JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) analizi için lakünar-kanaliküler ağ (LCN) içindeki osteositlerin üç boyutlu (3D) modellerini görselleştirme ve geliştirme yöntemini özetlemektedir. Bu yöntem kullanılarak oluşturulan modeller, sağlıklı veya hastalıklı kemiklerde osteosit mekanosyumunun anlaşılmasına yardımcı olur.

Özet

Osteositler, mekanotransdüksiyon olarak bilinen bir süreçte çeşitli biyolojik yolları aktive ederek mekanik gerilmelere ve sıvı akış kesme stresine (FFSS) yanıt verdiği düşünülen kemik hücreleridir. Osteosit ağlarının konfokal görüntüden türetilmiş modelleri, doğrudan ölçümle belirlenemeyen osteosit zarı üzerindeki kayma gerilmelerini değerlendirmek için Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) analizi yapmak için değerli bir araçtır. Kemiğin mikroyapısal mimarisinin bu yüksek çözünürlüklü görüntülerini kullanan hesaplamalı modelleme, kemiğe uygulanan mekanik yükü sayısal olarak simüle etmek ve osteositlerin yüke bağlı stimülasyonunu anlamak için kullanıldı.

Bu çalışma, çeşitli hesaplamalı modelleme yazılımlarını kullanarak CFD analizi yapmak için Lacunar-Canalicular Network'ün (LCN) konfokal mikroskop görüntülerini kullanarak 3D tek osteosit modelleri geliştirme yöntemlerini detaylandırmaktadır. Konfokal mikroskopiden önce, fare kemikleri kesitlere ayrılır ve LCN'yi etiketlemek için Floresein izotiyosiyanat (FITC) boyası ile boyanır. 100x çözünürlükte, Z-yığını görüntüleri bir konfokal mikroskop kullanılarak toplanır ve LCN ve osteosit-dendritik süreçlerin bir yüzey modelini oluşturmak için MIMICS yazılımına (3D görüntü tabanlı işleme yazılımı) aktarılır.

Bu yüzeyler daha sonra, osteosit hücre gövdesi etrafındaki laküner akışkan boşluğu ve lakunokanaliküler sıvı içeren dendritlerin etrafındaki kanaliküler boşluğu modellemek için 3-Matic yazılımında (3D veri optimizasyon yazılımı) bir Boole işlemi kullanılarak çıkarılır. 3D hacimsel akışkan geometrisi, CFD analizi için ANSYS yazılımına (simülasyon yazılımı) aktarılır. ANSYS CFX (CFD yazılımı), kemiğe sıvı basıncı olarak fizyolojik yükleme uygulamak için kullanılır ve osteositler üzerindeki duvar kesme gerilmeleri ve dendritik süreçler belirlenir. LCN'nin morfolojisi, osteosit hücre zarı ve hücre süreçleri tarafından algılanan kayma gerilmesi değerlerini etkiler. Bu nedenle, konfokal görüntü tabanlı modellerin nasıl geliştirildiğine dair ayrıntılar, osteosit mekanosasyonunu anlamada değerli olabilir ve bu alanda gelecekteki çalışmalar için zemin hazırlayabilir.

Giriş

Osteositlerin fiziksel egzersize yanıt olarak kemik kütlesini düzenlediği varsayılmaktadır1. Osteositlerin membran deformasyonu ve mekanik yüklenmeye bağlı dendritik süreçleri, onları osteositler tarafından tespit edilen ve hücre içi sinyalleşmeyi tetikleyen FFSS'ye maruz bırakır 2,3,4. Kemik mikroyapısı, yaşlanma veya osteoporoz ve diyabet gibi kemik hastalıkları ve osteositlerin mekanik yanıtının bozulmasına neden olan perlecan eksikliği gibi durumlar nedeniyle laküner-kanaliküler morfolojisinde bozulma veya değişiklikler geçirir 5,6. Kemik mimarisindeki bu değişiklikler, osteositlerin farklı seviyelerde FFSS ve suşlar yaşamasına neden olur 7,8. Daha da önemlisi, mekanik yüklemeye yanıt olarak osteositler tarafından deneyimlenen FFSS'nin in vivo olarak ölçülmesi zordur çünkü bunlar kalsifiye kemik matrisine gömülüdür.

