Yaralı PC12 Hücrelerini Tedavi Etmek için İki Bitki Kombinasyonu Stratejisini Keşfetmek

Özet

Bu protokol, yaralı PC12 hücrelerini tedavi etmek için iki bitkinin bir kombinasyon stratejisini sağlar. Protokol, geleneksel Çin tıbbının (TCM) en iyi uygulama modunu optimize etmek için bir referans sağlar.

Özet

Serebral iskemi tedavisinde geleneksel Çin tıbbı (TCM) kombinasyonunun avantajları göz önüne alındığında, yaralı PC12 hücrelerini tedavi etmek için iki bitki kombinasyonu stratejisini araştırmak için preparat kombinasyonu ve bileşen kombinasyonu arasındaki etkinlik ve mekanizmadaki farklılıkları inceledik. _PC12 hücrelerinin oksidatif hasarını indüklemek için glikozsuz bir ortam ile kombine edilmiş kobalt klorür (CoCl 2) kullanılmıştır. Daha sonra, Astragalus mongholicus (Ast) ve Erigeron breviscapus (Eri ) enjeksiyonunun optimal kombinasyonu seçildi ve PC12 hücreleri üzerindeki güvenli ve etkili konsantrasyonları tarandıktan sonra tek tip tasarım yöntemlerini takiben birleştirildi. Ayrıca, taranan bileşen kombinasyonu iki bitkide 10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarin ve 75 μM klorojenik asit içerir. Daha sonra, MTT, Annexin V-FITC / PI, immünofloresan ve Western blot analizi, preparat kombinasyonunun ve hasarlı PC12 hücreleri üzerindeki bileşen kombinasyonunun etkinliğini ve mekanizmasını değerlendirmek için kullanıldı. Sonuçlar, hücre pro-sağkalımı için en uygun preparat kombinasyonunun Ast enjeksiyonu ve 6: 1.8 (μM) konsantrasyonlu Eri kapsülü olduğunu göstermiştir. Bileşen kombinasyonu (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarin ve 75 μM klorojenik asit) preparat kombinasyonundan daha etkiliydi. Her iki kombinasyon da apoptotik hızı, kaspaz-3'ün floresan yoğunluğunu ve hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) seviyesini önemli ölçüde azalttı; Bu arada, p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax ve Nrf2'nin ifade seviyelerini yükselttiler. Bu etkiler bileşen kombinasyonunda daha belirgindi. Sonuç olarak, her iki kombinasyon da PC12 hücrelerinde glikozsuz bir ortam ile birlikte CoCl₂ tarafından indüklenen yaralanmayı inhibe edebilir ve böylece hücre sağkalımını teşvik edebilir. Bununla birlikte, bileşen kombinasyonunun preparat kombinasyonu üzerindeki etkinliği, oksidatif stres ve apoptoz ile ilgili PI3K / Akt / Nrf2 sinyal yolunun daha güçlü düzenlenmesinden kaynaklanıyor olabilir.

Giriş

Serebral hipoperfüzyonun neden olduğu kronik serebral iskemi, orta yaşlı ve yaşlı insanlarda sık görülen bir hastalıktır¹. Uzun süreli gizli iskemi hastalığı olarak ilerleyici veya kalıcı nörolojik disfonksiyona yol açabilir. Başlıca patolojik mekanizmalar arasında ilerleyici veya kalıcı nörolojik disfonksiyona yol açan hücre apoptozu ve oksidatif hasar; Alzheimer hastalığının, vasküler demansın ve diğer hastalıkların patolojik temelidir ve hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler. Bununla birlikte, modern tıpta kronik serebral iskemiyi tedavi etmek için hala ideal ilaçların eksikliği vardır². Aynı zamanda, Astragalus mongholicus (Ast) ve Erigeron breviscapus (Eri) kombinasyonu, geleneksel Çin tıbbının (TCM) klinik uygulamalarında yaygın olarak ^{kullanılmaktadır4}. Kombinasyon stratejisi, tek bir ilaçtan daha iyi olan serebral iskemi sonrası sinir fonksiyonunun iyileşmesini teşvik etmede önemli ölçüde gelişmiştir; Bununla birlikte, iki ilacın kombinasyonundaki dozaj oranında büyük farklılıklar vardır⁴. Etkili bileşenler ve etki mekanizması iyi tanımlanmamıştır, bu da klinik uygulamasını kısıtlayan temel konudur.

