Farelerde akut miyeloid lösemi üretmek için intra-peritoneal transplantasyon

Özet

Burada, farelerde akut miyeloid lösemiyi (AML) oluşturmak ve yaymak için lösemi hücrelerinin intra-peritoneal enjeksiyonu kullanılır. Bu yeni yöntem, AML hücrelerinin seri transplantasyonunda etkilidir ve farelerde intravenöz enjeksiyon ile zorluk ve tutarsızlık yaşayabilecek kişiler için bir alternatif olarak hizmet edebilir.

Özet

Akut miyeloid lösemiyi (AML) ve kalıcı lösemi kök hücrelerini (LSC'ler) içeren ilişkili nüksleri tedavi etmek için yeni tedavilere karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Alıcı farelerde retro-orbital enjeksiyonlar yoluyla bu hücrelerin başarılı bir şekilde nakledilmesine dayanan terapileri test etmek için deneysel bir AML kemirgen modeli, zorluklarla doludur. Bu çalışmanın amacı, intraperitoneal bir yol kullanarak sağlam bir murin AML modeli oluşturmak için kolay, güvenilir ve tutarlı bir yöntem geliştirmektir. Mevcut protokolde, kemik iliği hücreleri, insan MLL-AF9 füzyon onkoproteinini eksprese eden bir retrovirüs ile dönüştürüldü. Primer AML gelişiminde donör LSC'ler olarak soy negatif (Lin-) ve Lin-Sca-1^+c-Kit+ (LSK) popülasyonlarının etkinliği test edilmiş ve AML üretmek için yeni bir yöntem olarak intra-peritoneal enjeksiyon benimsenmiştir. Seri transplantasyonlarda intraperitoneal ve retro-orbital enjeksiyonlar arasında karşılaştırma yapılarak iki yöntemin karşılaştırılması ve karşılaştırılması sağlandı. İnsan MLL-AF9 virüsü ile transdübe edilen hem Lin^- hem de LSK hücreleri, alıcıların kemik iliğine ve dalağına iyi aşılanmış ve tam gelişmiş bir AML'ye yol açmıştır. Donör hücrelerin intraperitoneal enjeksiyonu, seri transplantasyon üzerine alıcılarda AML oluşturdu ve akım sitometrisi, qPCR ve histolojik analizlerle AML hücrelerinin infiltrasyonu alıcıların kan, kemik iliği, dalak ve karaciğerinde tespit edildi. Bu nedenle, intraperitoneal enjeksiyon, donör lösemik hücrelerin seri transplantasyonu kullanılarak AML indüksiyonunun etkili bir yöntemidir.

Giriş

Akut miyeloid lösemi (AML), kötü prognozlu¹ etiyolojisi olan çeşitli hematolojik malignitelerin bir türüdür. AML hayvan modellerinin oluşturulması, yeni tedavileri keşfetme çabasıyla karmaşık varyasyonlarının ve patobiyolojisinin anlaşılması için temel oluşturur². Farelerde lösemigenez, insanlarda hastalığı taklit etmek için AML'yi güçlü bir şekilde indüklemek için karışık soy lösemi (MLL) genini içeren füzyonlar da dahil olmak üzere füzyon onkoproteinlerini eksprese eden donör hücrelerin transplantasyonunu içerir³. MLL geni ile ilişkili AML^4'ün transplantasyonunda donör hü....

Protokol

Tüm deneyler, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından önceden onaylanmıştır.

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

1. Ampisilin takviyeli (AP) LB agar plakaları (steril 10 cm plakalar) hazırlayın. Bunu yapmak için, 10 g LB suyunu agar ile 400 mL damıtılmış suda çözün, karıştırın ve hacmi 500 mL'ye çıkarın. Çözeltiyi otoklavlayarak sterilize edin, ardından çözeltinin soğumasını bekleyin, çözeltiye 0,5 mL ampisilin (stok: 150 mg / mL) ekleyin ve karıştırmak için çalkalayın. Hemen bir alkol lambasının yakınındaki steril 10 cm'lik bir plakaya 18 mL çözelti ekle....

Sonuçlar

Murin AML hücrelerinin transplantasyon etkinliğinin r.o. ve i.p. transplantasyon yolları kullanılarak karşılaştırılması
Daha önce, MLL-AF9-transdüse LSK hücreleri ile retro-orbital olarak nakledilen alıcı farelerde 1° AML oluşumu bildirilmiş ve 1° AML hücrelerinin nakledilebilirliği seri transplantasyon³⁰ ile gösterilmiştir. Bu çalışma, transplantasyon gerçekleştirmek için kemik iliği ^{Lin-hücrelerinin} kullanılma olasılığını değer.......

Tartışmalar

Yukarıda tarif edilen bu çalışmalar, Lin^- hücrelerinin transplantasyonunun 1 ° murin AML oluşumundaki LSK hücreleri ile karşılaştırılabilir olduğuna dair destekleyici kanıtlar sunmaktadır. Ek olarak, mevcut veriler ayrıca i.p. enjeksiyonunun, intravenöz (veya ro) enjeksiyona kıyasla murin AML'yi oluşturmak için etkili ve uygun bir yöntem olduğunu göstermektedir.

LSK hücrelerine ek olarak, granülosit-monosit progenitör (GMP), ortak lenfoid progenitör (CLP).......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
a-Select competent cells	Bioline	BIO-85027
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma Aldrich	Cat# A-9434
Ampicillin	Sigma Aldrich	Cat# A0797
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade	Gemini bio-products	Cat# 700-102P
Ciprofloxacin HCl	GoldBio.com	Cat# C-861-100
DMEM, high glucose, no glutamine	Gibco	Cat# 11960-044
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	Cat# 21-031-CV
EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade	Calbiochem	Cat# 324503
Fetal Bovine Serum - Premium Select	Atlanta Biologicals	Cat# S11550
Holo-transferrin, bovine	Sigma Aldrich	Cat# T1283
Insulin solution human	Sigma	Cat# I-9278
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	Cat# 12440-053
L-glutamine 200 mM (100×) solution	HyClone, Gelifesciences	Cat# SH30034.01
LB broth, Lennox	NEOGEN	Cat #: 7290A
LB Broth with agar (Miller)	Sigma Aldrich	Cat# L-3147
Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)	Miltenyi Biotec	Cat# 130-124-211
Mouse Interleukin-3 (IL-3)	Gemini bio-products	Cat# 300-324P
Mouse Interleukin-6 (IL-6)	Gemini bio-products	Cat# 300-327P
Mouse Stem Cell Factor (SCF)	Gemini bio-products	Cat# 300-348P
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	Cat# 30-002-CI
Phenix-Eco (pECO) cells	ATCC	CRL-3214
Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular	JT. Baker	Cat# 2940-01
Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)	BioLegend	Cat # 105812
Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)	BD Pharmingen	Cat# 558162
Recombinant Murine Flt3-Ligand	Pepro Tech, INC.	Cat# 250-31L
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment	TaKaRa	Cat# T100A
TransIT-293 Reagent	MirusBio	Cat# MIR 2705
TRI Reagent	Sigma Aldrich	Cat# T9424
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	Cat # 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	Cat# 25200-056
β-Mercaptoethanol (BME)	Sigma Aldrich	Cat# M3148
Commercial Assays
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit	StemCell technologies	Cat# 19856A
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher	Cat# 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMix	Quanta Bio	Cat# 95051-500
Plasmid Maxi Kit (25)	Qiagen	Cat#:12163
Animals
Ai14TdTomato mice	Jackson Laboratory	Strain # 007914
CD45.1 C57BL6/J mice	Jackson Laboratory	Strain # 002014
CD45.2 C57BL6/J mice	Jackson Laboratory	Strain # 000664
Instruments and Softwares
Adobe illustrator	Version 25.2.3
BD accuri C6 flow cytometer	BD Biosciences
FlowJo 10.8.0	BD
GeneSys software program	Version 1.5.7.0
GraphPad Prism version 6	GraphPad
Hemavet 950FS	Drew Scientific
7300 Real time PCR system	Applied Biosystems
Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging	G:Box Chemi