Modifiye Heterotopik Abdominal Kalp Transplantasyonu ve Sıçanlarda Yeni Bir Aort Yetersizliği Modeli

Özet

Bu çalışma, sıçanlarda yeni başlayanların öğrenebileceği ve uygulayabileceği tekrarlanabilir bir heterotopik abdominal kalp nakli tekniğini göstermektedir. Ek olarak, sıçanlarda yeni bir aort yetersizliği modeli, heterotopik abdominal kalp nakli yapılarak ve hasattan sonra bir kılavuz tel kullanılarak donörün aort kapağına zarar verilerek üretilir.

Özet

Son 50 yılda, birçok araştırmacı farelerde ve sıçanlarda heterotopik abdominal kalp nakli olduğunu ve cerrahi teknikte bazı farklılıklar olduğunu bildirmiştir. Miyokard korumasını güçlendirmek için transplantasyon prosedürünün değiştirilmesi, donörün kardiyak fonksiyonunu korurken iskemi süresini uzatabilir. Bu tekniğin kilit noktaları şunlardır: donörün kalbini boşaltmak için hasattan önce donörün abdominal aortunu transekte etmek; donörün koroner arterlerinin soğuk bir kardiyoplejik çözelti ile perfüze edilmesi; ve anastomoz prosedürü sırasında donörün kalbinin topikal olarak soğutulması. Sonuç olarak, bu prosedür kabul edilebilir iskemi süresini uzattığından, yeni başlayanlar bunu kolayca yapabilir ve yüksek bir başarı oranı elde edebilir.

Ayrıca, bu çalışmada, sağ karotis arterden bir kateter yerleştirilerek ve sürekli ekokardiyografik kılavuzluk altında doğal aort kapağının delinmesiyle oluşturulan, mevcut olandan farklı bir teknik kullanılarak yeni bir aort yetersizliği (AR) modeli oluşturulmuştur. Yeni AR modeli kullanılarak heterotopik abdominal kalp transplantasyonu yapıldı. Protokolde, donörün kalbi toplandıktan sonra, donörün brakiyosefalik arterine sert bir kılavuz tel yerleştirilir ve aort köküne doğru ilerletilir. Aort kapağı, direnç hissedildikten sonra bile kılavuz teli daha ileri itilerek delinir ve böylece AR indüklenir. Bu yöntemi kullanarak aort kapağına zarar vermek, geleneksel AR modelinde açıklanan prosedürden daha kolaydır. Ek olarak, bu yeni AR modeli alıcının dolaşımına katkıda bulunmaz; bu nedenle, bu yöntemin geleneksel prosedürden daha ciddi bir AR modeli üretmesi beklenmektedir.

Giriş

Sıçanlarda heterotopik abdominal kalp transplantasyonu ilk olarak 1964 yılında Abbott ve ^ark.1 tarafından bildirilmiştir ve akut ve kronik allogreft rejeksiyonu, kardiyak allogreft vaskülopatisi, iskemi-reperfüzyon hasarı ve kardiyak yeniden şekillenme 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Son 50 yılda prosedüre bazı değişiklikler eklenmiştir. Mevcut prosedürün temelleri aşağıdaki gibidir. Donörün asendan aortu ve pulmoner arteri (PA) sırasıyla alıcının abdominal aortuna ve inferior vena kavaya uçtan yana anastomoz edilir. Donörün sol atriyumu ve ventrikülü herhangi bir intrakaviter akım almamasına rağmen, kan donörün koroner sistemine akar; Bu nedenle, donörün kalbi kelepçeyi çözdükten sonra tekrar atmaya başlar.