Önceki çalışmalar, sıçanlarda serebral iskeminin tedavisinde Ast enjeksiyonu ve Eri enjeksiyonunun hazırlık kombinasyonunun sinerjik etkisini göstermiştir. P-Akt proteininin ekspresyonunu yukarı düzenleyebilir ve B-lenfoblastoma 2 (Bcl-2) ailesi proteinlerinden biri olan ve apoptozu teşvik etme etkisine sahip olan Bcl-2 ilişkili ölüm promotörü (BAD) proteini ^5,6'nın ekspresyonunu aşağı regüle edebilir. Bununla birlikte, sinerjik etkisinin maddi temeli ve mekanizması açık değildir. Ayrıca, PC12 hücrelerinin yaralanma modeli CoCl₂ kombine glukozsuz ortam ile oluşturulmuş ve Ast ve Eri'deki optimal bileşen kombinasyonu taranmış ve tanımlanmıştır⁷.

Bu çalışmada, Ast ve Eri'nin etkili dozları, yaralı PC12 hücre modeli kullanılarak taranmıştır. İki ilacın optimal kombinasyonu, homojen tasarım yöntemi ile birlikte bu model kullanılarak taranır. Hücre modeli, yaralı PC12 hücrelerinde preparat kombinasyonunun ve bileşen kombinasyonunun etkileri ve mekanizmalarındaki farkı daha fazla değerlendirmek için kullanılır. Bu strateji, en iyi kombinasyon modunu belirlemek için PI3K / Akt / Nrf2 sinyal yolu aracılığıyla yaralı PC12 hücreleri üzerindeki iki tip kombinasyonun koruyucu etkisini ve düzenleyici mekanizmasını araştırmayı amaçlamaktadır. Bu çalışma, TCM'nin en iyi uygulama modunu optimize etmek için bir referans sunmaktadır.

Protokol

1. Reaktifin hazırlanması

1. 125 mL'lik steril bir kültür şişesine 90 mL DMEM yüksek şekerli ortam, 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 1 mL penisilin-streptomisin çözeltisi ekleyerek tam ortamı hazırlayın. Tüm ortamı karıştırın ve kapalı koşullar altında 4 ° C'de saklayın.
2. 8,4 mM'lik bir_{stok çözeltisi elde} etmek için 10 mL DMEM şekersiz ortama (tamamen çözülmüş) 0,02 g CoCl 2 tozu (doğru tartılmış) ekleyerek CoCl₂ çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 μm bakteri filtresiyle süzün, kapatın ve ışıktan 4 ° C'de saklayın.
   NOT: CoCl₂ kararsızdır ve ışıktan korunan hava geçirmez bir kapta saklanmalıdır; CoCl₂ çözeltisinin geçerlilik süresi 7 gündür.
3. Tris-Hcl tamponlu tuz çözeltisi (TBST) hazırlayın.
   1. 8 g sodyum klorür, 0,2 g potasyum klorür ve 3 g Tris-baz tartın. Onları 1 L'lik bir beherin içine ekleyin ve ardından karışımı çözmek için 1.000 mL RO suyu ekleyin.
   2. PH'ı 7,4'e ayarlayın, 1 mL Ara 20 ekleyin ve TBST çözeltisini elde etmek için iyice karıştırın.
      NOT: Ara 20, antikorların antijenlere spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için bir yüzey aktif madde görevi görür ve% 0.1 konsantrasyonda en iyi şekilde çalışır.
4. 5 mg / mL'lik bir stok çözeltisi elde etmek için 20 mL PBS çözeltisinde 0.1 g MTT tozu tartarak MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2)-2,5-difeniltetrazolyum bromür tuzu) çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 μm bakteri filtresiyle filtreleyin, kapatın ve bekleme moduna yerleştirilmiş olarak ışıktan 4 °C uzakta saklayın.
   NOT: MTT tozu kararsızdır ve nemi kolayca emer, bu nedenle ışıktan uzak kapalı ve kuru bir yerde saklanmalıdır. MTT çözümünün süresi 7 gün sonra dolar. MTT kanserojen bir etkiye sahiptir, bu nedenle ciltle doğrudan temastan kaçının.
5. Eri kapsül çözeltisini, kapsül kabuğunu çıkararak ve 100 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için (skutelarin konsantrasyonuna dayanarak) 10 mL DMEM şekersiz ortamda 0.18 g içeriği doğru bir şekilde tartarak hazırlayın. Çözeltiyi 0,2 μm bakteri filtresiyle süzün, kapatın ve 4 ° C'de hava geçirmez bir kapta saklayın.
   NOT: Scutellarin, Erigeron breviscapus'un ana aktif bileşenidir. Kapsüllerdeki scutellarin konsantrasyonu HPLC-UV tarafından 2.56 mg / g, yani 5.54 μmol / g⁸ olarak belirlenmiştir. Preparatın konsantrasyonu, scutellarin konsantrasyonuna göre hesaplanır. Bu, preparatın ve bileşenin farmakolojik aktivitesini değerlendirmek için uygundur.
6. 60 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için 15 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne 5 mL enjeksiyon ve 5 mL şekersiz DMEM ortamı ekleyerek Ast enjeksiyonunun çözeltisini hazırlayın (astragalosid A konsantrasyonuna dayanarak). Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir bakteri filtresinden süzün ve 4 ° C'de hava geçirmez bir kapta saklayın.
   NOT: Enjeksiyon hacmi her biri 10 mL'dir ve enjeksiyondaki astragalosid A konsantrasyonu HPLC-ELSD tarafından 0.094 mg / mL (yani, 120 μM)⁹ olarak belirlenmiştir. Hazırlık bir biyogüvenlik kabininde yapılmalı ve boyunca ışığa dayanıklı bir şekilde çalıştırılmalıdır. Enjeksiyon çözeltisinin ve şekersiz ortamın hacmi doğru bir şekilde ölçülmeli ve iyice karıştırılmalıdır.
7. Astragaloside A çözeltisini 7.85 mg astragaloside A standardını doğru bir şekilde tartarak ve 5.000 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için 2 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde tamamen çözerek bir çözelti hazırlayın. 0,22 μm bakteri filtresi ile filtreleyin ve 4 ° C'de hava geçirmez bir şekilde saklayın.
   NOT: Astragaloside Bir toz, şekersiz ortamda çözünmez. Çözeltiyi hazırlarken, sitotoksisite olmadığından emin olmak için DMSO'nun son deneysel konsantrasyonunu% 0.1'in altında tutmak için uygun miktarda DMSO ile çözün.
8. 5.000 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için 11.56 mg scutellarin standardını doğru bir şekilde tartarak ve 5 mL şekersiz DMEM ortamı ile tamamen çözerek scutellarin çözeltisini hazırlayın. 0,22 μm bakteri filtresi ile filtreleyin ve 4 ° C'de hava geçirmez bir şekilde saklayın.
9. 5.000 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için klorojenik asit çözeltisini 8.86 mg klorojenik asit standardını doğru ve tamamen tartarak 5 mL şekersiz DMEM ortamı ile tamamen çözündürerek hazırlayın. 0,22 μm bakteri filtresi ile filtreleyin ve 4 ° C'de hava geçirmez bir şekilde saklayın.
   NOT: Klorojenik asit tozu kararsızdır ve suyu kolayca emer. Mühürlenmeli ve ışıktan 4 ° C'de saklanmalıdır; tartım sırasında maruz kalma süresi en aza indirilmelidir.

