Yüksek Dereceli Seröz Yumurtalık Kanseri Hasta Kaynaklı Organoidlerin Üretimi ve Kültürlenmesi

Özet

Hasta kaynaklı organoidler (PDO), tümör ortamını in vitro olarak taklit edebilen üç boyutlu (3D) bir kültürdür. Yüksek dereceli seröz over kanserinde, PDO'lar yeni biyobelirteçleri ve terapötikleri incelemek için bir model oluşturur.

Özet

Organoidler, hasta kaynaklı yumurtalık tümör dokusundan, asitlerinden veya plevral sıvıdan başarıyla yetiştirilebilen ve yumurtalık kanseri için yeni terapötiklerin ve prediktif biyobelirteçlerin keşfine yardımcı olan 3D dinamik tümör modelleridir. Bu modeller klonal heterojenliği, tümör mikroçevresini ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini özetler. Ek olarak, primer tümörü morfolojik, sitolojik, immünohistokimyasal ve genetik olarak eşleştirdikleri gösterilmiştir. Böylece, organoidler tümör hücreleri ve tümör mikroçevresi üzerinde araştırmayı kolaylaştırır ve hücre hatlarından üstündür. Mevcut protokol, %97'den daha yüksek başarı oranına sahip hasta tümörleri, asitler ve plevral sıvı örneklerinden hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri üretmek için farklı yöntemler tanımlamaktadır. Hasta örnekleri hem mekanik hem de enzimatik sindirim ile hücresel süspansiyonlara ayrılır. Hücreler daha sonra bir bazal membran ekstresi (BME) kullanılarak kaplanır ve yüksek dereceli seröz yumurtalık kanserinin (HGSOC) kültürlenmesine özgü takviyeler içeren optimize edilmiş büyüme ortamı ile desteklenir. İlk organoidleri oluşturduktan sonra, PDO'lar sonraki deneyler için genişleme için pasaj da dahil olmak üzere uzun vadeli kültürü sürdürebilir.

Giriş

2021 yılında, Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 21.410 kadına yeni epitel yumurtalık kanseri teşhisi kondu ve 12.940 kadın bu hastalıktan öldü¹. Cerrahi ve kemoterapide yeterli ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların %70'inden fazlası kemoterapötik direnç geliştirir ve tanıdan sonraki 5 yıl içinde ölür ^2,3. Bu nedenle, bu ölümcül hastalığı tedavi etmek için yeni stratejilere ve klinik öncesi araştırmalar için temsili, güvenilir modellere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.

Kanser hücre hatları ve primer over tümörlerinden oluşturulan hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX), yumurtalık kanseri araştırmalarında kullanılan başlıca araçlardır. Kanser hücre hatlarının en büyük avantajı, hızlı genişlemeleridir. Bununla birlikte, sürekli kültürleri, kanser hücresi hatlarının orijinal birincil kanser tümör örneğinden sapmasına neden olan fenotipik ve genotipik değişikliklerle sonuçlanır. Kanser hücre hattı ile primer tümör arasındaki mevcut farklılıklar nedeniyle, hücre hatlarında olumlu etkileri olan ilaç tahlilleri klinik çalışmalarda aynı etkilere sahip olamamaktadır². Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için PDX modelleri kullanılır. Bu modeller, taze yumurtalık kanseri dokusunun immün yetmezlikli farelere implante edilmesiyle oluşturulur. İn vivo modeller oldukları için, insan biyolojik özelliklerine daha doğru bir şekilde benzerler ve sırayla ilaç sonuçlarının daha öngörücüsüdürler. Bununla birlikte, bu modellerin bunları oluşturmak için gereken maliyet, zaman ve kaynaklar dahil olmak üzere önemli sınırlamaları da vardır⁴.

PDO'lar, hem kanser hücre hatlarının hem de PDX modellerinin sınırlamalarının üstesinden gelen klinik öncesi araştırmalar için alternatif bir model sunar. PDO'lar hastanın tümörünü ve tümör mikroçevresini özetler ve böylece klinik öncesi araştırmalar için ideal olan in vitro izlenebilir bir model sağlar ^2,3,5. Bu 3D modeller, iki boyutlu (2D) hücre hattı muadillerinin sahip olmadığı bir özellik olan birincil tümörü modelleyen kendi kendine organizasyon yeteneklerine sahiptir. Ayrıca, bu modellerin genetik ve işlevsel olarak ebeveyn tümörlerini temsil ettiği gösterilmiştir ve bu nedenle, yeni terapötikleri ve biyolojik süreçleri incelemek için güvenilir modellerdir. Kısacası, hücre hatlarına benzer uzun vadeli genişleme ve depolama yetenekleri sunarlar, ancak aynı zamanda fare modellerine özgü mikro ortamı ve hücre-hücre etkileşimlerini de kapsarlar ^4,6.

Mevcut protokol, %97'den daha yüksek başarı oranına sahip hasta kaynaklı tümörler, asitler ve plevral sıvı örneklerinden PDO'ların oluşturulmasını açıklamaktadır. PDO kültürleri daha sonra birden fazla nesil boyunca genişletilebilir ve ilaç tedavisi duyarlılığını ve prediktif biyobelirteçleri test etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, PDO'ların terapötik yanıtlarına dayanarak tedavileri kişiselleştirmek için kullanılabilecek bir tekniği temsil eder.

Protokol

Araştırma için toplanan tüm insan dokusu örnekleri, Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokole göre elde edilmiştir. Aşağıda özetlenen protokoller steril bir insan doku kültürü ortamında gerçekleştirilmiştir. İnsan deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alındı. Uygun hastaların yumurtalık kanseri tanısı veya varsayılan tanısı olması, bilgilendirilmiş onam imzalamaya istekli ve yetenekli olması ve en az 18 yaşında olması gerekiyordu. Tümör dokusu (malign primer tümör veya metastatik bölgeler), asit ve plevral sıvı onay veren hastalardan işlem sırasında elde edildi. Bu örnekler derhal laboratuvara taşındı ve aşağıda özetlenen yöntemler kullanılarak organoid üretimi için işlendi.

1. Medya hazırlığı

1. Komple organoid medya hazırlığı
   1. Daha önce yayınlanmış bir rapor^7'yi takiben R-spondin 1/Noggin şartlandırılmış ortamını hazırlayın.
      NOT: R-spondin-1/Noggin şartlandırılmış ortam, ticari olarak temin edilebilen rekombinant proteinlere daha uygun fiyatlı bir alternatiftir. Lentivirüs aracılı transdüksiyon yoluyla R-spondin-1 ve Noggin'i istikrarlı bir şekilde salgılayan HEK293T hücreleri, St. Louis'deki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Ron Bose'den ve New York-Presbiteryen / Columbia Üniversitesi Irving Tıp Merkezi 8,9,10'dan Anil ^Rustgi'den cömert bir hediyeydi. Ticari şartlandırılmış ortam bir yedek olarak kullanılabilir (bkz.
2. Tam organoid ortamı yapmak için,% 10 R-spondin 1 / Noggin şartlandırılmış ortam, 50 ng / mL EGF, 10 ng / mL FGF-10, 10 ng / mL FGF2, 1x B27, 10 mmol / L nikotinamid, 1.25 mmol / L N-asetilsistein, 1 μmol / L prostaglandin E2, 10 μmol / L SB202190, 500 nmol / L A83-01 ve 10 μM ROCK inhibitörü birleştirin (bkz.
   NOT: Ortam, 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir. Bu ortam Hill ve ^ark.11'den uyarlanmıştır. Ortamın konsantrasyonları ve bileşenleri, bir ROCK inhibitörü ilavesiyle aynıdır.
3. DMEM / F12'nin gelişmiş bir formülasyonunun 500 mL'sini% 1 penisilin-streptomisin, 1x dipeptid, L-alanil-L-glutamin ve 1x HEPES (10 mM) ile birleştirerek organoid baz ortamı hazırlayın (bkz.

2. Asit ve plevral sıvıdan organoidlerin toplanması

NOT: Asit ve plevral sıvı, organoidlerin en iyi verimi için mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir. Daha önce BME, DNase I ve DNase I reaksiyon tamponunu (bkz. Malzeme Tablosu) içeriği sıvılaştırılana kadar buz üzerine yerleştirerek çözdü.