Yüzlerce veya binlerce operasyonda tecrübesi olan bazı uzmanlar, heterotopik abdominal kalp nakli için kısa iskemi süresi ile yüksek bir başarı oranı bildirmişlerdir 2,3,4,5; Bununla birlikte, yeni başlayanlar için başlangıçtan itibaren kısa iskemi süresini elde etmek zordur. Yeterli kardiyoproteksiyon, donörün kalbinin iyi kalp kasılmasını sağlamak için önemli bir faktördür. Yetersiz miyokard koruması, donörün kalbini sertleştirebilir. Bu nedenle, donörün kalbinin korunmasını güçlendirmek için nakil prosedürünü değiştirdik. Bu çalışmanın amaçlarından biri, kabul edilebilir iskemi süresini uzattığı için yeni başlayanların kolaylıkla uygulayabileceği, tekrarlanabilir heterotopik abdominal kalp nakli prosedürünü göstermektir.

Ek olarak, bazı araştırmacılar sıçanlarda ajanların sol ventrikül (LV) yeniden şekillenmesi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılan bir aort yetersizliği (AR) modeli bildirmişlerdir ^12,13,14,15. Konvansiyonel prosedür aşağıdakileri içerir: (1) anestezi sonrası sağ karotis arteri açığa çıkarmak için sağ lateral boyun insizyonu yapılır; (2) bir kateter bu damardan kanüle edilir ve aort köküne doğru ilerletilir; ve (3) AR, sürekli ekokardiyografik kılavuzluk altında doğal aort kapağının delinmesiyle indüklenir.

Bununla birlikte, ekokardiyografi probunu tutarken aort kapağını delmek ve ekokardiyogram ile yükselen aort, aort kapağı ve kateterin iyi bir görünümünü elde etmek zordur. Ayrıca akut AR sonrası gelişen kardiyak yetmezlik de bir başka komplikasyondur. Bu nedenle, bu zorlukları çözmek için bu çalışmada kolayca oluşturulabilen ve alıcının dolaşımına katkıda bulunmayan yeni bir AR modeli oluşturulmuştur. Bu çalışmanın diğer amacı, hasat sonrası kılavuz tel kullanarak heterotopik abdominal kalp transplantasyonu kullanılarak ve donörün aort kapağına zarar vererek AR modeli oluşturmaktır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Japonya Hükümeti Çevre Bakanlığı tarafından "Hayvanların Refahı ve Yönetimi Hakkında Yasanın Bir Taslağı" ve "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı, Tutulması ve Ağrılarının Azaltılmasına İlişkin Standartlar" ve Japonya Bilim Konseyi tarafından "Hayvan Deneylerinin Uygun Şekilde Yürütülmesi İçin Kılavuz"^16'ya uygun olarak yürütülmüştür^{. 17,18}. Hayvan protokolleri, Tokyo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (M-P19-065) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Sıçanlarda heterotopik abdominal kalp transplantasyonu

NOT: Heterotopik abdominal kalp transplantasyonları 7-9 haftalık erkek Jcl:Wistar sıçanlarında yapıldı. Prosedürü gerçekleştirmek için 6.7x ila 45x büyütmeli bir mikroskop kullanıldı. Cerrahi aletler sterilizasyon için otoklavlandı.

1. Donör kalp hasadı
   1. Donör sıçanı intraperitoneal medetomidin (0.15 mg/kg), midazolam (2.0 mg/kg) ve butorphanol (2.5 mg/kg) enjeksiyonu ile uyuşturun.
   2. Sıçanı, ameliyat tahtasının üzerindeki bir ısıtma yastığı üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve uzuvları elastik bantlar kullanarak sabitleyin. Elektrikli tıraş makinesi ve tüy dökücü krem ile mümkün olduğunca fazla kürk çıkarın. Daha sonra, çalışma alanını dezenfeksiyon için üç kez iyot ve% 70 alkol ovma ile temizleyin.
   3. Makasla yaklaşık 1 cm'lik küçük bir kesi yapın, ardından karın bölgesine heparin uygulayın (100 U).
   4. Karın insizyonunu eksternal üretral meatusun üstünden makasla subksifoid sürece uzunlamasına uzatın.
   5. Karın aortunu sterilize edilmiş pamuklu çubuklarla açığa çıkarın ve donörün kalbini boşaltmak için makasla transekt yapın.
   6. Ön göğüs duvarı boyunca diyaframı kesin ve torasik duvarı makas kullanarak V şeklinde bir kesi ile açın. Başın yanındaki ön göğüs duvarını yükseltin ve pimlerle sabitleyin.
   7. Sulu buz kullanarak kalbin topikal soğutmasını başlatın.
   8. İnferior vena kava'yı 5-0 ipek sütür ile bantlayın.
   9. Timüsü makasla çıkarın ve daha sonra kalpten kaynaklanan yükselen aort ve PA'yı tanımlayın. Yükselen aort ve PA sırasıyla sağda ve soldadır.
   10. Ek ekssanguinasyon için aort arkından kaynaklanan brakiyosefalik arteri Potts makası ile transekte edin.
   11. İnferior vena kavaya 23 G'lık bir iğne yerleştirin ve 2-3 mL soğuk modifiye Krebs-Henseleit kardiyoplejik çözeltisi uygulayın. Uygulamadan sonra, kalp yavaş yavaş atmayı durdurur. Aynı zamanda, kalpteki kanın mümkün olduğunca boşaltıldığından emin olun.
   12. İnferior vena kava'yı 5-0 ipek ile bağlayın ve Potts makası kullanarak ligatüre distal olarak bölün.
   13. Sağ akciğer ile yemek borusu arasındaki bağ dokusunu makasla diseke ettikten sonra, sağ akciğerin hilumunu 5-0 ipek ile bağlayın ve makasla bağa distal olarak bölün.
   14. Sağ superior vena kava'yı 5-0 ipek ile yalanlayın ve Potts makası ile bağa distal olarak bölün.
   15. Potts makaslarının bir bıçağını enine sinüse yerleştirin ve yükselen aort ve PA en bloğunu mümkün olduğunca distal olarak bölün.
   16. Sol superior vena kava'yı 5-0'lık bir ipek sütür ile ligate edin ve Potts makası ile ligatüre distal olarak ve azigos damarına yakınlaştırın.
   17. Sol akciğer ile yemek borusu arasındaki bağ dokusunu makasla diseke ettikten sonra, sol akciğerin hilumunu 5-0 ipek dikişle bağlayın ve distal olarak makasla bağa bölün.
   18. Kalbin tabanını 5-0 ipek bir sütür ile açın ve makasla bağa distal olarak bölün. Bu ipek, donörün kalbinin anastomozu sırasında donörün kalbini geri çekmek için kullanılır. Şu anda, donörün kalbini perikardiyal boşluktan çıkarın.
   19. Donörün kalbini sulu buz ve soğuk normal salin ile dolu tabağa yerleştirdikten sonra, mikro cımbız kullanarak yükselen aort ve PA arasındaki bağ dokusunu diseke edin.
   20. Koroner arterlerin kırmızı rengi azalıncaya kadar yükselen aortun ostiumunu cımbızla sıkıştırarak yükselen aorttan koroner arterlere 2-3 mL soğuk modifiye Krebs-Henseleit kardiyoplejik solüsyonu perfüze edin.
   21. Donörün kalbini soğuk modifiye edilmiş Krebs-Henseleit kardiyoplejik çözeltisinde saklayın.
2. Alıcı hazırlığı
   NOT: Donörün kalbini toplamadan önce, alıcı hazırlığını tamamlayın.
   1. Alıcı sıçanı intraperitoneal medetomidin (0.15 mg/kg), midazolam (2.0 mg/kg) ve butorphanol (2.5 mg/kg) enjeksiyonu ile uyuşturun. 16 G intravenöz kateter kullanılarak endotrakeal entübasyondan sonra, sevofluran inhalasyonu yoluyla anesteziyi sürdürün (% 5.0'da indüksiyon ve% 2.5'te 0.3 L / dak'lık bir_O2 akış hızı ile% 2.5'te bakım).
   2. Sıçanı, ameliyat tahtasının üzerine yerleştirilmiş bir ısıtma yastığı üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve uzuvları elastik bantlar kullanarak sabitleyin. Elektrikli tıraş makinesi ve tüy dökücü krem ile mümkün olduğunca fazla kürk çıkarın. Ek olarak, cerrahi bölgeyi iyot ve% 70 alkol ovma ile dezenfeksiyon için üç kez temizleyin.
   3. Makas kullanarak, subksifoid sürece dış üretral meatusun yaklaşık 6-7 cm yukarısında bir orta hat karın insizyonu yapın.
   4. İnce bağırsağı sterilize edilmiş pamuklu çubuklarla alıcının sağ üst tarafına doğru geri çekin ve ılık normal tuzlu suyla ıslatılmış gazlı bezle sarın.
   5. İnce bağırsak ve kolon arasındaki bağ dokusunu makasla diseke edin.
   6. Kolonun avasküler bölgesini makasla disseke edin ve kolonu sola çekmek için iki şerit benzeri gazlı bez parçasıyla bantlayın.
   7. Abdominal aort ve inferior vena kava'yı sterilize pamuklu çubuklarla açığa çıkarın. Her iki geminin nispeten büyük dallarını 9-0 naylon ile bağlayın ve bölün.
3. Heterotopik kalp nakli
   1. Donör kalp transplantasyonunu başlatmadan önce alıcının karnına (100 U) heparin uygulayın.
   2. Abdominal aort ve inferior vena kava en bloc'u yandan ısıran kelepçe forsepsleri ile kelepçeleyin.
   3. Karın aortunu 90 ° bükülmüş 23 G iğne ile delin ve deliği Potts makası ile uzunlamasına donörün yükselen aortunun çapına kadar uzatın. Daha sonra, pıhtıları gidermek için lümeni heparinize normal salin (10 U / mL) ile yıkayın.
   4. Sterilize edilmiş küçük plakayı alıcının abdominal aortunun ve inferior vena kavanın sağ tarafına yerleştirin. Donörün kalbini, her 5 dakikada bir yenilenmesi gereken sulu buz ve soğuk normal salin ile dolu tabağa yerleştirin.
   5. Donörün yükselen aortunu alıcının abdominal aortuna saat 12 ve saat 6 pozisyonlarında iki adet 9-0 naylon kalma dikişiyle bağlayın.
   6. Çalışma kartını saat yönünde 90° döndürün.
   7. Alıcının abdominal aortunun sol tarafını ve donörün yükselen aortunu kaudalden kraniyal yöne doğru 9-0 naylon sütür kullanarak anastomoz yapın ve saat 12 pozisyonunda 9-0 naylon kalma sütürü ile bağlayın (toplam yedi ila sekiz dikiş).
   8. Çalışma kartını saat yönünün tersine 180° döndürün. Donörün kalbini alıcının abdominal aortunun ve inferior vena kava'nın soluna translokasyonu. Donörün kalbinin tabanını bağlarken kullanılan 5-0 ipek sütür ile donörün kalbini sol tarafa doğru geri çekmek kolaydır (adım 1.1.18).
   9. Alıcının abdominal aortunun sağ tarafını ve donörün yükselen aortunu kraniyalden kaudal yöne doğru 9-0 naylon sütür kullanarak anastomoz yapın ve saat 6 pozisyonunda 9-0 naylon kalma sütürü ile bağlayın (toplam yedi ila sekiz dikiş).
   10. Donörün yükselen aortu ile alıcının abdominal aortu arasındaki anastomoza distal olarak 90° bükülmüş 23 G iğne kullanarak inferior vena kavayı delin ve deliği Potts makası ile donörün PA'sının çapından daha büyük olacak şekilde uzunlamasına uzatın. Daha sonra, pıhtıları gidermek için lümeni heparinize normal salin ile yıkayın.
   11. Donörün PA'sını, saat 6 pozisyonunda 9-0 naylon kalma sütürü kullanarak alıcının inferior vena kavasına bağlayın.
   12. Anastomoz, alıcının inferior vena kava sol tarafı ve donörün PA'sı, kaudalden kraniyal yöne doğru 9-0 naylon sütür ile (toplam yedi ila sekiz sütür).
   13. Donörün PA'sını alıcının inferior vena kavasına saat 12 pozisyonunda 9-0 naylon kalma dikişi ile bağlayın. Ek olarak, bu kalma sütürünü donörün PA'sı ile alıcının inferior vena kavası arasındaki anastomozun sol tarafındaki 9-0 naylona bağlayın.
   14. Alıcının inferior vena kava ve donörün PA'sının sağ tarafını kraniyalden kaudal yöne doğru 9-0 naylon sütür kullanarak anastomoz yapın ve saat 6 pozisyonunda kalan sütür ile bağlayın (toplam 10-12 dikiş).
   15. Her iki anastomoza hemostatik ajanlar uygulayın ve etraflarına gazlı bez yerleştirin.
   16. Yan ısırma kelepçesi forsepslerini serbest bıraktıktan sonra, hemostazı kolaylaştırmak için anastomozları sterilize edilmiş pamuklu çubuklarla hafifçe sıkıştırın. Daha sonra, sıcaklık sağlamak için donörün kalbine ılık normal salin uygulayın. Donörün kalbi birkaç on saniye içinde fibrilasyona başlar ve birkaç dakika sonra sinüs ritmine kavuşur.
   17. İnce bağırsağı, sterilize edilmiş pamuklu çubuklarla alıcının karnına geri getirin. Donörün kalbinin sıkışmasını veya ince bağırsağın bükülmesini önlemek için özen gösterilmelidir.
   18. Çalışan 4-0 ipek dikiş kullanarak karın duvarını kapatın. Karın içine atipamezol (0.75 mg / kg) uyguladıktan sonra, cildi akan 4-0 ipek dikişle kapatın.
   19. İnhalasyon anestezisini bırakın ve insizyonun altına 1 mL% 1 lidokain enjekte edin. Ek olarak, kan kaybını telafi etmek için deri altından 2 mL ılık normal salin enjekte edin.
   20. Işık yayan bir diyot lambası kullanarak alıcı sıçanı ısıtın. Alıcı sıçan bilincini geri kazanır ve inhalasyon anestezisi kesildikten yaklaşık 30-40 dakika sonra ekstübe edilebilir.

2. Sıçanlarda heterotopik abdominal kalp transplantasyonu kullanan yeni AR modeli

NOT: Heterotopik abdominal kalp transplantasyonunu kullanan yeni bir AR modeli, 7-9 haftalık erkek Jcl:Wistar sıçanları kullanılarak oluşturulmuştur. Prosedürü gerçekleştirmek için 6.7x ila 45x büyütmeli bir mikroskop kullanıldı. Cerrahi aletler sterilizasyon için otoklavlandı.

1. Donör kalp hasadı
   NOT: Yeni AR modelini oluşturmak için ortasında delik bulunan modifiye edilmiş bir Petri kabı, pense ve sert bir kılavuz tel gereklidir (Şekil 1).
   1. Yukarıda tarif edildiği gibi, yükselen aort ve PA transeksiyonu ile ilgili adımlar hariç, sıçanlarda normal nakle benzer bir prosedür kullanarak donörün kalbini toplayın (1.1.1-1.1.14, 1.1.16-1.1.17)
   2. Yükselen aort ve PA'yı transekte etmeden önce, Potts makası kullanarak her iki damarın önündeki yağ dokusunu çıkarın. Daha sonra, cımbız kullanarak her iki damar arasındaki bağ dokusunu diseke edin.
   3. Potts makaslarının bir bıçağını enine sinüse yerleştirin. Potts makasını operatöre doğru çekin ve bıçağı yükselen aort ile PA arasına yerleştirin. Daha sonra, sadece PA'yı transekte edin (Şekil 2A), ardından aortu Potts makası kullanarak brakiyosefalik artere distal olarak transekte edin (Şekil 2B).
   4. Kalbin tabanını 5-0 ipek sütür kullanarak bağladıktan ve makasla bağa distal olarak böldükten sonra, yükselen aort ve PA arasındaki bağ dokusunu diseke edin ve normal nakle benzer bir prosedür kullanarak soğuk modifiye Krebs-Henseleit kardiyoplejik solüsyonu koroner arterlere perfüze edin (adım 1.1.18-1.1.20).
   5. Donörün kalbini pense ile sabitleyin (Şekil 2C). Daha sonra, donörün kalbini merkezinde bir delik bulunan modifiye edilmiş bir Petri kabı ile örtün ve yükselen aortu vasküler bir klipsle hareketsiz hale getirin.
   6. Brakiyosefalik artere sert bir kılavuz tel yerleştirin (Şekil 2D). Direnç karşılandıktan sonra bile kılavuz teli daha fazla itin ve direnç kaybı doğrulanırsa aort kapağını delin. Ciddi bir AR modeli oluşturulacaksa birden fazla delinme gerçekleştirin.
   7. Vasküler klipsle kenetlenmiş kısmı çıkarmak için aortu brakiyosefalik artere proksimal olarak transekte edin (Şekil 2E). Daha sonra, normal nakle benzer bir prosedür kullanarak donörün kalbini soğuk modifiye Krebs-Henseleit kardiyoplejik çözeltisinde saklayın (adım 1.1.21).
2. Alıcı hazırlığı
   NOT: Donörün kalbini toplamadan önce, alıcı hazırlığını tamamlayın.
   1. Yukarıda tarif edildiği gibi, alıcı hazırlama prosedürü normal nakil prosedürüne benzerdir (adım 1.2.1-1.2.7).
3. Heterotopik kalp nakli
   1. Yukarıda tarif edildiği gibi, donörün kalp nakli prosedürü normal transplantasyona benzer (adım 1.3.1-1.3.20).

Sonuçlar

Normal modelle ilgili olarak, kelepçenin açılmasından sonra iyi AG daralması başarıyla sağlanmıştır. Transplante edilen kalbin iskemi süresi ve alıcının anestezi süresi sırasıyla yaklaşık 60 dakika ve 130 dakika idi (Tablo 1).

Yeni AR modelinde kelepçenin sökülmesinden sonra iyi AG daralması da elde edildi. Nakledilen kalbin iskemik süresi ve alıcının AR modelindeki anestezi süresi normal modele göre yaklaşık 5 dakika 10 dakika daha uzundu (

Tartışmalar

Donör kalbin implantasyon sırasında sertleşmesini önlemek için önemli adımlar keşfedildi. İlk olarak, donörün kalbini boşaltmak için hasattan önce donörün abdominal aortunu transekte etmek hayati önem taşır ^4,7. Donörün cerrahi prosedürü endotrakeal entübasyon olmadan gerçekleştirilirse, donörün pulmoner dolaşımını engelleyen torakotomiden sonra solunum durur. Sonuç olarak, donörün kalbi aşırı yüklenir ve kelepçeyi çözd?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antisedan (atipamezole)	Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Domitor (medetomidine)	Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Dormicum (midazolam)	Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.
heparin	AY Pharmaceuticals Co.,Ltd.
Jcl:Wistar rats	CLEA Japan, Inc.
microscope	Orinpas Co., Ltd.	SZ61
modified Krebs-Henseleit cardioplegic solution	Merck KGaA
sevoflurane	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation
SURGICEL FIBRILLAR	Johnson & Johnson K.K.
Vetorphale (butorphanol)	Meiji Animal Health Co., Ltd.