2. Hücre canlılığı testi

1. PC12 hücrelerini elde edin ve% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de kültürleyin.
   NOT: Bu çalışmada, hücreler Çin Bilimler Akademisi'nden elde edilmiştir. PC12 hücreleri, nöroendokrin hücrelerin genel özelliklerine sahip olan ve nörofizyoloji ve nörofarmakolojide yaygın olarak kullanılan yapışkan hücrelerdir.
2. Hücreleri% 5 CO 2 ile desteklenmiş bir inkübatörde 37 ° C'de kültürleyin ve her_2-3 günde bir alt kültüre alın. Tüm deneyler için 4-8 pasajlarındaki hücreleri kullanın.
3. Hücre kültürü
   1. Logaritmik büyüme fazındaki PC12 hücrelerini (% 70-% 80 hücre akıtı) 1 mL tripsin (% 0.25) ile tedavi edin ve hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler yuvarlaklaştığında, tam ortamın 3 mL'sini ekleyerek tripsin sindirimini durdurun.
   2. Hücreleri steril bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 840 x g'de santrifüj edin. Süpernatanı atın, tam ortamla yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından bir akış sitometresi kullanarak hücre sayısını sayın.
      1. Akış sitometrisi yazılımını başlatın, sayım ayarında hücre çözeltisinin karşılık gelen seyreltme katını seçin ve hücre örneğini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünden yükledikten sonra Yoğunluk Grafiği'ne tıklayın.
      2. Hücre popülasyonunu X ekseni ve Y ekseninden uzağa daire içine alın, şeklin altındaki veri tablosunu sağ tıklatın ve X, Y, Count ve Abs Count'u seçin. Veri tablosundaki Abs Count altındaki veriler, hücre sayımı sonucunu verir.
   3. Hücre konsantrasyonunu 1 x 10 5 hücre / mL'ye ayarlayın, 96 delikli plakalarda 100 μL / kuyucuk aşılayın ve 24 saat boyunca bir inkübatörde 37 ° C'de ve% ⁵ CO 2'de kültür yapın.
4. Normal PC12 hücrelerinde iki ilacın güvenli konsantrasyonlarının taranması
   1. Hücreleri adım 2.1-2.2'de açıklandığı gibi kültürleyin. Süpernatanı atın ve normal hücreleri Ast enjeksiyonu (4, 8, 12, 16, 20 ve 24 μM) ve Eri kapsülünün (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 ve 20 μM) farklı son konsantrasyonlarıyla tedavi edin. Her grubun altı replikasyon kuyusunu 24 saat boyunca tedavi edin.
      NOT: İlaçlar, ilacın nihai konsantrasyonunu elde etmek için ortama eklenir (adım 2.4.1'de belirtilmiştir) ve daha sonra her bir kuyucuğa eşit miktarda ortam eklenir. Süper nantantı aspire ederken, kuyunun altındaki hücrelerle temas etmesini önlemek için pipet ucu kuyu duvarına hafifçe yerleştirilmelidir. Farklı çözeltiler eklerken, bunları kuyucukların kenarları boyunca nazikçe ve hızlı bir şekilde ekleyin ve deneysel sonuçları etkilememek için pipet tabancası kafasını değiştirirken dikkat edin.
   2. Süpernatanı atın, her bir oyuğa 120 μL MTT çözeltisi (1 mg / mL) ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edin.
   3. Kuluçkadan sonra, süpernatantı tekrar atın ve her bir kuyucuğa 150 μL DMSO ekleyin. Bir vorteks osilatör kullanarak plakayı 240 kez / dak hızında (dakikada yatay titreşim sayısı) 10 dakika boyunca sallayın.
   4. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak her numunenin emiciliğini 490 nm'de ölçün. Tedavi edilen grubun absorbansı / normal grubun absorbansı (kontrol) x 100 olan hücre canlılığını hesaplayın (%).
      NOT: MTT çözümünün geçerlilik süresi içinde olduğundan emin olun; renk değiştiyse (koyu yeşile), kullanılamaz. Hücrelerin emilimini test ederken, diğer reaktiflerin girişimini ortadan kaldırmak için boş bir kuyu (kültür ortamı ve MTT, hücre veya ilaç olmadan) ayarlanmalıdır. Her bir oyuğa 150 μL DMSO hacmi eklenir ve mavi-mor kristalleri daha iyi çözmek için 10 dakika çalkalanır. Sonuçların doğruluğunu sağlamak için absorbans mümkün olan en kısa sürede tespit edilmelidir.
5. Yaralı PC12 hücreleri üzerinde iki ilacın etkili konsantrasyonlarının taranması
   1. Hücreleri 2.1-2.2 adımlarında belirtildiği gibi 24 saat boyunca kültürleyin, süpernatanı atın ve daha sonra hücreleri şekersiz ortamla birlikte 20 μL / CoCl₂ (0.4 mM) kuyucuğu ile tedavi edin.
   2. Aynı anda hücreleri 100 μL / kuyucuk Ast enjeksiyonu (son konsantrasyonlar 2, 6, 8, 10 ve 12 μM) veya 100 μL Eri kapsülü (son konsantrasyonlar 1, 2, 3, 4 ve 5 μM) ile 37 ° C'de 24 saat daha tedavi edin. Kontrol grubuna 120 μL/kuyucuk dolusu komple ortam ekleyin.
      NOT: CoCl₂ , hücrelerde hipoksik koşulları indükler.
   3. MTT yöntemiyle her numunenin emiciliğini ölçün ve daha önce adım 2.4.2 ve 2.4.3'te açıklandığı gibi hücre canlılığını hesaplayın.
6. Homojen tasarım yöntemine dayalı iki ilacın optimal kombinasyonunun taranması
   NOT: Astragalus enjeksiyonu ve breviscapus kapsülünün etkili konsantrasyon aralığı elde edildikten sonra, iki ilacın altı farklı kombinasyonunu elde etmek için tek tip tasarım_{yöntemi U 7} (7⁴) tablosu kullanılmıştır. Ast enjeksiyonu: Eri kapsül: 1) 2: 2.6 μM, 2) 4: 5 μM, 3) 6: 1.8 μM, 4) 8: 4.2 μM, 5) 10: 1 μM ve 6) 12: 3.4 μM.
   1. Hücreleri yukarıda adım 2.3.1'de açıklandığı gibi kültürleyin ve yaralı PC12 hücrelerine yukarıda belirtildiği gibi Ast enjeksiyonunun altı orantılı konsantrasyonu: Eri kapsülü ile tedavi edin.
   2. Hücreleri 24 saat boyunca tedavi edin ve daha önce 2.4.2 ve 2.4.3 numaralı adımlarda açıklandığı gibi hücre canlılığını hesaplayın.
7. İki optimal kombinasyonun yaralı PC12 hücreleri üzerindeki koruyucu etkisinin değerlendirilmesi
   NOT: Optimal preparat kombinasyonunu (Ast enjeksiyonu: 6:1.8 μM'lik Eri kapsülü) ve optimal bileşen kombinasyonu^7'yi (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarin ve 75 μM klorojenik asit) elde ettikten sonra, yaralı PC12 hücreleri üzerindeki koruyucu etkilerini kontrol etmek için daha fazla değerlendirme yapılır.
   1. Hücreleri yukarıda adım 2.3.1'de açıklandığı gibi kültürleyin ve yaralı PC12 hücrelerini, yukarıdaki NOT'ta tartışıldığı gibi iki tip ilaç kombinasyonu ile tedavi edin.
   2. Hücreleri 24 saat boyunca tedavi edin ve daha önce 2.4.2 ve 2.4.3 numaralı adımlarda açıklandığı gibi hücre canlılığını hesaplayın.

3. Apoptoz oranı için Ek V-FITC/PI testi

1. PC12 hücrelerini 12 delikli bir plakada 1.3 x 10⁵ hücre/kuyu konsantrasyonunda tohumlayın ve 24 saat boyunca 37 °C'de kültürleyin.
2. Hücreleri gruplandırın: kontrol grubu, model grubu ve iki ilaç kombinasyonu. Kontrol grubuna 1,2 mL/kuyucuk dolusu tam ortam ekleyin, model grubuna 0,4 mM CoCl₂ içeren 1,2 mL/kutucuk ortam ekleyin ve 0,4 mM CoCl 2 içeren iki kombinasyonun her birinin_1,2 mL/kuyucuğu ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de 24 saat daha inkübe edin.
3. İlaç tedavisini takiben, hücreleri 250 μL / iyi tripsin ile tedavi edin, hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde aktarın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 840 xg'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti bağlayıcı tamponun 500 μL'sinde yeniden askıya alın.
   1. RT'de 15 dakika boyunca karanlıktaki hücreleri 5 μL Ek V-FITC ve 10 μL propidium iyodür (PI) ile inkübe edin ve ardından akış sitometrisi ile apoptozu kontrol edin. Her grupta üç çoğaltma kuyusu ayarlayın.
      NOT: Bu testte kullanılan tripsin EDTA içeremez, çünkü EDTA, kalsiyum iyonlarını bağlamak için ek V ile rekabet eden ve PI için ek afinitesini etkileyen bir metal iyonu şelatlama ajanıdır. Apoptoz meydana geldiğinde, başlangıçta hücre zarının iç tarafında bulunan fosfoserin, hücre yüzeyine dışa doğru döner ve Annexin V-FITC, yeşil floresan göstermek için membranın dışındaki fosfoserine seçici olarak bağlanır.
   2. Başlat menüsünde Otomatik Ücretlendirme'ye tıklayın, Seç kanalında FITC, PE, PerCP ve APC'yi seçin ve Ücretlendirme: Yükseklik'i seçin. İstatistiksel Öğe: Medyan'da Tamam'ı tıklatın. Adım 2.3.2'de belirtilen aynı hücre sayma yöntemiyle, hücre örneklerini toplayın, Yoğunluk Haritası'nı tıklatın ve etkili hücre popülasyonunu daire içine alın.
   3. X ekseni parametresi olarak FITC floresan ve Y ekseni parametresi olarak diğer floresan parametreleri ile bir yoğunluk haritası oluşturun. Başlat menüsündeki Ücret Matrisi'ne ve taşma matrisindeki Katsayı'ya tıklayın. Apoptoz oranının analizi için yoğunluk haritası bilgileri görüntülenir.

4. Kaspaz-3 jenerasyonunun immünofloresan tespiti

1. PC12 hücrelerini 8 x 10⁴ hücre/kapak kayması yoğunluğunda kapaklara tohumlayın ve 24 saat boyunca 37 °C'de 24 delikli plakalara yerleştirin. Hücreleri yukarıda adım 3.2'de belirtildiği gibi gruplandırın; her grup için üç adet çoğaltılmış coverslip ayarlayın.
2. İlaç tedavisini takiben, kapak kapaklarını her biri 5 dakika boyunca PBS (37 ° C) ile iki kez durulayın, 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve RT'de 20 dakika boyunca% 0.5 Triton X-100 ile geçirgenleştirin.
3. Hücreleri tekrar durulayın ve RT'de 1 saat boyunca% 10 keçi serumu ile bloke edin.
4. Her bir örtü kaymasını, 1x TBST'de 1:250 konsantrasyonda seyreltilmiş 200 μL primer antikor kaspaz-3 (apoptozun anahtar yürütücü proteini) ile inkübe edin, gece boyunca 4 ° C'de. 1x TBST ile yıkayın (her biri 3 dakika boyunca üç kez) ve karanlıkta RT'de 1 saat boyunca 200 μL ikincil antikor (1x TBST'de 1:300 seyreltme) ile inkübe edin.
   NOT: Floresan kolayca söndürülür; Bu nedenle, ikincil antikorun inkübasyonundan sonra, slaytlar ışıktan uzak tutulmalıdır. Birincil ve ikincil antikorlar ışıktan 4 °C uzakta saklanmalıdır.
5. 10 dakika boyunca kapak kapaklarına (çekirdekleri tespit etmek için) 300 μL DAPI (0,5 μg / mL) ekleyin ve hücreleri her biri 5 dakika boyunca 1x TBST ile üç kez yıkayın.
6. Floresan mikroskobun altındaki kapak kapaklarını gözlemleyin ve görüntüleri yakalayın¹⁰. Görüntüleme yazılımını kullanarak floresan yoğunluğunun istatistiksel analizini yapın.
   NOT: Kullanılan kızaklar ve kapak kapakları temiz ve steril olmalıdır. Boyama yaparken, boyama çözeltisinin pH'ına, konsantrasyonuna ve sıcaklığına dikkat edin ve floresan söndürme işleminden kaçının. Floresan mikroskop, cıva lambasını önceden ısıtmak için en az 15 dakika önceden açılmalı ve tekrar açılmadan önce 30 dakika boyunca kapatılmalıdır. Görüntü elde ederken, aynı boya aynı deney grubundaki pozlama parametreleri, sonuçların doğruluğunu sağlamak için tutarlı olmalıdır.

5. ROS seviyesinin immünofloresan testi

1. Hücreleri adım 4.1'de tartışıldığı gibi kültürleyin ve tedavi edin.
2. İlaç tedavisini takiben, her bir kapak kaymasını 3 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de 400 μL DCFH-DA (10 μM) ile inkübe edin.
   NOT: DCFH-DA, oksidatif stresin evrensel bir göstergesidir. Hücre zarı geçirgenliğine sahiptir ve floresan yoktur. Hücreye girdikten sonra, 2',7'-diklorodihidrofloresein (DCFH) üretmek için esteraz tarafından hidrolize edilir ve daha sonra güçlü bir floresan ürünü üretmek için hızla oksitlenir.
3. Hücreleri serumsuz DMEM ile tekrar yıkayın (her biri 3 dakika boyunca iki kez) ve floresan söndürme maddesini floresan mikroskobu altına ekledikten sonra hemen kapak kaymasını gözlemleyin. Görüntüleme yazılımı ile göreceli floresan yoğunluğunu hesaplayın.
   NOT: DCFH-DA probunu yükledikten sonra, hücreye girmeyen artık probu temizlediğinizden emin olun, aksi takdirde arka plan yükselecektir.

6. Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 ve Bax 11,12'nin protein ekspresyonunun batı lekesi tespiti

1. PC12 hücrelerini 6 delikli plakalarda 1 x 10⁶ hücre / kuyu konsantrasyonunda ve kültürü 24 saat boyunca 37 ° C'de aşılayın. Hücreleri adım 4.1'de yukarıda belirtildiği gibi gruplandırın ve tedavi edin ve her grupta üç çoğaltma kuyusu ayarlayın.
2. 24 saat boyunca ilaç tedavisinden sonra, hücreleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın ve hazırlanan lizis tamponunda 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Lizisten sonra, hücreleri 16.000 x g ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantları toplayın.
3. Protein konsantrasyonunu tespit edin ve Bradford testi ile talimatlara göre ayarlayın. Numuneleri seyreltin ve 10 dakika boyunca 100 ° C'de denatüre edin.
   NOT: Lizis tamponu, fosfataz inhibitörü, proteaz inhibitörü ve RIPA lizatından 1:1:50 hacim oranında oluşur. Kontrol grubunda 200 μL/kuyucuk lizis tamponu, diğer gruplarda ise 100 μL/kuyucuk lizis tamponu gereklidir. Genel olarak, kontrol, model ve iki tip kombinasyon grubunun protein konsantrasyonları sırasıyla 0.45 mg / mL, 0.25 mg / mL ve 0.32-0.39 mg / mL'dir; yükleme tamponu ile seyreltildikten sonra protein konsantrasyonları sırasıyla 0.36, 0.2 ve 0.256-0.312 mg / mL'dir.
4. Farklı moleküler ağırlıklara sahip proteinleri tespit etmek için, her şeride 25 μg protein yükleyin,% 12'lik bir SDS-PAGE elektroforezi çalıştırın ve jeli PVDF membranlarına aktarın.
   NOT: SDS jelin hazırlanması sırasında, kabarcıklar veya çözünmeyen parçacıklar olmadan tamamen karıştırılmalıdır; aksi takdirde düzensiz veya düzensiz bantlar oluşabilir. Membranları aktarırken, PVDF membranı ile jel arasında kabarcık olmadığından emin olun; aksi takdirde, şeritte beyaz lekeler görünecektir. Ek olarak, bu adım düşük sıcaklıklarda yapılmalı ve buz torbası her 30 dakikada bir değiştirilmelidir.
5. RT'de 1.5 saat boyunca membranları %5 yağsız süt ile bloke edin ve karşılık gelen birincil antikorların 5 mL'si (Nrf2 1:1.000, Akt 1:2.000, p-Akt 1:2.000, Bcl-2 1:5.000 ve Bax 1:1.000) ile 4 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. İç kontrol olarak β-aktin (1:5.000) antikoru kullanın.
6. Membranları TBST ile yıkayın (her biri 10 dakika boyunca üç kez), ardından RT'de 2 saat boyunca 5 mL ikincil HPR konjuge antikorları (1:5.000) ile inkübe edin.
   NOT: Antikorların seyreltme oranı keyfi olarak değiştirilmemeli ve membranlar, bandın arka plan renginin çok siyah olmasını önlemek için gereksinimlere tam olarak uygun olarak TBST ile yeterince yıkanmalıdır.
7. Son olarak, membranı tekrar TBST ile yıkayın ve protein bandı tespiti için kemilüminesan HRP substratı (üreticinin talimatlarına göre) ile muamele edin. Kemilüminesans görüntüleme sistemini kullanarak görüntüleri yakalayın ve karşılaştırmalı iç kontrol olarak β-aktin ile görüntüleme yazılımını kullanarak proteinlerin gri değerlerini ölçün.

Sonuçlar

Ast enjeksiyonu ve Eri kapsülünün optimal kombinasyonunun taranması Şekil 1'de gösterilmiştir. Ast enjeksiyonu ve Eri kapsülünün normal PC12 hücreleri üzerindeki hücre sağkalım hızı Şekil 1A'da gösterilmiştir. Hücre canlılığı, 12 μM'den (Şekil 1A) daha yüksek konsantrasyonlarda Ast enjeksiyonu ve 5 μM'den büyük konsantrasyonlarda Eri kapsülü ile% 95'ten düşüktü (Şekil 1A

Tartışmalar

Modern klinik pratikte serebral iskemi tedavisi için hala ideal ilaç eksikliği vardır². Qi'nin takviyesi ve kan dolaşımı yönteminin aktive edilmesi rehberliğinde, Ast, Eri ve diğer preparatlar TCM'nin klinik uygulamasında kombinasyon halinde kullanılmış ve iyi kapsamlı avantajlar elde etmişlerdir^13,14,15. Çok sayıda çalışma, Ast'ın kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini artırabilece...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300 series class II biosafety cabinet	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	1374
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide	Guangzhou saiguo biotech Company	1334GR001	MTT
ACEA NovoExpress 1.4.0	ACEA Biosciences, Inc	-
Akt	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	10176-2-AP
Analytical flow cytometry	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC apoptosis detection kit	Beyotime Biotechnology Company	C1062L
Astragalus injection	Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company	A03190612144	Ast injection
Astragaloside A	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	84687-43-4
Bax	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	60267-1-Ig
BCA protein quantification kit	Beyotime Biotechnology Company	P0012
Bcl-2	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	26593-1-AP
Carbon dioxide incubators	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	0816-2014
Caspase-3	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	19677-1-AP
Chlorogenic acid	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	327-97-9
Cobalt chloride hexahydrate	Merck Biotechnology, Inc.	7791-13-1	CoCl2
Dimethyl sulfoxide	Guangzhou saiguo biotech Company	2020112701	DMSO
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate	Chengdu Kolon Chemical Company	2020090101
DMEM high sugar medium	Thermo scientific Hyclone	2110050
DMEM sugar free medium	Beijing Solarbio life sciences Company	2029548
ECL luminous fluid	Lianshuo Biological Company	WBKLS0500
Electronic balance	Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China	FA1204
Electrophoresis instrument	Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd	1658026
Erigeron breviscapus capsule	Yunnan Biogu Pharmaceutical Company	Z53021671	Eri capsule
Fetal bovine serum	Four Seasons Institute of Biological Engineering	20210402	FBS
Fluorescent microscope	Olympms Corporation	IX71-F32PH
Gel imager	Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd	1708265
Goat anti-mouse secondary antibody	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	SA00001-1
Goat anti-rabbit secondary antibody	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	SA00001- 2
IBM SPSS Statistics version 26.0	International Business Machines Corporation, USA	-
ImageJ 1.8.0	National Institutes of Health, USA	-	imaging software
Immunol fluorescence staining kit	Beyotime Biotechnology Company	P0196
KCl	Chengdu Kolon Chemical Company	2021070901
Marker	Thermo Fisher Scientific Instruments Company	26616
Microplate reader	Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.	HH35L2018296
Motic Inverted microscope	Nanda Scientific Instruments Co.	AE2000LED
NaCl	Chengdu Kolon Chemical Company	2014081301
Nonfat milk	Beyotime Biotechnology Company	P0216
Nrf2	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	16396-1-AP
P-Akt	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
PC12 cells	Chinese Academy of Sciences	CBP60430
Penicillin-Streptomycin solution	Thermo scientific Hyclone	SV30010
Phosphatase protease inhibitor mixture	Beyotime Biotechnology Company	P1045
Potassium dihydrogen phosphate	Chengdu Kolon Chemical Company	2015082901
Reactive oxygen species assay kit	Beyotime Biotechnology Company	S0033S
RI-PA lysis solution	Beyotime Biotechnology Company	P0013B
Scutellarin	Chongqing Gao Ren Biotechnology Company	27740-01-8
SDS-PAGE sample loading buffer, 5x	Beyotime Biotechnology Company	P0015L
Sterile filter tips (0.22 µm)	Merck Biotechnology, Inc.	SLGP033RB
Tris-base	Guangzhou saiguo biotech Company	1115GR500	TBS
Trypsin	Thermo scientific Hyclone	J190013
Tween-20	Chengdu Kolon Chemical Company	2021051301
Vortex oscillator	OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China	VXMNAL
β-actin	Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc	66009-1-Ig