Osteositlerin Analizi ve Görüntülenmesi

Özet

Bu çalışma, hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) analizi için lakünar-kanaliküler ağ (LCN) içindeki osteositlerin üç boyutlu (3D) modellerini görselleştirme ve geliştirme yöntemini özetlemektedir. Bu yöntem kullanılarak oluşturulan modeller, sağlıklı veya hastalıklı kemiklerde osteosit mekanosyumunun anlaşılmasına yardımcı olur.

Özet

Osteositler, mekanotransdüksiyon olarak bilinen bir süreçte çeşitli biyolojik yolları aktive ederek mekanik gerilmelere ve sıvı akış kesme stresine (FFSS) yanıt verdiği düşünülen kemik hücreleridir. Osteosit ağlarının konfokal görüntüden türetilmiş modelleri, doğrudan ölçümle belirlenemeyen osteosit zarı üzerindeki kayma gerilmelerini değerlendirmek için Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) analizi yapmak için değerli bir araçtır. Kemiğin mikroyapısal mimarisinin bu yüksek çözünürlüklü görüntülerini kullanan hesaplamalı modelleme, kemiğe uygulanan mekanik yükü sayısal olarak simüle etmek ve osteositlerin yüke bağlı stimülasyonunu anlamak için kullanıldı.

Bu çalışma, çeşitli hesaplamalı modelleme yazılımlarını kullanarak CFD analizi yapmak için Lacunar-Canalicular Network'ün (LCN) konfokal mikroskop görüntülerini kullanarak 3D tek osteosit modelleri geliştirme yöntemlerini detaylandırmaktadır. Konfokal mikroskopiden önce, fare kemikleri kesitlere ayrılır ve LCN'yi etiketlemek için Floresein izotiyosiyanat (FITC) boyası ile boyanır. 100x çözünürlükte, Z-yığını görüntüleri bir konfokal mikroskop kullanılarak toplanır ve LCN ve osteosit-dendritik süreçlerin bir yüzey modelini oluşturmak için MIMICS yazılımına (3D görüntü tabanlı işleme yazılımı) aktarılır.

Bu yüzeyler daha sonra, osteosit hücre gövdesi etrafındaki laküner akışkan boşluğu ve lakunokanaliküler sıvı içeren dendritlerin etrafındaki kanaliküler boşluğu modellemek için 3-Matic yazılımında (3D veri optimizasyon yazılımı) bir Boole işlemi kullanılarak çıkarılır. 3D hacimsel akışkan geometrisi, CFD analizi için ANSYS yazılımına (simülasyon yazılımı) aktarılır. ANSYS CFX (CFD yazılımı), kemiğe sıvı basıncı olarak fizyolojik yükleme uygulamak için kullanılır ve osteositler üzerindeki duvar kesme gerilmeleri ve dendritik süreçler belirlenir. LCN'nin morfolojisi, osteosit hücre zarı ve hücre süreçleri tarafından algılanan kayma gerilmesi değerlerini etkiler. Bu nedenle, konfokal görüntü tabanlı modellerin nasıl geliştirildiğine dair ayrıntılar, osteosit mekanosasyonunu anlamada değerli olabilir ve bu alanda gelecekteki çalışmalar için zemin hazırlayabilir.

Giriş

Osteositlerin fiziksel egzersize yanıt olarak kemik kütlesini düzenlediği varsayılmaktadır¹. Osteositlerin membran deformasyonu ve mekanik yüklenmeye bağlı dendritik süreçleri, onları osteositler tarafından tespit edilen ve hücre içi sinyalleşmeyi tetikleyen FFSS'ye maruz bırakır ^2,3,4. Kemik mikroyapısı, yaşlanma veya osteoporoz ve diyabet gibi kemik hastalıkları ve osteositlerin mekanik yanıtının bozulmasına neden olan perlecan eksikliği gibi durumlar nedeniyle laküner-kanaliküler morfolojisinde bozulma veya değişikl....

Protokol

Hayvan deneyleri, Missouri Üniversitesi, Kansas City'deki (UMKC) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirildi ve ilgili federal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Kemik hazırlama işlemi

1. 4 aylık ve 22 aylık dişi C57BL6 farelerden femurları toplayın ve bunları PBS'de 24 saat boyunca 4 ° C'de hafifçe sallayarak soğuk% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin, ardından PBS'de durulayın ve gömmeden önce% 70 etanol içinde saklayın.
   NOT: Fiksatif hacim, doku hacminin yaklaşık 20 katı olmalıdır
2. Üreticinin talimatlarını izleyerek kemikler....

Sonuçlar

Bu protokol, bir osteositin ve dendritik süreçlerinin mekanik yükleme nedeniyle maruz kaldığı sıvı akış kesme gerilimi miktarını araştırmak için konfokal türevli osteosit modellerinin nasıl geliştirileceğini açıklar. Genç ve yaşlı konfokal görüntü tabanlı osteosit modelleri oluşturmak için yaşlı bir fare ve genç bir C57BL6 fare seçildi. Yaşlanma veya kemik hastalığına bağlı LCN morfolojisinin değişimini incelemek için geometri modifikasyon tekni.......

Tartışmalar

Bu protokol, osteositlerin görselleştirilmesi ve hesaplamalı modellemesi için konfokal bir görüntüleme tekniğini ana hatlarıyla belirtir. Konfokal görüntülemeden önce kemik örneklerinin kesit alınması ve boyanması için kemik hazırlama işlemi yapılır. 100x büyütmeli konfokal görüntüler, osteositlerin ve lakunar-kanaliküler boşluğun bilgisayar modellerini geliştirmek için çeşitli yazılımlara aktarılır. Son olarak, kemik matriksindeki osteositlere eriş.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,200 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-012-100
3-Matic software	Materialise	https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic	3D data optimization software
600 grit sandpaper	Buehler	30-5118-600-100
800 Grit sandpaper	Buehler	30-5170-800-100
ANSYS software	ANSYS	https://www.ansys.com/	simulation software
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
ImageJ software		https://imagej.net/ij/
Immersion Oil for Microscopes	Leica Microsystems	195371-10-9
Leica TCS Sp5 II confocal microscope	Leica Microsystems	TCS Sp5 II
Leitz 1600 inner hole diamond saw	Leica
MIMICS Innovation Suite software	Materialise	https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite	3D image-based processing software
Permount mount medium	Fisher scientific	SP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic Kit	Buehler	20-3560
Single Platform Laboratory Shaker	Reliable scientific INC	Model 55S