Konfokal görüntü tabanlı modelleme, LCN 9,10'un bilgisayar modellerini çoğaltarak erişilemeyen osteositleri doğal ortamlarında incelemenin sınırlamalarının üstesinden gelmek için güçlü bir tekniktir. Birbirine bağlı LCN ağını 3D olarak işlemek ve modellemek zor olmuştur. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), taramalı elektron mikroskobu (SEM), seri blok yüz kesiti alma ve seri odaklı iyon demeti taramalı elektron mikroskobu (FIB/SEM)2,11,12 gibi çeşitli görüntüleme teknikleri vardır. Kemik 13,14,15'i görselleştirmek ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile 3D osteosit modelleri oluşturmak için değerli bir teknik geliştirilmiştir. CLSM, lakuna hacminin tamamını ve kanaliküllerin çoğunu 3D olarak görüntüleme yeteneği nedeniyle diğer görüntüleme tekniklerinden ziyade hesaplamalı modelleme için burada seçilmiştir16,17. LCN geometrisi, kemik gerilmelerini tahmin etmek için osteosit Sonlu Elemanlar Analizi (FEA) için CLSM kullanılarak oluşturulabilir. Bununla birlikte, osteositlerin deneyimlediği FFSS'yi tahmin etmek için sıvı analizi, interstisyel sıvının18 etrafında hareket ettiği dar lakünar-kanaliküler boşluğun modellenmesini sağlamak için osteositin hücre zarının ve LCN içindeki dendritlerinin modellenmesini gerektirdiğinden daha karmaşıktır.

Bu protokolde, kemik içindeki LCN'yi etiketlemek için konfokal mikroskopiden önce dekalsifiye edilmemiş kalın kemik bölümlerine floresein izotiyosiyanat (FITC) boyası uygulanır ve LCN'den alınan görüntüleme verilerine dayalı olarak osteosit-dendritik membranlar modellenir. Lakunar-kanaliküler boşluk, hesaplamalı modelleme kullanılarak simüle edilmiştir ve fiziksel aktiviteye bağlı fizyolojik yüklenme, bir CFD yaklaşımı kullanılarak modellenmiştir. Osteositler, LCN içindeki sıvı profilini analiz etmek ve osteosit ve dendritik membranlar üzerindeki FFSS'yi ölçmek için CFD yazılımında bir sıvı basınç gradyanına tabi tutulur. Ayrıca, bir FEA yaklaşımı, sıkıştırıcı mekanik yükleme uygulayarak osteosit suşlarını veya streslerini ölçebilir.

Yaşlı hayvanlarda veya kemik hastalığı olanlarda değişmiş lakunar-kanaliküler morfolojiyi simüle etmek için genç, sağlıklı kemik görüntülerinden türetilen mikro yapıları değiştirmek için bir geometri modifikasyon tekniği de geliştirilmiştir. Kemik mikroyapısındaki değişiklikler arasında yaşlanma ile birlikte kanalikül sayısının azaltılması, perlekan eksikliğinde ne olduğunu modellemek için lakünar-kanaliküler boşluk alanının azaltılması ve yaşlanma etkilerini modellemek için arttırılması ve diyabetik kemiği modellemek için kanaliküler ve dendritik duvar alanının azaltılmasıyer almaktadır 5,6. Geometri modifikasyon tekniği, kemikteki osteositlerin deneyimlediği FFSS'yi, sağlıklı ve hastalıklı hayvanlarda genç ve yaşlı veya kemikler gibi farklı mikro yapılarla karşılaştırmamıza olanak tanır.

Genel olarak, konfokal görüntü tabanlı modelleme, sağlıklı kemikteki osteositlerin morfolojisini simüle etmenin yanı sıra osteosit morfolojisindeki yaşlanma / hastalıkla ilişkili değişiklikleri simüle etmek için değerli bir araçtır. Ayrıca, yüzey alanı ve lakunar-kanaliküler boşluğun hacmi gibi osteosit morfolojik parametreleri, mekanik zorlanmaya hücresel tepkileri tahmin etmek için çeşitli kemiklerde ölçülebilir ve karşılaştırılabilir.

Protokol

Hayvan deneyleri, Missouri Üniversitesi, Kansas City'deki (UMKC) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirildi ve ilgili federal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Kemik hazırlama işlemi

  1. 4 aylık ve 22 aylık dişi C57BL6 farelerden femurları toplayın ve bunları PBS'de 24 saat boyunca 4 ° C'de hafifçe sallayarak soğuk% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin, ardından PBS'de durulayın ve gömmeden önce% 70 etanol içinde saklayın.
    NOT: Fiksatif hacim, doku hacminin yaklaşık 20 katı olmalıdır
  2. Üreticinin talimatlarını izleyerek kemikleri hızlı bir şekilde polimerize eden bir akriliğe (Malzeme Tablosu) hızlı bir şekilde gömün.
    NOT: Bu adım için hızlı polimerize edici bir reçine kullanmak önemlidir (~ 10 dk). Amaç, elmas testere kullanılarak kesit alma sırasında kemik dokusunu desteklemektir, ancak reçine LCN'ye nüfuz etmeden, bu da FITC lekesinin içeri girmesini engelleyecektir.
  3. Bir elmas testere kullanarak üçüncü trokanterin üzerindeki standart bir bölgeden 300 μm kalınlığında enine dilimler kesin ve FITC boyamadan önce bunları 4 °C'de% 70 etanol içinde saklayın.
  4. Bölümleri 600, 800 ve ardından 1200 kumlu zımpara kağıdı kullanarak ~90-100 μm nihai kalınlığa kadar cilalayın.
    NOT: Uygun kalınlığa ulaşılması dijital kumpas kullanılarak sağlanmıştır.
  5. Bölümleri %70, %95 ve %100 etanolde 5 dakika durulayın.
  6. Karanlıkta oda sıcaklığında (RT) 4 saat boyunca orta derecede çalkalanarak% 100 etanol içinde% 1 FITC'de boyayın.
  7. Bölümleri karanlıkta hafifçe çalkalayarak 30 dakika boyunca %100 etanol içinde yıkayın. Ardından, gece boyunca karanlıkta havayla kurutun.
  8. Monte etmek için, bölümü bir cam mikroskop lamı üzerindeki bir damla montaj ortamına yerleştirin. Kesiti slayta karşı mümkün olduğunca düz konumlandırmak için forseps kullanın, hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının ve numuneyi manipüle etmek için çevredeki reçineyi kullanın. Numunenin üzerine bir lamel monte edin.

2. Konfokal mikroskopi

  1. FITC ile boyanmış kemik dilimlerinin görüntülenmesi için konfokal bir mikroskop kullanın.
  2. 1024 x 1024 piksel, 0,089 μm piksel çözünürlükte 400 Z düzleminden oluşan ayrıntılı Z yığınlarını toplamak için 1,7 dijital yakınlaştırma ve 0,126 μm adım boyutuna sahip 100x 1,44NA yağ objektifi kullanın.
  3. Uyarma için 496-596 nm'lik bir emisyon toplama penceresi ile 488 nm'lik bir lazer kullanın. Artan görüntüleme derinliği ile sinyal kaybını düzeltmek için telafi ayarlarını kullanarak görüntü yığınlarını toplayın.
  4. Yüksek hızda örnekleme ve artırılmış satır ortalaması gibi görüntü toplama tekniklerini kullanarak görüntülerin doğruluğunu ve çözünürlüğünü artırın. Ayrıca, Şekil 5'de gösterildiği gibi femur bölümlerinin enine kesitlerinin 20x, 100x ve 1x çözünürlüğünde büyütme ile görüntüleri toplayın.
    NOT: Şekil 1'deki düşük çözünürlüklü (5x) görüntü, 100x görüntüleme alanı için seçilen üç bölge ile uyluk kemiğinin tam kesit alanını göstermektedir.
  5. Osteositlerin bilgisayar modellemesi için 100x Z-yığınlarını kullanın.

3. Bilgisayar modelleme

  1. Toplanan 100x görüntüleri TIFF formatında ImageJ yazılımına aktarın ve LCN'nin Z yönünde bir dizi görüntüsünü oluşturun.
  2. Görüntü yönünü tanımladıktan sonra LCN'nin bir maskesini oluşturmak için Z yığınlarını 3B görüntü tabanlı işleme yazılımına aktarın.
  3. LCN'ye çok benzemek için genç ve yaşlı farelerden alınan orijinal görüntüyü sırasıyla 30.012-45.677 Hounsfield birimi ve 15.000-46.701 Hounsfield birimi arasında eşikleyin. Maskeye dahil edilmek üzere piksel yoğunluğu sınırlarını değiştirmek için bölüm menüsünde Eşik'i ayarlayın.
  4. Kırpma Maskesi işlemini kullanarak yığından ilgi alanı (ROI) olarak kanalikülleri ile bir lacuna kırpın. ROI'yi, küpün ortasındaki lacuna'yı çevreleyecek ve tüm bağlı kanalikülleri küpün kenarlarına uzanacak şekilde tanımlayın. Lacuna'yı, kenar uzunlukları 21 μm, 14 μm ve 19 μm olan hayali daha büyük bir küple kaplayın.
  5. Model birden çok parçadan oluşturulduğundan, bağlı piksel bölgelerini seçmek, tek tip bir LCN oluşturmak için gürültüyü gidermek ve benekleri gidermek için bir bölge büyütme işlemi gerçekleştirin.
  6. 3D görüntü tabanlı işleme yazılımındaki Hesaplanan Parça işlemini kullanarak lakunar-kanaliküler maskeyi bir nesneye dönüştürün.
  7. Yumuşatma işlemini kullanarak LCN hacmini azaltarak osteosit ve dendritik zarları oluşturun. Sırasıyla 0,75 μm ve 0,08 μm'lik bir laküner ve kanaliküler boşluk kalınlığı elde etmek için bu işlemi birkaç kez gerçekleştirin 9,18.
  8. Nesneleri (STL formatı) 3B görüntü tabanlı işleme yazılımının son adımı olarak dışa aktarın.
  9. Bir hacim ağı oluşturmak için LCN ve osteosit-dendritik membranların iki katmanını 3D veri optimizasyon yazılımına aktarın.
  10. Her parçadaki ağ sorunlarını belirlemek için yazılımdaki Düzeltme Sihirbazı aracını kullanın. Her işlemden sonra Düzeltme Sihirbazı'nın tanılama bölümünde ağ kalitesini kontrol edin.
  11. Düzeltme Sihirbazı'ndaki Otomatik Düzeltme işlemini kullanarak ters çevrilmiş normal parçaları, kesişen üçgenleri ve bozuk konturları kaldırın.
  12. Çakışan üçgenleri yenilerini tanımlayarak manuel olarak veya Deliği Normal Doldurma işlemi aracılığıyla otomatik olarak değiştirin.
  13. Keskin üçgenleri, küçük kenarları ve küçük kabukları filtreleme gibi işlemleri kullanarak ağ kalitesini iyileştirin.
  14. Ağ kalitesini iyileştirdikten sonra, LCN ve osteosit-dendritik membranların iki yüzeyini, manifold olmayan bir montaj kullanarak her iki parçaya ait tek bir yüzeyde (lakünar-kanaliküler akışkan boşluk) birleştirin.
  15. Remesh işlemini kullanarak lacunar-kanaliküler boşluğun hacimsel bir modelini oluşturun ve ardından bunu bir STL dosyası olarak dışa aktarın. Dışa aktarma bölümünde nesne ölçeğini mikrometre cinsinden olacak şekilde ayarlayın.

4. 3D görüntü tabanlı işleme yazılımında ve 3D veri optimizasyon yazılımında geometri modifikasyon tekniği

NOT: Geometri modifikasyon tekniği, yaşlanma veya kemik hastalığına bağlı olarak kanaliküler yoğunluk ve çap ve lakunar-kanaliküler kalınlık gibi osteosit morfolojisindeki değişiklikleri modellemek için kullanılır.

  1. Temel model olarak genç osteositi seçin ve morfolojik değişiklikler uygulayarak diğer farklı osteosit modelleri oluşturmak için değiştirin.
  2. 3D görüntü tabanlı işleme yazılımında görüntü eşiğini değiştirerek temel modelden farklı kanaliküler yoğunluklara sahip bir osteosit modeli oluşturun.
    1. Görüntünün ışık yoğunluğunu azaltmak ve daha az kanaliküllü bir lakuna elde etmek için daha düşük bir eşik seçin. Eşikleme tekniğinin avantajı, lakuna şeklinin ve boyutunun aynı kalması ve sadece kanaliküler yoğunluğun etkisinin incelenmesidir. Şekil 2 , geometri modifikasyon tekniği kullanılarak genç osteositten oluşturulan simüle edilmiş yaşlı modeli göstermektedir.
  3. 3 boyutlu görüntü tabanlı işleme yazılımı ve 3 boyutlu veri optimizasyon yazılımında farklı lakünar-kanaliküler boşluk kalınlıklarına veya dendrit/kanal çaplarına sahip osteosit modelleri geliştirin. Sırasıyla Sarma veya Düzleştirme işlemleri ile daha büyük veya daha küçük osteosit modelleri oluşturun. Şekil 3 , genç osteositten geliştirilen değişmiş geometriye sahip altı osteosit modelini göstermektedir.

5. CFD analizi

NOT: Hacimsel osteosit modelleri oluşturulduktan sonra, simülasyon yazılımının CFX modülünde geometri, ağ ve kurulum dahil olmak üzere çeşitli adımlar gerçekleştirilir.

  1. Modelleri CFD analizine hazırlamak için simülasyon yazılımında bir Akışkan Akışı oluşturun.
  2. Geliştirilen konfokal görüntü tabanlı geometrileri, ANSYS SpaceClaim (3D modelleme aracı) olarak bilinen CFX'in geometri bölümüne aktarın. Ayarda birim boyutlarını nanometre olarak ayarlayın.
  3. Geometri, LCN ve osteosit-dendritik süreçlerin iki yüzü olarak görünür. Üst menüdeki Faset'e tıklayın ve kesişimler, keskin veya aşırı bağlı kenarlar ve her faset için köşeler, açıklıklar veya delikler gibi geometrik hataları kaldırın.
  4. Tek bir lakünar-kanaliküler boşluk gövdesi elde etmek için daha küçük faset ve osteosit-dendritik süreçleri daha büyük faset olan LCN'den azaltmak için Faset menüsünde Çıkar'a tıklayın. Ardından, oluşturulan fasete sağ tıklayın ve yüzleri birleştirmeden fasetlerden sağlam bir etki alanına dönüştürün. Şekil 4, lakünar-kanaliküler boşluğu temsil eden genç osteosit modelinin enine kesit alanını göstermektedir.
  5. Mesh'e tıklayın ve 0,06 μm'lik bir eleman boyutu kullanarak doğrusal tetrahedral elemanları seçin. Sonuçların ağ boyutundan bağımsız olduğundan emin olmak için küçük dendritik sistemde yeterli öğeye sahip olmak için ağı bir ağ yakınsama etüdü ile rafine edin.
  6. Yüzeyi seçin ve hayali küpün üst tarafındaki kanalcıkları sıvı girişleri olarak seçin. Box select'i kullanarak diğer beş yüzdeki kanalikülleri sıvı çıkışları olarak seçin.
  7. Bir sonraki adımda kurulumda daha hızlı yüklendiği için ağı (akıcı dosya formatı) dışa aktarın.
  8. Simülasyon yazılımında başka bir Akışkan Akışı oluşturun ve akıcı ağı CFX'in kurulum bölümüne aktarın. Sınır Ekle seçeneğini kullanarak giriş/çıkış olarak önceden seçilen yüzler için girişler ve çıkışlar için iki sınır koşulu tanımlayın.
  9. Fizyolojik koşulları taklit etmek için, girişlere ve çıkışlara sırasıyla 300 Pa ve 0 Pa'lık bir sıvı giriş basıncı uygulayın,19,20. Kalan yüzeylere, duvarların arayüzünde sıfır hıza sahip olan bu sıvıda kaymaz bir duruma sahip duvarlar olarak muamele edin. Sıvı, dendritler ve osteosit hücre gövdesi etrafındaki girişlerden akar ve çıkış olarak atanan diğer kanaliküllerden çıkar.
  10. İnterstisyel laminer sıvıyı, malzeme kütüphanesinden seçilen su9 olarak değerlendirin. Sorunda tanımlanmış bir ısı transferi olmadığı için Isı Transferi, Yanma ve Termal Radyasyon bölümlerini Yok olarak ayarlayın. Laminer bir sıvı9 olan LCN'de akışkan karakteristiği olarak Türbülans modunu seçin.
  11. Yazılımı, gönderim türü olarak Çift Duyarlık ve Doğrudan Başlatma'yı kullanarak çalıştırın. Kalıntılar düşüp sabit hale gelene kadar kütle ve momentumu izleyin. Çözüm yakınsamasından sonra, CFD yazılımının CFD-post bölümünü kullanarak FFSS verilerini ölçün.

6. CFD sonrası işleme

  1. Osteositler ve dendritleri tarafından deneyimlenen FFSS'yi tasvir etmek için, CFD yazılımının sonuçlar bölümüne yeni bir kontur ekleyin. Etki alanındaki değişken olarak osteosit-dendritik membranlar üzerindeki duvar makasını seçerek bir FFSS konturu oluşturun.
    NOT: Dendritik membranlarda yüksek FFSS'yi daha iyi göstermek için, FFSS'nin min/maks değerlerini değiştirmek için FFSS aralığı Kullanıcı Tarafından Belirlendi olarak ayarlanmıştır.
  2. Girişlerden başlayarak lakunar-kanaliküler alanın içine bir hız akış çizgileri konturu yerleştirin. Örneklemeyi eşit aralıklı olarak ayarlayın ve nokta sayısını 2500 olarak seçin. CFD yazılımındaki bir animasyon bölümü, hız akış grafiğini kullanarak sıvı parçacıklarının lakünar-kanaliküler boşluklar içinde nasıl aktığını 3D olarak doğru bir şekilde gösterir.
  3. Özellikle çeşitli osteosit modellerinin olduğu yerlerde (yani, genç ve yaşlı) geometrik parametrelere dayalı olarak FFSS'nin büyüklüğünü veya hızını analiz etmek için CFD yazılımındaki Fonksiyon Hesaplayıcı aracını kullanın. Lakünar-kanaliküler boşluğun hacmini ve yüzey alanını, maksimum, minimum veya ortalama FFSS değerleriyle birlikte geometrik parametreler olarak ölçün.

Sonuçlar

Bu protokol, bir osteositin ve dendritik süreçlerinin mekanik yükleme nedeniyle maruz kaldığı sıvı akış kesme gerilimi miktarını araştırmak için konfokal türevli osteosit modellerinin nasıl geliştirileceğini açıklar. Genç ve yaşlı konfokal görüntü tabanlı osteosit modelleri oluşturmak için yaşlı bir fare ve genç bir C57BL6 fare seçildi. Yaşlanma veya kemik hastalığına bağlı LCN morfolojisinin değişimini incelemek için geometri modifikasyon tekni...

Tartışmalar

Bu protokol, osteositlerin görselleştirilmesi ve hesaplamalı modellemesi için konfokal bir görüntüleme tekniğini ana hatlarıyla belirtir. Konfokal görüntülemeden önce kemik örneklerinin kesit alınması ve boyanması için kemik hazırlama işlemi yapılır. 100x büyütmeli konfokal görüntüler, osteositlerin ve lakunar-kanaliküler boşluğun bilgisayar modellerini geliştirmek için çeşitli yazılımlara aktarılır. Son olarak, kemik matriksindeki osteositlere eriş...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, Ulusal Bilim Vakfı'na (NSF, ödül numarası NSF-CMMI-1662284 PI: T Ganesh), Ulusal Sağlık Enstitüsü'ne (NIH - NIA P01 AG039355 PI: LF Bonewald) ve (NIH / SIG S10OD021665 ve S10RR027668 PI: SL Dallas) ve Missouri-Kansas City Üniversitesi Lisansüstü Çalışmalar Okulu Araştırma Hibe Programı'na teşekkür eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,200 Grit sandpaperBuehler30-5170-012-100
3-Matic softwareMaterialisehttps://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic3D data optimization software
600 grit sandpaperBuehler30-5118-600-100
800 Grit sandpaperBuehler30-5170-800-100
ANSYS softwareANSYShttps://www.ansys.com/simulation software
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)Sigma-AldrichF7250
ImageJ softwarehttps://imagej.net/ij/
Immersion Oil for MicroscopesLeica Microsystems195371-10-9
Leica TCS Sp5 II confocal microscope Leica MicrosystemsTCS Sp5 II 
Leitz 1600 inner hole diamond sawLeica 
MIMICS Innovation Suite softwareMaterialisehttps://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite3D image-based processing software
Permount mount mediumFisher scientificSP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic KitBuehler20-3560
Single Platform Laboratory ShakerReliable scientific INCModel 55S

Referanslar

  1. Li, M. C. M., Chow, S. K. H., Wong, R. M. Y., Qin, L., Cheung, W. H. The role of osteocytes-specific molecular mechanism in regulation of mechanotransduction - A systematic review. J Orthop Translat. 29, 1-9 (2021).
  2. Fritton, S. P., Weinbaum, S. Fluid and solute transport in bone: Flow-induced mechanotransduction. Annu Rev Fluid Mech. 41, 347-374 (2009).
  3. Klein-Nulend, J., Bacabac, R. G., Bakker, A. D. Mechanical loading and how it affects bone cells: the role of the osteocyte cytoskeleton in maintaining our skeleton. Eur Cell Mater. 24, 278-291 (2012).
  4. Knothe Tate, M. L. "Whither flows the fluid in bone?" An osteocyte's perspective. J Biomech. 36 (10), 1409-1424 (2003).
  5. Tiede-Lewis, L. M., et al. Degeneration of the osteocyte network in the C57BL/6 mouse model of aging. Aging (Albany NY). 9 (10), 2190-2208 (2017).
  6. Lai, X., et al. The dependences of osteocyte network on bone compartment, age, and disease. Bone Res. 3 (1), 15009 (2015).
  7. Schurman, C. A., Verbruggen, S. W., Alliston, T. Disrupted osteocyte connectivity and pericellular fluid flow in bone with aging and defective TGF-β signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (25), e2023999118 (2021).
  8. van Tol, A. F., et al. The mechanoresponse of bone is closely related to the osteocyte lacunocanalicular network architecture. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (51), 32251-32259 (2020).
  9. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: a fluid-structure interaction approach. Biomech Model Mechanobiol. 13 (1), 85-97 (2014).
  10. Ganesh, T., Laughrey, L. E., Niroobakhsh, M., Lara-Castillo, N. Multiscale finite element modeling of mechanical strains and fluid flow in osteocyte lacunocanalicular system. Bone. 137, 115328 (2020).
  11. Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Serial FIB/SEM imaging for quantitative 3D assessment of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 49 (2), 304-311 (2011).
  12. Kamioka, H., et al. A method for observing silver-stained osteocytes in situ in 3-microm sections using ultra-high voltage electron microscopy tomography. Microsc Microanal. 15 (5), 377-383 (2009).
  13. Ciani, C., Doty, S. B., Fritton, S. P. An effective histological staining process to visualize bone interstitial fluid space using confocal microscopy. Bone. 44 (5), 1015-1017 (2009).
  14. Sharma, D., et al. Alterations in the osteocyte lacunar-canalicular microenvironment due to estrogen deficiency. Bone. 51 (3), 488-497 (2012).
  15. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Strain amplification in bone mechanobiology: a computational investigation of the in vivo mechanics of osteocytes. J R Soc Interface. 9 (75), 2735-2744 (2012).
  16. Goggin, P. M., Zygalakis, K. C., Oreffo, R. O., Schneider, P. High-resolution 3D imaging of osteocytes and computational modelling in mechanobiology: insights on bone development, ageing, health and disease. Eur Cell Mater. 31, 264-295 (2016).
  17. Kamioka, H., et al. Microscale fluid flow analysis in a human osteocyte canaliculus using a realistic high-resolution image-based three-dimensional model. Integr Biol. 4 (10), 1198-1206 (2012).
  18. Wang, L., et al. In situ measurement of solute transport in the bone lacunar-canalicular system. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (33), 11911-11916 (2005).
  19. Manfredini, P., Cocchetti, G., Maier, G., Redaelli, A., Montevecchi, F. M. Poroelastic finite element analysis of a bone specimen under cyclic loading. J Biomech. 32 (2), 135-144 (1999).
  20. Steck, R., Niederer, P., Knothe Tate, M. L. A finite element analysis for the prediction of load-induced fluid flow and mechanochemical transduction in bone. J Theor Biol. 220 (2), 249-259 (2003).
  21. You, L., Cowin, S. C., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for strain amplification in the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix. J Biomech. 34 (11), 1375-1386 (2001).
  22. Weinbaum, S., Cowin, S. C., Zeng, Y. A model for the excitation of osteocytes by mechanical loading-induced bone fluid shear stresses. J Biomech. 27 (3), 339-360 (1994).
  23. Niroobakhsh, M., Laughrey, L. E., Dallas, S. L., Johnson, M. L., Ganesh, T. Computational modeling based on confocal imaging predicts changes in osteocyte and dendrite shear stress due to canalicular loss with aging. Biomech Model Mechanobiol. 23 (1), 129-143 (2024).
  24. Dallas, S. L., Moore, D. S. Using confocal imaging approaches to understand the structure and function of osteocytes and the lacunocanalicular network. Bone. 138, 115463 (2020).
  25. Boyde, A., Wolfe, L. A., Maly, M., Jones, S. J. Vital confocal microscopy in bone. Scanning. 17 (2), 72-85 (1995).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 213Mekanik GerinimlerAk kan Ak Kayma Gerilmesi FFSSHesaplamal Ak kanlar Dinami i CFDKonfokal MikroskopiLak ner Kanalik ler A LCN3D ModellemeMIMICS Yaz l m3 Matic Yaz l mANSYS Yaz l mANSYS CFXKayma Gerinimi De erleriMekanosensasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır