JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, palmitik asit kaynaklı in vitro modelde platikodin D'nin alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı üzerindeki koruyucu etkilerini araştırmaktadır.

Özet

Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının (NAFLD) görülmesi dünya çapında endişe verici bir oranda artmaktadır. Platycodon grandiflorum , çeşitli hastalıkların tedavisi için geleneksel bir etnotilaç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve günlük diyete dahil edilebilecek tipik bir fonksiyonel besindir. Çalışmalar, Platycodon grandiflorum'daki ana aktif bileşenlerden biri olan platycodin D'nin (PD) yüksek biyoyararlanıma sahip olduğunu ve NAFLD'nin ilerlemesini önemli ölçüde azalttığını ileri sürmüştür, ancak bunun altında yatan mekanizma hala belirsizdir. Bu çalışma, PD'nin NAFLD'ye karşı terapötik etkisini in vitro olarak araştırmayı amaçlamaktadır. AML-12 hücreleri, NAFLD'yi in vitro olarak modellemek için 24 saat boyunca 300 μM palmitik asit (PA) ile ön işlemden geçirildi. Daha sonra, hücreler ya PD ile tedavi edildi ya da 24 saat boyunca PD tedavisi almadı. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyeleri 2′,7′-dikloro-dihidro-floresein diasetat (DCFH-DA) boyaması kullanılarak analiz edildi ve mitokondriyal membran potansiyeli JC-1 boyama yöntemi ile belirlendi. Ayrıca, hücre lizatlarındaki LC3-II / LC3-I ve p62 / SQSTM1 protein ekspresyon seviyeleri batı lekelenmesi ile analiz edildi. PD'nin, PA ile tedavi edilen grupta ROS ve mitokondriyal membran potansiyel düzeylerini kontrol grubuna göre anlamlı derecede azalttığı bulundu. Bu arada, PD, kontrol grubuna kıyasla PA ile tedavi edilen grupta LC3-II / LC3-I seviyelerini arttırdı ve p62 / SQSTM1 seviyelerini düşürdü. Sonuçlar, PD'nin oksidatif stresi azaltarak ve otofajiyi uyararak NAFLD'yi in vitro olarak iyileştirdiğini göstermiştir. Bu in vitro model, NAFLD'de PD'nin rolünü incelemek için yararlı bir araçtır.

Giriş

Platycodon grandiflorus (PG), Platycodon grandiflorus'un (Jacq.) kurutulmuş köküdür. A.DC., geleneksel Çin tıbbında (TCM) kullanılır. Esas olarak Çin1'in kuzeydoğu, kuzey, doğu, orta ve güneybatı bölgelerinde üretilmektedir. PG bileşenleri arasında triterpenoid saponinler, polisakkaritler, flavonoidler, polifenoller, polietilen glikoller, uçucu yağlar ve mineraller2 bulunur. PG, Asya'da gıda ve bitkisel ilaç olarak kullanılma konusunda uzun bir geçmişe sahiptir. Geleneksel olarak, bu bitki akciğer hastalıklarına karşı ilaç yapmak için kullanılmıştır. Modern farmakoloji ayrıca PG'nin diğer hastalıkların tedavisinde etkinliğine dair kanıtlar sağlar. Çalışmalar, PG'nin çeşitli ilaca bağlı karaciğer hasarı modelleri üzerinde terapötik bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir. PG veya platikodin ekstraktlarının diyet takviyesi, yüksek yağlı diyete bağlı obeziteyi ve buna bağlı metabolik hastalıkları iyileştirebilir 3,4,5. PG'den polisakkaritler, farelerde LPS / D-GalN'nin neden olduğu akut karaciğer hasarının tedavisi için kullanılabilir6. Ayrıca, PG köklerinden gelen saponinler, yüksek yağlı diyete bağlı alkolsüz steatohepatiti (NASH) iyileştirir7. Ayrıca, PG'nin en önemli terapötik bileşenlerinden biri olan platikodin D (PD), insan hepatosellüler karsinom (HepG2) hücrelerinde düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör ekspresyonunu ve düşük yoğunluklu lipoprotein alımını artırabilir8. Ayrıca, PD ayrıca apoptozu indükleyebilir ve HepG2 hücrelerinde adezyon, migrasyon ve invazyonu inhibe edebilir 9,10. Bu nedenle, bu çalışmada, fare hepatoma AML-12 hücreleri in vitro model yapımında ve bu modelde PD'nin farmakolojik etkilerini ve altta yatan mekanizmalarını daha fazla incelemek için kullanılmıştır.

Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) terimi, basit steatoz, NASH, siroz ve hepatosellüler karsinom11'i içeren bir grup karaciğer hastalığını ifade eder. NAFLD'nin patogenezi tam olarak anlaşılamamış olsa da, klasik "iki isabetli" teoriden mevcut "çoklu vuruş" teorisine kadar, insülin direncinin NAFLD patogenezinde merkezi olduğu düşünülmektedir12,13,14. Çalışmalar, hepatositlerdeki insülin direncinin, karaciğerde biriken trigliseritleri oluşturan ve karaciğerin yağlı olmasına neden olan serbest yağ asitlerinin artmasına neden olabileceğini göstermiştir15,16. Yağ birikimi lipotoksisiteye, oksidatif strese bağlı mitokondriyal disfonksiyona, endoplazmik retikulum stresine ve inflamatuar sitokin salınımına yol açarak NAFLD17,18'in patogenezine ve ilerlemesine neden olabilir. Ek olarak, otofaji, hücresel insülin duyarlılığını, hücresel lipid metabolizmasını, hepatosit hasarını ve doğuştan gelen bağışıklığı düzenlemede rol oynadığı için NAFLD'nin patogenezinde de rol oynar 19,20,21.

NAFLD22,23'ün patogenezini ve potansiyel terapötik hedeflerini araştırmak için bir temel oluşturmak üzere çeşitli hayvan modelleri ve hücresel modeller oluşturulmuştur. Bununla birlikte, tek hayvan modelleri NAFLD24'ün tüm patolojik süreçlerini tam olarak taklit edemez. Hayvanlar arasındaki bireysel farklılıklar farklı patolojik özelliklere yol açar. NAFLD'nin in vitro çalışmalarında karaciğer hücre hatlarının veya primer hepatositlerin kullanılması, deneysel koşullarda maksimum tutarlılık sağlar. Hepatik lipid metabolizması disregülasyonu, NAFLD25'te daha yüksek seviyelerde hepatosit lipid damlacık birikimine yol açabilir. Oleik asit ve palmiye yağı gibi serbest yağ asitleri, in vitro modelde, yüksek yağlı bir diyetin neden olduğu NAFLD'yi taklit etmek için kullanılmıştır26,27. İnsan hepatoblastoma hücre hattı HepG2, in vitro NAFLD modellerinin yapımında sıklıkla kullanılır, ancak bir tümör hücre hattı olarak, HepG2 hücrelerinin metabolizması normal fizyolojik koşullar altında karaciğer hücrelerininkinden önemli ölçüde farklıdır28. Bu nedenle, ilaç taraması için in vitro NAFLD modelini oluşturmak için primer hepatositleri veya fare primer hepatositlerini kullanmak, tümör hücre hatlarını kullanmaktan daha avantajlıdır. Hem hayvan modellerinde hem de in vitro hepatosit modellerinde ilaç etkilerinin ve terapötik hedeflerin sinerjik incelemesi karşılaştırıldığında, in vitro NAFLD modelini oluşturmak için fare hepatositlerinin kullanılmasının daha iyi uygulama potansiyeline sahip olduğu görülmektedir.

Karaciğere giren serbest yağ asitleri enerji üretmek için oksitlenir veya trigliseritler olarak depolanır. Önemli ölçüde, serbest yağ asitleri belirli bir lipotoksisiteye sahiptir ve hücresel disfonksiyon ve apoptozu indükleyebilir12. Palmitik asit (PA), insan plazmasında en bol bulunan doymuş yağ asididir29. Yağ dışı dokudaki hücreler uzun süre yüksek konsantrasyonlarda PA'ya maruz kaldığında, bu reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini uyarır ve oksidatif strese, lipit birikimine ve hatta apoptoza neden olur30. Bu nedenle, birçok araştırmacı PA'yı karaciğer hücrelerini ROS üretmeye teşvik etmek için bir indükleyici olarak kullanır ve böylece in vitro yağlı karaciğer hastalığı modelini oluşturur ve bazı aktif maddelerin hücreler üzerindeki koruyucu etkilerini değerlendirir31,32,33,34. Bu çalışma, PD'nin PA tarafından indüklenen NAFLD'nin bir hücre modeli üzerindeki koruyucu etkilerini araştırmak için bir protokol sunmaktadır.

Protokol

AML-12 hücreleri (normal bir fare hepatosit hücre hattı) hücre bazlı çalışmalar için kullanılır. Hücreler ticari bir kaynaktan elde edilir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. NAFLD'yi in vitro modellemek için AML-12 hücrelerinin ön muamelesi

  1. Hücreleri normal hücre kültürü ortamında (DMEM artı Ham'ın F12 [1:1], 0.005 mg/mL insülin, 5 ng/mL selenyum, 0.005 mg/mL transferrin, 40 ng/mL deksametazon ve %10 fetal sığır serumu [FBS] içeren 37 °C'de %5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde tutun.
  2. Hücreleri 2.8 x 105 hücre/kuyu yoğunluğuna sahip 12 delikli plakalara (1 mL/kuyu) tohumlayın.
    NOT: Tüm hücre sindirimi ve ortam değişim işlemleri, hücrelerin kirlenmesini önlemek için bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.
  3. Gece inkübasyonundan sonra hücrelerin kültür ortamını çıkarın (~ 10 saat) ve ardından hücreleri iki kez 1 mL serumsuz ortam (kuyucuk başına) ile yıkayın.
  4. 12 kuyucuklu hücre plakasını soldan sağa, (1) kontrol grubu, (2) PD ile tedavi edilen grup, (3) PA ile tedavi edilen grup ve (4) PA + PD ile tedavi edilen grup dahil olmak üzere dört farklı tedavi grubuna bölün.
    NOT: Her deneysel tedavi grubunun üç replikası, aynı 12 delikli hücre plakası üzerinde yukarıdan aşağıya doğru düzenlenmiştir.
  5. Kontrol grubuna ve PD ile tedavi edilen gruba normal hücre kültürü ortamını (1 mL / kuyu) ekleyin ve PA ile tedavi edilen ve PA + PD ile tedavi edilen gruba 300 μM PA ile desteklenen normal hücre kültürü ortamını (1 mL / kuyu) ekleyin.
  6. 24 saatlik inkübasyondan sonra hücrelerin kültür ortamını çıkarın ve ardından hücreleri iki kez 1 mL serumsuz ortam (kuyucuk başına) ile yıkayın.
  7. Kontrol grubuna bir araçla (dimetil sülfoksit, DMSO,% 0.1 v / v) desteklenmiş normal hücre kültürü ortamını (1 mL / kuyu) ekleyin; PD ile tedavi edilen gruba 1 μM PD ile desteklenmiş normal hücre kültürü ortamını (1 mL / kuyu) ekleyin; PA ile tedavi edilen gruba 300 μM PA ile desteklenmiş normal hücre kültürü ortamı (1 mL / kuyu) ekleyin; PA + PD ile tedavi edilen gruba 300 μM PA ve 1 μM PD ile desteklenmiş normal hücre kültürü ortamını (1 mL / kuyu) ekleyin.
  8. Ek bir 24 saat inkübasyondan sonra, 2′,7′-dikloro-dihidro-floresein diasetat (DCFH-DA) boyama (adım 2), JC-1 boyama (adım 3) ve batı lekeleme (adım 4) kullanarak PD'nin hücreler üzerindeki koruyucu etkilerini araştırın.
    NOT: Tüm inkübasyon işlemleri 37 °C'de %5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde yapılır.

2. ROS üretimindeki değişimin ölçülmesi

NOT: Hücrelerdeki hücre içi ROS seviyeleri, DCFH-DA boyama testine dayanarak değerlendirilir.