1. Standart bakım ameliyatları veya prosedürleri sırasında rıza gösteren hastalardan asit ve plevral sıvı alın ve oda sıcaklığında bir seyahat kabında laboratuvara taşıyın.
   NOT: Tüm asit veya plevral sıvı işleme steril bir ortamda yapılmalıdır.
2. 50 mL asit veya plevral sıvıyı 50 mL konik tüplere aktarın (tüp sayısı, elde edilen asit hacmine bağlıdır). 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice aspire etmek için bir cam Pasteur pipet kullanın.
3. Daha önce santrifüj edilmiş pelete 50 mL asit veya plevral sıvı ekleyerek devam edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de tekrar santrifüj yapın. Bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin. Tüm asit veya plevral sıvı işlenene kadar bu adımı tekrarlayın.
4. 1.000 μL nükleaz içermeyen suyu, 100 μL DNaz I reaksiyon tamponunu ve 10 μL DNaz I'i birleştirerek 100 μg/mL DNaz I çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Uygulanan DNaz I tedavisi, bazı hasta örneklerinde hücre agregalarının varlığından bağımsız olarak tek hücreli bir süspansiyon yapmak için yeterlidir¹².
5. Her hücre peletini 1 mL'lik 100 μg / mL DNaz I çözeltisinde yeniden askıya alın. DNase I çözeltisini damla damla yavaşça ekleyin ve tüpün oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe olmasına izin verin.
   NOT: En az 1 mL DNase I çözeltisi ekleyin. Pelet'i rahatsız etmek için 1 mL yeterli değilse, ek 1 mL ekleyin.
6. Kuluçkadan sonra, hücrelere 25 mL organoid baz ortamı (adım 1.3) ekleyin ve karıştırmak için yavaşça ters çevirin. Ardından, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
7. Yeni oluşan hücre peletlerini önceden ısıtılmış 5 mL 1x kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponunda yeniden askıya alın (bkz. Vorteksi 458 x g'ye ayarlayın ve her konik tüpteki çözeltileri vorteksleyin. Çözeltiler homojen hale geldiğinde, tüm konik tüplerin içeriğini tek bir 50 mL konik tüpte birleştirmek için serolojik bir pipet kullanın.
8. Girdaplı çözeltiyi içeren konik tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın.
   NOT: Pelet'i inceleyin. Pembe / kırmızı bir pelet RBC'lerin varlığını gösterir, bu da RBC lizis tampon adımının pelet artık kırmızı olmayana kadar tekrarlanmasını gerektirir.
9. Santrifüjlemeden sonra, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin. Ardından, peleti 10 mL PBS ile yıkayın, çözeltiyi 458 x g'de vorteksleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın.
10. Büyük hücreli bir pelet oluşursa, PBS'yi bir cam Pasteur pipet kullanarak aspire edin ve peletin üzerine 1 mL organoid baz ortamı (adım 1.3) ekleyin. Çözeltiyi 458 x g'da vorteksleyin ve 300-400 μL'yi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Mikrosantrifüj tüpünü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın.
    NOT: Hücre peletinin mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmeyen kısmı ileride kullanılmak üzere dondurulabilir (FBS'de 500 μL hücreden 1 mL'ye %10 DMSO). Dondurulmuş hücre peleti -80 ° C'de haftalarca ve sıvı azot^13'e yerleştirilirse yıllarca saklanabilir.
11. Cam bir Pasteur pipet kullanarak organoid baz ortamını (adım 1.3) dikkatlice aspire edin ve soğuk uçlar kullanarak BME'de yeniden askıya alın (bkz.
    NOT: BME miktarı, peletin boyutuna bağlıdır. % 75 BME'ye kadar yeniden askıya alınmış hücrelerle% 25 organoid baz ortam (adım 1.3) kullanılması önerilir.
12. Plaka 40 μL, 6 delikli bir plaka üzerine yeniden askıya alınmış hücre çözeltisinin alikotları. Kuyu başına beş alikot kadar plaka (Şekil 1).
13. BME'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı hemen 20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa nazikçe 2 mL tam organoid ortam (adım 1.2) ekleyin.

Şekil 1: Hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinin kaplanması. Organoid kaplamanın temsili görüntüsü. Organoid karışımın alikotları dikkatlice kaplanır ve kabarcıkların oluşmamasını sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Organoidlerin dokudan toplanması

NOT: Organoidlerin en iyi verimi için doku mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir.

1. Tümörü PBS içeren bir seyahat kabında buz üzerinde toplayın ve taşıyın.
2. Numuneyi 10 cm'lik bir doku kültürü kabına yerleştirin (Şekil 2). Tek kullanımlık bir neşter kullanarak, dokuyu kıyın. Daha sonra, tek kullanımlık bir şırınganın donuk ucunu kullanarak, homojen bir karışım oluşana kadar dokuyu ezin.
3. Forseps kullanarak, homojen doku karışımını bir ayrışma tüpüne yerleştirin. Her 1-2 mL homojenize doku için, organoid baz ortamında (adım 1.3) 7-8 mL 1 mg/mL tip II kollajenaz çözeltisi (bkz. Malzeme Tablosu) ve 1 mL DNaz I çözeltisi ekleyin. Vorteks çözeltisi 458 x g'de.
   NOT: Doku miktarı, kollajenaz çözeltisinin miktarını ve ihtiyaç duyulan tüp sayısını belirleyecektir.
4. Kollajenaz çözeltisindeyken dokuyu sıvılaştırmak için ayrışma makinesini kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Programı tek hücreli bir süspansiyon olana kadar 37C_h_TDK3 (1 saat) çalıştırın.
   NOT: Elde edilen karışım homojen değilse (yani, karışımda hala doku parçaları mevcutsa) programın yeniden çalıştırılması gerekecektir. Doku sindirilirse ancak çözelti viskoz ise, organoid baz ortamı kullanarak seyreltin (adım 1.3).
5. Homojenize edilmiş karışımı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın ve 20-40 mL organoid baz ortamı ekleyin (adım 1.3). Ardından, çözeltiyi 100 μm'lik bir hücre süzgecinden yeni etiketlenmiş 50 mL konik bir tüpe filtreleyin.
6. Filtrelenmiş karışımı 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj edin. Ardından, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
7. 1.000 μL nükleaz içermeyen suyu, 100 μL DNaz I reaksiyon tamponunu ve 10 μL DNaz I'i birleştirerek 100 μg/mL DNaz I çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Uygulanan DNaz I tedavisi, bazı hasta örneklerinde hücre agregalarının varlığından bağımsız olarak tek hücreli bir süspansiyon yapmak için yeterlidir¹².
8. Hücreleri 1 mL'lik 100 ug / mL DNaz I çözeltisinde yeniden askıya alın. DNase I çözeltisini damla damla yavaşça ekleyin ve tüpün oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe olmasına izin verin.
9. Kuluçkadan sonra, hücrelere 25 mL organoid baz ortamı (adım 1.3) ekleyin ve karıştırmak için yavaşça ters çevirin. Ardından, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
10. Yeni oluşan hücre peletini 5 mL önceden ısıtılmış 1x RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın. Her konik tüpteki çözeltileri 458 x g'de vorteksleyin.
11. RBC lizis tamponunda 5 dakika boyunca yeniden asılı kalan hücre peletini içeren konik tüpü inkübe edin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın.
    NOT: Pelet'i inceleyin. Pembe / kırmızı bir pelet RBC'lerin varlığını gösterir, bu da RBC lizis tampon adımının pelet beyaz görünene kadar tekrarlanmasını gerektirir.
12. Santrifüjlemeden sonra, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin. Ardından, peleti 10 mL PBS ile yıkayın, çözeltiyi 458 x g'de vorteksleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın.
13. Büyük hücreli bir pelet oluşursa, PBS'yi bir cam Pasteur pipet kullanarak aspire edin ve peletin üzerine 1 mL organoid baz ortamı (adım 1.3) ekleyin. Çözeltiyi 458 x g'da vorteksleyin ve 300-400 μL'yi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj.
    NOT: Hücre peletinin mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmeyen kısmı, gelecekte kullanılmak üzere dondurulabilir (FBS'de 500 μL hücreden 1 mL'ye% 10 DMSO'ya) (adım 5.1). Dondurulmuş hücre peleti -80 ° C'de haftalarca ve sıvı azot^13'e yerleştirilirse yıllarca saklanabilir.
14. Cam bir Pasteur pipet kullanarak organoid baz ortamını dikkatlice aspire edin ve soğuk uçlar kullanarak BME'de yeniden askıya alın.
    NOT: BME miktarı, peletin boyutuna bağlıdır. % 75 BME'ye% 75 yeniden askıya alınmış hücrelerle% 25 organoid baz ortam (adım 1.3) eklenmesi önerilir.
15. Yeniden askıya alınmış hücre çözeltisini 40 μL alikotlarda 6 delikli bir plaka üzerine yerleştirin. Kuyu başına beş aliquots'a kadar plaka.
16. Kuyu plakasını hemen 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa nazikçe 2 mL tam organoid ortam (adım 1.2) ekleyin.

Şekil 2: Diseksiyon öncesi tümör dokusu. Organoid jenerasyon için elde edilen tümör dokusunun temsili görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Organoidlerin geçişi

NOT: Numune birleşikse, her organoid kuyucuk haftalık olarak iki yeni kuyuya geçirilebilir.

1. 1 mL'lik bir pipet kullanarak, her bir oyuğa 1 mL organoid baz ortamı (adım 1.3) ekleyin ve ortamı ayırmak için doğrudan organoid tırnakların üzerine yukarı ve aşağı pipetleyin. Askıya alınmış peletleri içeren tüm ortamları 15 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın.
2. Karışımı içeren 15 mL konik tüpü 1.650 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Ardından, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
3. Hücre peletine 1 mL hayvansal kökenli olmayan, rekombinant enzim (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin, çözeltiyi 458 x g'de vorteksleyin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpün 37 ° C'lik bir su banyosunda 15 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin.
4. Kuluçkadan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüjleyin. Ardından, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
5. BME'deki peleti yeniden askıya alın.
   NOT: BME miktarı, peletin boyutuna bağlıdır. %75 VKİ'ye yeniden askıya alınmış hücrelerle %25 organoid baz media (adım 1.3) eklenmesi önerilir.
6. Yeniden askıya alınmış hücre çözeltisini 40 μL alikotlarda 6 delikli bir plakaya yerleştirin. Kuyu başına beş aliquots'a kadar plaka. Tüm alikotlar kaplandıktan sonra, kuyu plakasını derhal 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa nazikçe 2 mL tam organoid ortam (adım 1.2) ekleyin.

5. Organoidlerin dondurulması ve çözülmesi

1. Organoidlerin dondurulması
   1. 4.1-4.4 arası adımlarla başlayın.
   2. Hücre peletini 0.5-1 mL geri kazanım hücre kültürü dondurma ortamında yeniden askıya alın (bakınız Malzeme Tablosu) ve her kriyovale 1 mL aktarın.
   3. Daha sonra, kriyovyalleri uzun süreli depolama için bir sıvı azot tankına aktarmadan önce 2 haftaya kadar -80 ° C'de izopropanol dolu bir kaba koyun¹³.
2. Organoidlerin çözülmesi
   1. Numuneleri sıvı azot tankından çıkarın ve 37 °C su banyosunda çözün.
   2. Çözüldükten sonra, 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.650 x g'de santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.
   3. BME'deki peleti yeniden askıya alın.
      NOT: BME miktarı, peletin boyutuna bağlıdır. %75 VKİ'ye yeniden askıya alınmış hücrelerle %25 organoid baz media (adım 1.3) eklenmesi önerilir.
   4. Yeniden askıya alınmış hücre çözeltisini 40 μL alikotlarda 6 delikli bir plaka üzerine yerleştirin. Kuyu başına en fazla beş aliquot yerleştirin.
   5. Plakayı hemen 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra, kuyucuklara nazikçe 2 mL tam organoid ortam (adım 1.2) ekleyin.

