JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Aksesuar protein TnpB'nin bireysel canlı Escherichia coli hücrelerinde transpozisyon dinamiklerini nasıl etkilediğini ölçmek için canlı gerçek zamanlı görüntüleme yapmak için bir protokol özetlenmiştir.

Özet

Burada, transpozisyona bağlı bir dizi floresan muhabir kullanarak canlı bakteri hücrelerinde transpoze edilebilir element aktivitesinin canlı, gerçek zamanlı görüntülenmesini gerçekleştirmek için bir protokol özetlenmiştir. Özellikle, TnpB aksesuar proteininin, IS200/IS605 transpoze edilebilir element ailesinin bir üyesi olan transpoze edilebilir element IS608'in aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için gerçek zamanlı görüntülemenin nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. IS200 / IS605 transpoze edilebilir element ailesi, doğada bulunan en sayısız genden biri olan tnpB ile bağlantılı bol miktarda mobil elementtir. Sekans homolojileri, TnpB proteininin CRISPR / Cas9 sistemlerinin evrimsel bir öncüsü olabileceğini öne sürmektedir. Ek olarak, TnpB, Cas benzeri RNA rehberliğinde DNA endonükleazı olarak hareket ettiği gösterilerek yenilenmiş bir ilgi görmüştür. TnpB'nin IS608'in transpozisyon oranları üzerindeki etkileri ölçülmüştür ve IS608'in TnpB ekspresyonunun, TnpB ekspresyonundan yoksun hücrelere kıyasla ~ 5x artmış transpozon aktivitesi ile sonuçlandığı gösterilmiştir.

Giriş

Transpoze edilebilir elementler (TE'ler), konakçı genomlarında eksizyon veya katalizör kopyalama ve ardından genomik yeniden entegrasyon ile harekete geçen genetik elementlerdir. TE'ler yaşamın tüm alanlarında bulunur ve transpozisyon, konakçı genomunu yeniden yapılandırır, kodlamayı mutasyona uğratır ve bölgelerikontrol eder 1. Bu, evrim2,3, gelişim 4,5 ve kanser7 dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarındaönemli bir rol oynayan mutasyonlar ve çeşitlilik üretir.

Transpozisyonel aktivitenin yönlerini floresan muhabirlere bağlayan yeni genetik yapıları kullanarak, önceki çalışmamız, yaygın IS200 / IS605 TE'ler ailesinin bir temsilcisi olan bakteriyel TE IS608'e dayanan deneysel bir sistemin geliştirilmesini tanımladı ve bu da bireysel canlı hücrelerde transpozisyonun gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verdi8 (Şekil 1). TE sistemi Şekil 1A'da gösterilmiştir. TE, TnpA'nın tanıma ve eksizyon bölgeleri olan Sol Uç (LE) ve Sağ Uç (RE) kusurlu palindromik tekrarlar (IP'ler) ile çevrili transpozaz kodlama dizisi tnpA'yı içerir. tnpA, tet baskılayıcı tarafından bastırılan ve anhidrotetrasiklin (aTc)9 ile indüklenebilen promotör PLTetO1 kullanılarak ifade edilir. TE, mavi muhabir mCerulean3 11 için kurucu bir PlacIQ1 promotörü 10'un -10 ve -35 dizilerini böler. Şekil 1C'de gösterildiği gibi, tnpA üretimi indüklendiğinde, TE, promotör resulanmasına yol açacak şekilde eksize edilebilir. Üretilen hücre mCerulean3 eksprese eder ve mavi floresan yapar. TnpA'nın N-terminüsü, sarı muhabir Venüs12 ile kaynaştırılır ve TnpA seviyelerinin sarı floresan ile ölçülmesine izin verir.

IS608 ve IS200/IS605 transpozon ailesinin diğer üyeleri de tipik olarak şimdiye kadar bilinmeyen fonksiyonun ikinci bir geni olan tnpB13'ü kodlar. TnpB proteinleri, genellikle sadece tnpB16'dan oluşan birkaç bakteri ve arkeal TE'ler14,15 tarafından kodlanan muazzam derecede bol fakat kusurlu bir şekilde karakterize edilmiş bir nükleaz ailesidir. Ayrıca, son zamanlarda yapılan çalışmalar, TnpB'nin çeşitli koşullar altında dsDNA veya ssDNA kırılmaları verecek CRISPR / Cas benzeri programlanabilir RNA rehberliğinde endonükleaz olarak işlev gördüğünü bularak TnpB'ye olan ilgiyi yenilemiştir17,18. Bununla birlikte, TnpB'nin transpozisyonun düzenlenmesinde hangi rolü oynayabileceği belirsizliğini korumaktadır. TnpB'nin IS608 transpozisyonu üzerindeki etkilerinin gerçek zamanlı görselleştirmesini gerçekleştirmek için, kırmızı floresan protein mCherry'ye N-terminal füzyonu ile TnpB'nin kodlama bölgesi de dahil olmak üzere transpozonun bir versiyonu oluşturuldu.