  1. Tedavi süresinin sonunda (adım 1.8), hücreleri kuyucuk başına 1 mL fosfat tamponlu salin (1x PBS, pH 7.4) ile üç kez yıkayın ve ardından hücreleri kuyucuk başına 100 μL 10 μM DCFH-DA ile boyayın (bkz. Hücreleri karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: 30 dakikalık inkübasyondan sonra belirgin bir yeşil floresan gözlenmezse, probun ve hücrelerin kuluçka süresi uygun şekilde arttırılabilir (30-60 dakika). 30 dakikalık inkübasyondan sonra yeşil floresan değerinin aşırı maruziyeti gözlenirse, probun ve hücrelerin kuluçka süresi uygun şekilde azaltılabilir (15-30 dakika).
  2. Hücreleri 1x PBS (1 mL/kuyu) ile üç kez yıkayın. Her bir kuyucuğa 1 mL 1x PBS ekleyin.
  3. 12 delikli plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından hücrelerin morfolojisini gözlemlemek için 20x'lik bir hedef kullanın (büyütme: 200x).
  4. 480 nm uyarma dalga boyuna ve 530 nm emisyon dalga boyuna sahip yeşil floresan kanalı kullanarak floresan mikroskobundaki her bir kuyucuk için üç temsili floresan görüntüsü (büyütme: 200x) yakalayın.
    NOT: DCFH-DA'yı tespit etmek için 480 nm uyarma dalga boyuna ve 530 nm emisyon dalga boyuna sahip yeşil floresan kanal önerilir. Ek olarak, DCFH-DA, floresan mikroskobu35,36'da GFP ve FITC parametre ayarları ile tespit edilebilir.
  5. Son olarak, görüntüleri görüntü yakalama yazılımıyla işleyin (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından her grubun ortalama floresan yoğunluğunu veya farklı grupların oranlarını hesaplamak için ImageJ yazılımını kullanın.
    NOT: Görüntüleme çalışmaları için kullanılan floresan mikroskobu ve Image J yazılımının teknik detayları daha önce37,38 olarak açıklanmıştır.

3. Mitokondriyal membran potansiyelindeki değişimin ölçülmesi

NOT: Mitokondriyal membran potansiyelindeki değişiklikler JC-1 boyama testi ile izlenir.

  1. Tedavi süresinin sonunda (adım 1.8), hücreleri üç kez kuyucuk başına 1 mL 1x PBS ile yıkayın ve daha sonra karanlıkta 37 ° C'de 30 dakika boyunca 100 μL 5 μg / mL JC-1 çalışma çözeltisi ile ( bkz.
    NOT: 30 dakikalık inkübasyondan sonra belirgin bir yeşil floresan gözlenmezse, probun ve hücrelerin kuluçka süresi uygun şekilde arttırılabilir (30-60 dakika). 30 dakikalık inkübasyondan sonra yeşil floresan değerinin aşırı maruziyeti gözlenirse, probun ve hücrelerin kuluçka süresi uygun şekilde azaltılabilir (15-30 dakika).
  2. Hücreleri 1x PBS (1 mL/kuyu) ile üç kez yıkayın. Her bir kuyucuğa 1 mL 1x PBS ekleyin.
  3. 12 delikli plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve ardından hücrelerin morfolojisini gözlemlemek için 20x'lik bir hedef kullanın (büyütme: 200x).
  4. Sırasıyla 485 nm ve 535 nm uyarma ve emisyon dalga boylarına sahip yeşil floresan kanalı ve sırasıyla 550 nm ve 600 nm uyarma ve emisyon dalga boylarına sahip kırmızı floresan kanalı kullanarak floresan mikroskobundaki her bir kuyucuk için üç temsili floresan görüntüsü (büyütme: 200x) yakalayın.
    NOT: Depolarize mitokondri 39,40,41 olarak kabul edilen JC-1 monomerini tespit etmek için 485 nm uyarma dalga boyuna ve 535 nm emisyon dalga boyuna sahip yeşil floresan kanalı kullanılır ve JC-1 dimerini tespit etmek için 550 nm uyarma dalga boyuna ve 600 nm emisyon dalga boyuna sahip kırmızı floresan kanalı, polarize mitokondri 39,40,41 olarak kabul edilir.
  5. Son olarak, görüntüleri görüntü alma yazılımıyla işleyin ve ardından her grubun ortalama floresan yoğunluğunu veya farklı grupların oranlarını hesaplamak için Image J yazılımını kullanın.
    NOT: Görüntüleme çalışmaları için kullanılan floresan mikroskobu ve Image J yazılımının teknik detayları daha önce37,38 olarak açıklanmıştır.