6. Organoid bileşimi değerlendirmek için formalin-sabit parafin-gömülü (FFPE) slaytların gömülmesi ve üretilmesi

1. Yeterli boyutu sağlamak için organoidleri en az 10 gün boyunca kültürledikten sonra, tüm organoid ortamı kuyucuklardan çıkarın ve 1 mL% 2 paraformaldehit fiksatif (PFA) ekleyin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçkaya yatırın.
2. Kuluçkadan sonra, kültürlenmiş organoid alikotları her seferinde 1 mL PBS ile 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
3. PBS'yi her bir kuyucuktan çıkarın ve her bir kuyucuğa deiyonize H2 O'da 1 mL sıcak%₂agar ekleyin. Agar'ı eklerken, kültürlenmiş organoid alikotları bir spatula kullanarak plakadan kaldırın.
   NOT: Kültürlü organoid alikotları kaldırmadan önce agarın sertleşmesine izin vermemek önemlidir.
   1. Agarın oda sıcaklığında kuyuda katılaşmasına izin verin.
4. Küçük bir spatula kullanarak, katılaşmış agar'ı kuyudan boşaltın ve¹⁴ işlenene kadar% 70 etanol içinde 4 ° C'de 48 saate kadar bir kaset içinde saklayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
5. Numuneleri parafin 15'e gömün, slaytları 5 μm kalınlığa kadar kesin ve slaytları standart bir protokol¹⁵ kullanarak hematoksilin ve eozin (H & E, bkz. Malzeme Tablosu) boyama ile boyayın.

Sonuçlar

PDO'lar üretmek için, numuneler mekanik ve enzimatik olarak tek hücreli süspansiyonlara sindirildi. Hücreler daha sonra BME'de yeniden askıya alındı ve özel olarak tasarlanmış ortamlarla desteklendi (Şekil 3). Organoidler tipik olarak 10 günlük bir zaman diliminde kurulur, daha sonra kültürde ayrı organoidler gösterirler (Şekil 4).

Tartışmalar

Yumurtalık kanseri, tanıdaki ileri aşaması ve kemoterapi direncinin ortak gelişimi nedeniyle son derece ölümcüldür. Yumurtalık kanseri araştırmalarında kanser hücre hatları ve PDX modelleri kullanılarak birçok ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, daha temsili ve uygun fiyatlı bir in vitro modele belirgin bir ihtiyaç vardır. PDO'ların tümör heterojenliğini, tümör mikroçevresini ve primer tümörlerinin genomik ve transkriptomik özelliklerini doğru bir şekilde temsil ettiği ka...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% HEPES	Life Technologies	15630080
1% Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	30002CI
1.5 mL Eppendorf Tubes	Genesee Scientific	14125
10 cm Tissue Culture Dish	TPP	93100
10 mL Serological Pipet
100 µm Cell Filter	MidSci	100ICS
15 mL centrifuge tubes	Corning	430052
2 mL Cryovial	Simport Scientific	T301-2
2% Paraformaldehyde Fixative	Sigma-Aldrich
37 °C water bath	NEST	602052
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement	Millipore Sigma	SCM104
6 well plates	TPP	92006
70% Ethanol	Sigma-Aldrich	R31541GA
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher	12634028
Agar	Lamda Biotech	C121
B-27	Life Technologies	17504044
Centrifuge
Cultrex Type 2	R&D Systems	3533-010-02	basement membrane extract
DNase I	New England Bio Labs	M0303S
DNase I Reaction Buffer	New England Bio Labs	M0303S
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
FGF-10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
gentleMACS C Tubes	Miltenyi BioTech	130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi BioTech	130-096-427	We use the manufacturers protocol.
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	dipeptide, L-alanyl-L-glutamine
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Fisher Scientific	NC1470670
Histoplast Paraffin Wax	Fisher Scientific	22900700
Microcentrifuge
Mr. Frosty Freezing Container	Fisher Scientific	07202363S
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
p1000 Pipette with Tips
p200 Pipette with Tips
Pasteur Pipettes 9"	Fisher Scientific	1367820D
PBS	Fisher Scientific	MT21031CM
Pipet Controller
Prostaglandin E2	R&D Systems	2296
Puromycin	ThermoFisher	A1113802
Recombinant Murine Noggin	PeproTech	250-38
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Invitrogen	12648010
Red Blood Cell Lysis Buffer	BioLegend	420301
ROCK Inhibitor (Y-27632)	R&D Systems	1254/1
SB202190	Sigma-Aldrich	S7076
T75 Flask	MidSci	TP90076
Tissue Culture Hood
Tissue Embedding Cassette
TrypLE Express	Invitrogen	12604013	animal origin-free, recombinant enzyme
Type II Collagenase	Life Technologies	17101015
Vortex