Kuhlman laboratuvarı19 tarafından gerçekleştirilen daha ayrıntılı toplu düzey çalışmaları tamamlayarak, transpozon aktivitesinin gerçek zamanlı görüntülenmesinin TnpB'nin veya diğer aksesuar proteinlerin transpozisyonel dinamikler üzerindeki etkisini nicel olarak nasıl ortaya çıkarabileceği burada gösterilmiştir. TnpB'yi mCherry ile kaynaştırarak, bireysel transpozisyonel olaylar mavi floresan ile tanımlanır ve TnpA (sarı floresan) ve TnpB (kırmızı floresan) ekspresyon seviyeleri ile ilişkilendirilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Bakteri kültürlerinin hazırlanması

  1. E. coli suşu MG1655'i plazmid transpozon yapıları (daha önce Kim ve ark.8'de tanımlanmıştır) ile LB'de gece boyunca uygun antibiyotiklerle (25 μg / mL kanamisin, bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'de büyütün.
    NOT: Kullanılan yapıların dizileri ve ilgili diziler GenBank20 katılım numaraları OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 ve OP717085 olarak mevcuttur.
  2. Kararlı durum üstel büyüme elde etmek için, kültürleri ≥100 kat M63 ortamına (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1.8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2 SO 4, 0.5 μg / mL tiamin [B1 vitamini]) ve uygun antibiyotiklerle (bkz.
  3. 600 nm'deki (OD600) optik yoğunluk ~ 0,2'ye ulaşana kadar kültürleri 37 ° C'de büyütün. Kültürler kullanıma hazırdır.

2. Slayt hazırlama

  1. Agarozu eritmek ve tamamen erimiş ve iyi karıştırıldığından emin olmak için M63'ü mikrodalgada% 0.5 w / v glikoz ve% 1.5 w / v agaroz ile kaynatarak bir slayt hazırlayın.
  2. Antibiyotik ve indükleyiciler eklemeden önce karışımın ~ 55 ° C'ye soğumasını bekleyin (25 μg / mL Kanamisin ve 10 ng / μL anhidrotetrasiklin [aTc], bakınız Malzeme Tablosu).
  3. Çalışma tezgahına bir mikroskop slaytı yerleştirin. İlkine dik iki slayt daha istifleyin ve alt slayda paralel olarak üste bir slayt daha yerleştirin. Alt ve üst slaytlar arasında bir slayt kalınlığına eşit bir boşluk olduğundan emin olun. Pipet, M63 agaroz karışımının ~1 mL'si arasındaki bu boşluğa yavaşça küçük bir jel kare oluşturacak şekilde kaydırır.
  4. Jel katılaştıktan sonra (~ 10-15 dakika), çıkarmak için üst slaytı kaydırın. Agarose pedini bir tıraş bıçağı veya bıçakla kesin. Daha sonra kültürün 2,5 μL'sini pipet (adım 1.3) ve kapak kapağını üstüne koyun.
  5. Kızak ve kapak kapağı arasındaki boşluğu epoksi ile kapatın (bkz. Epoksinin kurumasına ve hücrelerin 37 ° C'de en az 1 saat boyunca agaroz pedine yerleşmesine izin verin.

3. Timelapse floresan mikroskopi

  1. Hazırlanan numuneyi (adım 1.3) bir floresan mikroskobuna (bakınız Malzeme Tablosu) ısıtılmış ve 37 °C'de muhafaza edilmiş bir ortama yerleştirin.
    1. Görüntü alma için kullanılan fotoğraf makinesine uygun pozlama sürelerini ayarlayın. Fotobeyazlatmayı en aza indirmek için aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın.
      NOT: Bu çalışmada her dalga boyu için 2 sn maruz kalma süresi kullanılmıştır.
    2. Her dalga boyu için, minimum floresan içeren bir Görüş Alanı (FOV) bulun. Arka plan çıkarma için analiz sırasında kullanmak üzere görüntüler edinin.
  2. Farklı dalga boylarında ve düzenli zaman aralıklarında bir ızgaradaki görüntüleri almak için bir protokol ayarlayın.
    1. Zaman atlamalı fotoğrafçılığı protokole kodlayın. Edinme sıklığını istenen zaman aralığına (burada 20 dakika) ve toplam zaman atlama süresini istenen uzunluğa (24 saat) ayarlayın.
    2. Uygun dalga boylarını protokole kodlayın (kullanılan yapıya bağlı olarak).
      NOT: mCherry uyarma zirvesi 587 nm ve emisyon zirvesi 610 nm21'dir; mVenüs 515 nm ve 527 nm12'de, mCerulean3 ise 433 nm ve 475 nm11'dedir.
    3. İstenilen FOV sayısı arasında yakalanacak ızgara boyutunu ayarlayın.
      NOT: Burada gösterilen temsili veriler 8 x 8 FOV kullanmıştır.

4. Görüntü analizi

  1. Adım 3.1.2'de edinilen ilgili arka plan görüntülerini kullanarak her renk kanalında arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirin. Tüm analiz adımları için, açık kaynaklı platform Fiji22'de standart modüller kullanıyoruz ( bkz.
  2. mCerulean kanalını eşik haline getirerek ve eşik alanını ortalama hücre alanına bölerek zamanın her noktasındaki toplam popülasyona yaklaşın.
  3. Benzersiz eksizyon olaylarını saymak için, mCerulean3 kanalının zaman türevini kullanın. Bunu, mCerulean3 kanalındaki ardışık görüntüleri çıkararak gerçekleştirin. Eksizyon olayları, zaman türevinde parlak bir floresan parlaması olarak tespit edilecektir.
    1. İstenmeyen floresanı ortadan kaldırmak için eksizyon olayları yığınını eşik haline getirin. Bu işlemin eksizyonların bazı kısımlarını eşik hale getireceğini unutmayın. Bunu düzeltmek için, eksizyonları orijinal boyutlarına geri yüklemek üzere görüntüleri genişletin.
      NOT: Benzer eşik ve görüntü analizi teknikleri kullanılarak yapılan analizler diğer floresan kanallarında da yapılabilir (örneğin; eksizyon olaylarını transpozaz TnpA [sarı Venüs floresan] ve TnpB [kırmızı mCherry floresan] seviyeleri ile ilişkilendirin].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Canlı hücrelerdeki transpozon aktivitesini floresan mikroskobu ile görselleştirmenin bu yöntemi, toplu floresan ölçümlerinden daha düşük verime sahipken, bireysel canlı hücrelerde transpozon aktivitesinin doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Transpozon eksizyon olayları, mCerulean3 için promotörün yeniden sulandırılmasıyla sonuçlanır (Şekil 1), transpozon aktivitesi geçiren hücrelerin parlak mavi floresan ile tanımlanmasına izin verir (Şekil 2, TnpB +: Ek Fil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Canlı hücrelerde transpoze edilebilir element aktivitesinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için burada sunulan benzersiz yöntem, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak transpozisyonu doğrudan tespit edebilen ve bu aktiviteyi aksesuar proteinlerin ekspresyonu ile ilişkilendirebilen hassas bir testtir. Verim, toplu yöntemlerle elde edilebilenden daha düşük olsa da, bu yöntem bireysel canlı hücrelerde TE aktivitesinin ve protein ekspresyonunun ayrıntılı ölçümlerini sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu araştırma için finansal destek, Kaliforniya Üniversitesi'nden başlangıç fonları tarafından sağlandı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2 Ton Clear EpoxyDevcon31345
AgaroseSigma-Aldrich5066
Ammonium sulfateSigma-AldrichAX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochlorideSigma-Aldrich37919
Argon LaserMelles Griot35-IMA-840-015
Blue Filter CubeChromaEx: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
Eclipse Ti-E MicroscopeNikonDiscontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)Eppendorf North America Biotools22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)Eppendorf North America Biotools22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 gFisher Scientific706834
FijiFiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)Fisher ScientificBP9723-2 
Glass Cover SlideFisher Scientific12-542B 
Kanamycin SulfateSigma-Aldrich1355006
Magnesium sulfate Cert AcFisher ScientificXXM63SP3KG
Microscope HeaterWorld Precision Instruments96810-1
Potassium Phosphate MonobasicFisher Scientific17001H
ProScan III StagePrior
Red Filter CubeChromaEx: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP LaserCoherent1170412
Slide, MicroscopeFisher Scientific125535B
Thiamine HydrochlorideSigma-Aldrich (SIAL)T1270-100G
Ti-LU4 Laser LaunchNikon
Yellow Filter CubeChromaEx: Z514/10X, Em: ET535/30M

Referanslar

  1. Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).
  2. Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
  3. Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
  4. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
  5. Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
  6. Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).
  7. Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11(2014).
  8. Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
  9. Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
  10. Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
  11. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896(2011).
  12. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  13. Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
  14. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  15. Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).
  16. Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
  17. Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
  18. Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
  19. Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
  20. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
  24. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 191

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır