ön deneyine göre ayarlayın. Ön deneyde, üç standardın stok çözümleri önce 5, 10, 25, 50 ve 125 kez seyreltildi ve daha sonra ilk standart eğri çizildi. Bununla birlikte, test numunesinin konsantrasyonu tespit edildiğinde, salidrosid konsantrasyonlarının bu standart eğrinin doğrusal aralığına girmediği ve bu nedenle konsantrasyonların eğriye dahil edilecek şekilde ayarlandığı bulunmuştur. Özetle, yukarıdaki ön deneyler, sonraki deneysel çalışmalar için üç test örneğinin nihai seyreltme konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılmıştır.
2. Hassas test: Karışık referans çözeltisinden 10 μL'yi HPLC sistemine günde altı kez enjekte edin ve numuneleri adım 2.1'de açıklanan HPLC koşullarıyla çalıştırın. Her unsur bileşeninin tepe alanını kaydedin.
3. Stabilite testi deneyleri: Hazırlanan numune çözeltisinden 10 μL enjekte edin ve sırasıyla 0 saat, 6 saat, 10 saat, 12 saat, 14 saat, 16 saat, 18 saat, 20 saat ve 24 saatten sonra kromatografik koşullara göre HPLC'nin tepe alanlarını belirleyin.
   NOT: Tepe alanları HPLC sistemi tarafından otomatik olarak kaydedilir.
4. Tekrarlanabilirlik testi: Test numunesi çözeltisini adım 1.2'deki yönteme göre hazırlamak için aynı RG partisinden altı numune alın. Her numunenin 10 μL'sini HPLC sistemine enjekte edin. Örnekleri adım 2.1'de açıklandığı gibi çalıştırın ve yeniden üretilebilirliği belirleyin.
   NOT: Tekrarlanabilirlik, altı numune arasındaki konsantrasyon farkları karşılaştırılarak değerlendirilmiştir.
5. Kurtarma deneyi
   1. Test çözümü için aynı RG partisinin altı bölümünü hazırlayın. Ardından, geri kazanım oranını hesaplamak için test çözeltisindeki her bir indeks bileşeninin referans maddesinin yaklaşık% 50'sini ekleyin. Bu örnekleri HPLC sisteminde adım 2.1'de açıklanan koşullarla çalıştırın.
   2. Kurtarma oranını hesaplayın.
      NOT: Geri kazanım hızı = (C - A) / B x 100, burada A, test çözeltisinde ölçülecek bileşen miktarıdır, B, eklenen referans madde miktarıdır ve C, referans maddeyi ve RG numunesini içeren çözeltinin ölçülen değeridir. Yukarıdaki adımları gerçekleştirmek üzere kromatografik koşullar için adım 2.1'e bakın (yani, adım 3.1-3.5).

4. In vitro çözünme testi

1. Çözünme testini, Çin Farmakopesi'nden (2020 ^baskısı) 12 numaralı genel kuralın ikinci yönteminin kürek yöntemini kullanarak gerçekleştirin.
   NOT: Numune alma tekniği ve ekipmanı: İlaç çözme aparatının (Malzeme Tablosu) bir çözünme kabı, bir kürek, bir sıcaklık kontrol sistemi ve bir hız ayar sistemi vardır. Çözünme deneyine başlamadan önce, su önceden ayarlanmış bir sıcaklığa ısıtılır ve ardından karşılık gelen hız ayarlanır. RG'yi ekledikten hemen sonra saati kaydetmeye başlayın.
2. İlaç çözünme aparatının çözünme kabına 100 mL ultra saf su ekleyin ve sıcaklığı 37 ° C ± 0,5 ° C'de tutun. Dönüş hızını 100 rpm'ye ayarlayın.
   NOT: Çözünme aparatı, sıcaklığın sistem içinde ayarlanmasını sağlayan bir ısıtma cihazına sahiptir. Sudaki salidrosid, yapay mide suyu (16.4 mL seyreltilmiş hidroklorik asit [234 mL konsantre hidroklorik asit [su ile 1000 mL'ye seyreltilmiş] yaklaşık 800 mL su ve 10 g pepsin, iyi çalkalanmış ve su ile 1.000 mL'ye seyreltilmiş) ve yapay bağırsak suyu (tripsin içeren fosfat tamponu [pH 6.8])¹³ çözünme oranında anlamlı bir fark yoktu. En kolay bulunan su (ultra saf) çözünme ortamı olarak seçildi.
3. Bir çözünme kabına 2,8 g RG ekleyin ve çözünme süresini hemen kaydetmeye başlayın. Numunenin toplam 1 mL'sini bir enjektörle (bkz. Malzeme Tablosu) 1 dakika, 5 dakika, 10 dakika, 20 dakika, 30 dakika ve 60 dakikada toplayın ve çözünme kabındaki hacmi hemen aynı sıcaklıkta çözünme ortamı ile oluşturun.
   NOT: Çözünme kabındaki numune alma tüpü küçük numune hacimlerini toplayamaz, bu nedenle numuneyi toplamak için enjektör kullanılır. Belirtilen toplama zaman noktalarının eksik olmasını önlemek için numuneler hızlı bir şekilde toplanmalıdır.
4. Toplanan numuneleri derhal 0.22 μm mikro gözenekli bir membrandan filtreleyin ve sonraki filtratı alın. HPLC ile her zaman noktasında her bileşenin içeriğini belirleyin (adım 2.1'e göre) ve kümülatif çözünmeyi hesaplayın.
   1. Kümülatif çözünmeyi hesaplamak için, her zaman noktasının (X_n) çözünmesini hesaplayın:
      X_n = A / B x 100, burada A, her zaman noktasında ölçülen bileşenlerin miktarıdır ve B, her bileşenin teorik içeriğidir.
   2. Ardından, kümülatif çözünmeyi (Y) hesaplayın:
      Y = X n + (X 1 + ... + X _n-1) x V 2 / V 1, burada V₁ çözünme ortamının toplam hacmidir ve V ₂, her örneklemeden sonra eklenen çözünen hacimdir.
      NOT: Kromatogramdaki salidrosid ve gallik asidin düşük tepki değerleri nedeniyle, salidrosid ve etil galatın 1 dakikalık zaman noktasında kümülatif çözünmesi çözünme eğrisinde çizilmemiştir.

5. Çözünme modelinin takılması

1. Her zaman noktasında kümülatif çözünme verilerini veri analizi yazılımına aktarın.
2. GompertzMod denklemine, Gompertz denklemine, Lojistik denklemine ve Weibull denklemi^14'e uyması için veri analizi yazılımındaki ilaç çözünme analizi eklentisini kullanın. R^2'nin değeri ne kadar büyük olursa, eğri uydurma etkisi o kadar iyi olur.
   1. Yazılımı başlatın, Kaynak Veri Düzenleme penceresine girmek için Book1 penceresini seçin.
   2. İlk sütunda A(X)-Uzun Ad giriş Zamanı, Zamanı zaman olarak tanımlayın ve her çözünme belirleme zamanını girin. İkinci sütuna Veri Girişi B(Y)-Uzun Ad, Verileri kümülatif çözünme olarak tanımlayın, her çözünme belirleme zamanının kümülatif çözünme yüzdesini girin.
   3. Veri girişinden sonra, A( X ) ve B(Y) sütunlarını seçin ve yazılım menü çubuğunda İlaç Çözünme Analizi eklentisini seçin ve Tamam'> Sığdırma Verilerini Sığdır'> tıklayın. Yazılım, her modelin montaj sonuçlarını üretir.

Sonuçlar

Bu çalışmada, RG'nin hassasiyeti, stabilitesi, tekrarlanabilirliği ve numune geri kazanımı, Çin Farmakopesinde (Cilt 4, 2020)^12'de belirtilen metodolojik aralıkta olup, yöntemin uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Tekrarlanan hata ayıklamadan sonra, bu çalışmada kullanılan elüsyon gradyanının RG'deki üç indeks bileşeni için iyi çözünürlüğe sahip olduğu belirlenmiştir (Şekil 1). RG'deki üç indeks bileşeni, belirli bir konsantrasyon...

Tartışmalar

Çözünme testi, gastrointestinal sistemde katı oral preparatların parçalanmasını ve çözünmesini simüle etmek için ideal bir in vitro yöntemdir¹⁵. Katı oral preparatların kalitesini değerlendirmek ve kontrol etmek için önemli bir indekstir. Bu nedenle, çözünme testi, katı ilaç oral preparatlarının geliştirilmesinde önemli bir rol oynar¹⁶. Özellikle geleneksel Çin tıbbı (TCM) kalite kontrol teknolojisinin gelişmesiyle birlikte, çözü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatographic column	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 mm x 250 mm, 5 µm
Drug dissolution tester	Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd.	RCZ-6B3
Electronic analytical balance	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
Ethyl gallate (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM006301
Function drawing software	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2022
Gallic acid (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM000802
High performance liquid chromatography	Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.	Agilent 1260 Infinity
HPLC grade methanol	Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.	216565
Injector	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd.	0.7 (22 G)
Millipore filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ13 0.22 Nylon66
Rhodiola granules	Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd.	210501
Salidroside (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST200425-037
Ultra pure water systemic	Merck Millipore Ltd.	Milli-Q
Ultrasonic cleansing machine	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200 DTS