4. LC3-II / LC3-I ve p62 / SQSTM1 protein ekspresyon seviyelerinin ölçülmesi

  1. İşlemden sonra (adım 1.8), hücreleri 4 ° C'de önceden soğutulmuş 1x PBS (1 mL / kuyu) ile üç kez yıkayın.
  2. 12 kuyucuklu plakaya proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli (1x) ile desteklenmiş RIPA lizis tamponu (100 μL / kuyu) ekleyin (bkz.
  3. Hücre lizatını 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine toplayın ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Standart prosedürleri izleyerek BCA yöntemi ile süpernatantların protein konsantrasyonunu belirleyin42.
  4. SDS-PAGE numune yükleme tamponunu (5x, bakınız Malzeme Tablosu) hücre lizat süpernatantlarına ekleyin (hacim oranı = 1:4).
  5. Vorteksleme ile karıştırın (~ 15 s için yüksek hızda) ve proteini denatüre etmek için karışık numuneleri 5 dakika boyunca 100 ° C'de ısıtın.
  6. 12-iyi hazırlanmış% 12 SDS-PAGE jelini elektroforez tankına koyun ve ardından ultra saf suyla seyreltilmiş SDS yukarı numune tamponunu (1x) yükseklik sınırı konumuna ekleyin.
    NOT: SDS-PAGE jeli, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılarak hazırlanmıştır.
  7. Protein işaretleyicisini (5 μL / kuyucuk) ve numuneleri (20 μg / kuyucuk) SDS-PAGE jelinin farklı kuyucuklarına ekleyin.
  8. Kararlı voltaj modunu 100 V'a ayarlayın ve elektroforezi 80 dakika boyunca gerçekleştirin.
  9. SDS-PAGE elektroforezinden sonra, proteinlerin daha önce yayınlanmış raporları takiben bir poliviniliden florür (PVDF) membranına (0.45 μM, bakınız Malzeme Tablosu) elektrotransferini gerçekleştirin43,44.
  10. Proteinlerin elektrotransferinden sonra, PVDF membranını oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda iki kez (5 dakika / saat) 10 mL TBST (1x TBS,% 0.1 Tween 20) ile yıkayın.
  11. PVDF membranını 5 mL sığır serum albümini (BSA, %5) ile oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 1 saat boyunca bloke edin.
  12. PVDF membranını 10 mL TBST ile üç kez (10 dakika/saat) yıkayın. Daha sonra, PVDF membranını, LC3 (fare mAb, 1:2.000), p62/SQSTM1 (bundan böyle p62, fare mAb, 1:2.000 olarak anılacaktır) ve β-aktin (fare mAb, 1:2.000) için bloke edici tamponda seyreltilmiş spesifik primer antikorların 5 mL'sinde gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  13. PVDF membranı oda sıcaklığında üç kez (10 dakika/saat) 10 mL TBST ile yıkayın. Daha sonra, PVDF membranını, oda sıcaklığında bloke edici tamponda (1:10.000) seyreltilmiş tavşan anti-fare IgG (HRP) ikincil antikoru ile inkübe edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 2 saat boyunca ışıktan korunun.
  14. PVDF membranı oda sıcaklığında üç kez (10 dakika/saat) 10 mL TBST ile yıkayın. Ardından, PVDF membranını plastik ambalajın üzerine yerleştirin, uygun miktarda ECL çalışma çözeltisi (200 μL / membran) ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve 2 dakika boyunca inkübe edin.
  15. İnkübasyondan sonra, ECL çalışma solüsyonunu çıkarın ve görüntü geliştirme için görüntüleme sistemindeki PVDF membranını açığa çıkarın. Son olarak, her bandın gri değerlerini analiz etmek için Image J yazılımını kullanın.
    NOT: Görüntüleme çalışmaları için kullanılan western blotting ve Image J yazılımının teknik detayları daha önce45,46 olarak açıklanmıştı.

5. İstatistiksel analiz

  1. Deneylerden elde edilen verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun.
  2. Daha önce açıklanan istatistiksel yazılım aracı ile anlamlılık analizinigerçekleştirin 47.
  3. Bir t-testi kullanarak iki grup arasındaki istatistiksel farklılıkları hesaplayın. 0,05'in altındaki bir P-değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

Sonuçlar

Hücrelerde hücre içi ROS
AML-12 hücreleri 24 saat boyunca 300 μM PA ile indüklendi ve bir NAFLD hücre modeli oluşturuldu. Daha sonra, hücreler 24 saat boyunca PD ile tedavi edildi. Hücreler bir DCFH-DA floresan probu ile etiketlendi ve bir floresan mikroskobu altında ROS üretimi gözlendi. Hücrelerdeki hücre içi ROS'un DCFH-DA boyamasının sonuçları Şekil 1'de gösterilmiştir. Sonuçlar, PD'nin 300 μM PA (P < 0.01) ile inkübe edilen hücrele...

Tartışmalar

Çalışmalar, NAFLD'nin yağlı karaciğerden NASH'ye kadar değişen, siroz ve karaciğer kanserine ilerleyebilen klinikopatolojik bir sendrom olduğu gerçeğini vurgulamıştır51. Yüksek yağlı bir diyet ve aktif olmayan bir yaşam tarzı NAFLD için tipik risk faktörleridir. NAFLD tedavisi için hem ilaç dışı tedaviler hem de ilaç tedavileriaraştırılmıştır 51,52,53. Bununla birlikte, N...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Chongqing Bilim ve Teknoloji Komisyonu (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 ve jbky20210029) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (No. 2021MD703919) tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
5% BSA Blocking BufferSolarbio, Beijing, ChinaSW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell lineProcell Life Science&Technology Co., Ltd, ChinaAML12
Beyo ECL PlusBeyotime, Shanghai, ChinaP0018S
Bio-safety cabinetEsco Micro Pte Ltd, SingaporeAC2-5S1 A2 
cellSensOlympus, Tokyo, Japan1.8
Culture CO2 IncubatorEsco Micro Pte Ltd, SingaporeCCL-170B-8
DexamethasoneBeyotime, Shanghai, ChinaST125
Dimethyl sulfoxideSolarbio, Beijing, ChinaD8371
DMEM/F12Hyclone, Logan, UT, USASH30023.01
Foetal Bovine SerumHyclone, Tauranga, New ZealandSH30406.05
Graphpad softwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)ABclonal, Wuhan, ChinaAS003
Hydrophobic PVDF Transfer MembraneMerck, Darmstadt, GermanyIPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×Beyotime, Shanghai, ChinaC0341
MAP LC3β AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1Solarbio, Beijing, ChinaM8650
Olympus Inverted Microscope IX53Olympus, Tokyo, JapanIX53
Palmitic AcidSigma, GermanyP0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)Hyclone, Logan, UT, USASV30010
Phenylmethanesulfonyl fluorideBeyotime, Shanghai, ChinaST506
Phosphate Buffered SolutionHyclone, Logan, UT, USABL302A
Platycodin DChengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, ChinaCSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100xBeyotime, Shanghai, ChinaP1005
Protein MarkerSolarbio, Beijing, ChinaPR1910
Reactive Oxygen Species Assay KitSolarbio, Beijing, ChinaCA1410
RIPA Lysis BufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitBeyotime, Shanghai, ChinaP0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5xBeyotime, Shanghai, ChinaP0015
Sigma CentrifugeSigma, Germany3K15
SQSTM1/p62 AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-28359
Tecan Infinite 200 PRO  Tecan Austria GmbH, Austria1510002987
WB Transfer Buffer,10xSolarbio, Beijing, ChinaD1060
β-Actin Mouse mAbABclonal, Wuhan, ChinaAC004

Referanslar

  1. Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
  2. Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
  3. Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480 (2020).
  4. Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532 (2016).
  5. Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71 (2017).
  6. Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
  7. Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
  8. Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834 (2020).
  9. Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
  10. Lu, J. -. J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
  11. Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
  12. Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
  13. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
  14. Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
  15. Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
  16. Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
  17. Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622 (2022).
  18. Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
  19. Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973 (2021).
  20. Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
  21. Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
  22. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  23. Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
  24. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  25. Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
  26. Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
  27. Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
  28. Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
  29. Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479 (2016).
  30. Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
  31. Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
  32. Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
  33. Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
  34. Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13 (2021).
  35. Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
  36. Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
  37. Bankhead, P. . Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , (2014).
  38. Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  39. Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , (2007).
  40. Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128 (2019).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  42. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).
  43. Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
  44. Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87 (2012).
  45. Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590 (2014).
  46. Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
  47. Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
  48. Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
  49. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
  50. Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
  51. Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
  52. Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
  53. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  54. Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
  55. Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359 (2016).
  56. Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976 (2021).
  57. Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459 (2018).
  58. Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
  59. Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
  60. Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
  61. Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
  62. Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060 (2020).
  63. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  64. Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 190Platycodin Dpalmitik asitreaktif oksijen t rlerimitokondriyal membran potansiyeliotofaji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır