In This Article

Summary

Burada, Bazi Bushen kapsülünün (BZBS) östrojen benzeri etkisi sayesinde yumurtalıklı kemirgen modelindeki RANKL / OPG sinyal yolunu düzenleyebileceğini gösteren bir protokol sunulmaktadır.

Abstract

Bu çalışma, bir Çin bitkisel bileşiği olan Bazi Bushen kapsülünün (BZBS) yumurtalıklı farelerde östrojen benzeri etkisini göstermeyi amaçlamaktadır. Dişi Sprague-Dawley (SD) sıçanları rastgele altı gruba ayrıldı: sahte ameliyatlı bir grup, bir model grup (OVX), bir progynova grubu ve BZBS grupları (1, 2 ve 4 d / kg / gün). Sahte ameliyatlı gruptakiler dışındaki tüm sıçanlara ovariektomi yapıldı. BZBS tedavisinden 4 ay sonra mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) taraması, hematoksilen ve eozin (H&E) boyama, immünohistokimya ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tespiti yapıldı. Sonuç olarak, OVX grubu ile karşılaştırıldığında, BZBS ile tedavi edilen sıçanlar, trabeküler kemik ve kemik iliği hücrelerinin sayısında ve alanında artış ve azalmış sayıda yağ hücresi gösterdi. İlaç gruplarında sağ tibianın kemik hacmi, trabeküler sayısı ve trabeküler kalınlığı arttı ve trabeküler boşluk azaldı. İlaç gruplarında 17β-estradiol ve serum kalsiyum seviyeleri yükseldi, ancak serum fosfor, sklerostin, β-CTX ve TRACP-5b seviyeleri azaldı. İlaç gruplarında RANKL ve sklerostin düzeyleri azalırken, osteoprotegerin (OPG) düzeyi arttı. Sonuç olarak, bu protokol over farelerinde Çin bitkisel bileşiklerinin terapötik etkilerini ve potansiyel moleküler mekanizmalarını çeşitli tekniklerle sistematik olarak değerlendirdi.

Introduction

Postmenopozal osteoporoz (PMOP), yetersiz over fonksiyonu, azalmış östrojen ve artmış osteoklast aktivitesi1 ile oluşan, düşük kemik kütlesi, kemik dokusunun mikromimari dejenerasyonu ve kemik trabekülünün hasarı ile karakterize bir iskelet sistemi hastalığıdır. PMOP kırıklara neden olmaya eğilimlidir ve hastaların yaşam kalitesi üzerinde ciddi etkileri olabilir. Osteoporoz dünya çapında yaklaşık 200 milyon insanı etkilemektedir2; Menopoz sonrası kadınların yaklaşık% 40'ı osteoporoz3'ten muzdariptir ve PMOP4'lü hastaların% 33'ünde kırıklar görülür. Östrojenin azalması, kemik rezorpsiyonu kemik oluşumunu aştığında nispeten artmış bir osteoklast aktivitesine5 ve azalmış kemik kütlesine yol açabilir. Bu nedenle, osteoklast aktivasyonu genellikle kemik kaybının bir işareti olarak kabul edilir6. Fizyolojik olarak, RANKL/OPG, kemik rezorpsiyonunu teşvik etmek için osteoklast aktivasyonunu düzenleyerek kemiğin yeniden şekillenmesini içeren önemli bir yol olarak hizmet eder7. Bu arada östrojen ayrıca RANKL/OPG sinyalini8 düzenleyerek osteoklast oluşumuna ve işlevine aracılık edebilir.

Son yıllarda, geleneksel tıp, farklı hastalıkları daha az advers reaksiyon ve daha iyi prognoz ile tedavi etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır 9,10. Geleneksel bir Çin tıbbı olan Bazi Bushen kapsülü (BZBS), PMOP'u önlemek ve tedavi etmek için alternatif bir yaklaşım olabilir. Cuscuta, Fructus lycii, Fructus schisandrae, Fructus cnidii, Fructus rosae laevigatae (Cherokee gül meyvesi), Ahududu, Semen Allii Tuberosi, Toosendan fructus, Herba epimedii, Morinda officinalis, Herba cistanches, Rehmannia glutinosa, Tıbbi cyathula kökü, Ginseng, Pilose boynuzu ve Hippocampus Kelloggi'den oluşur (Tablo 1), hormon benzeri etkileri olan 11 çeşit fitoöstrojen içerir. Önceki bir çalışma, BZBS'nin osteoporozu östrojen12 ile tedavi etmeye benzer şekilde östrojen benzeri bir etki11 yoluyla ateromatöz plak oluşumunu geciktirebileceğini doğrulamıştır. Bununla birlikte, östrojen eksikliğinden kaynaklanan osteoporozun önlenmesi ve tedavisinde BZBS'nin altında yatan mekanizmalar belirsizdir. Bu nedenle, bu çalışmada BZBS'nin ovariektomiye bağlı sıçan osteoporozu üzerinde kemik koruyucu bir etkisi olup olmadığını doğrulamak amaçlanmıştır 13,14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Hayvan deneyleri, Hebei Yiling Tıbbi Araştırma Enstitüsü Hayvan Araştırmaları ve Etik Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası: N2020150). 36 adet Sprague-Dawley (SD) dişi sıçan (3 aylık, 180-200 g ağırlığında) (bkz . Malzeme Tablosu) Hebei Yiling Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nün yeni ilaç değerlendirme merkezinde normal gıda ve temiz su ile beslendi ve kontrollü sıcaklıklara (20-26 °C) ve bağıl neme (%40-%70) sahip odalarda günde 12 saat yapay ışığa maruz bırakıldı.

1. Hayvan deneyi

  1. Sıçanları rastgele altı gruba ayırın, sahte ameliyatlı bir grup (SHAM grubu, 10 mL / kg / d salin), model grubu (OVX grubu, 10 mL / kg / d salin), progynova15 grubu (0.2 mg / kg / gün), düşük doz BZBS grubu (BZBSL grubu, 1 g / kg / gün), orta doz BZBS grubu (BZBSM grubu, 2 g / kg / gün) ve yüksek doz BZBS grubu (BZBSH grubu, 4 g/kg/gün).
    NOT: BZBSM grubunun dozu, insanlar için önerilen dozlardan belirlendi ve aşağıdaki gibi hesaplandı: sıçanlar için eşdeğer deneysel doz (mg / kg / gün) = insan dozu (mg / kg) / vücut ağırlığı (60 kg) x 6.3.
  2. Operasyon boyunca sıçan anestezisinin indüksiyonu ve bakımı için sırasıyla% 3 ve% 1.5 izofluran kullanın.
    NOT: Sıçanlar göz kırpmıyorsa ve pedal refleksi yoksa, anestezi derinliği doğrulanır ve sırasıyla sıçan anestezisinin bakımı yapılır.
  3. Sıçanın karnının kürkünü steril bir usturayla çıkarın ve steril bir pamuk top ile 3 kez alternatif etanol ve povidon-iyot turları kullanarak sıçanın karnının derisini dezenfekte edin. Anesteziden sonra topikal 1.5 mg / kg bupivakain enjeksiyonu ile lokal analjezi uygulayın.
    NOT: Dezenfeksiyon yöntemi, insizyonun etrafında ortalanmış ve merkezden dışa doğru başlayan dairesel bir desen benimser.
  4. SHAM grubunda steril bir neşter ile sıçanın karnına 2 cm'lik bir orta hat kesisi yapın ve orta hat insizyonunu 4-0 cerrahi sütür kullanarak dikin.
    NOT: İlk olarak, iç kas tabakası emilebilir sütür ile dikilir ve dış/cilt kapanışı monofilament ile dikilir. 10. günde, monofilamenti kesmek için makas kullanın ve monofilamenti çıkarmak için cımbız kullanın.
  5. Diğer gruplardaki sıçanlar için, steril forseps kullanarak sağlam yumurtalığı izole edin ve açığa çıkarın ve 4-0 cerrahi sütür kullanarak yumurtalık kökünde ligate edin. Steril cerrahi makas kullanarak sağlam yumurtalığı çıkarın. Orta hat kesisini 4-0 cerrahi sütür kullanarak dikin.
    NOT: Ameliyat sonrası tüm sıçanlar, sıçanlar uyanık olana ve serbestçe hareket edebilecek duruma gelene kadar 37 ° C'lik kaplarda izolasyona alındı.
  6. Belirtilen ilaçların intragastrik uygulamasından 4 ay sonra (adım 1.1'de), önce sıçatanı% 3 izofluran ile uyuşturun, sıçanın sırtından kürkü çıkarmak için epilasyon kremi kullanın ve ardından kasık derisini dezenfekte edin ve tüm alt ekstremite etanol ve povidon-iyot 3x steril bir pamuk top ile.
    NOT: İlaç günde bir kez 10 cm paslanmaz çelik gavaj iğnesi ile uygulandı. Gavaj dozu, sıçanların ağırlığına göre haftalık olarak ayarlandı.
  7. Steril cerrahi makas ve cımbız kullanarak femoral arteri ortaya çıkarmak için kasık derisini kesin ve soyun. Vakumlu kan alma tüpü kullanarak femoral arterden bir kan örneği alın ve ardından steril bir pamuk top ile kanamayı durdurmak için basınç uygulayın. Aşırı karbondioksit soluma ile sıçanları ötenazi yapın.
  8. Steril cerrahi makas ve cımbız kullanarak sağlam kaval kemiğini ortaya çıkarmak için kasık ve alt ekstremite derisini kesmeye ve soymaya devam edin. Kaval kemiğini çıkardıktan sonra steril tuzlu su ile üç kez yıkayın ve cımbız ve oftalmik makasla salin içindeki fazla kas dokusunu çıkarmaya devam edin.
  9. Steril bir pamuk top ile etanol ve povidon-iyot 3x kullanarak lomber L4'ün arka derisini dezenfekte edin. Sırt derisini kesmek ve bel L4'ü ortaya çıkarmak için steril cerrahi makas ve cımbız kullanın.
  10. Lomber L4'ün üst ve alt omurlarını bir rongeur ile kesin ve steril cerrahi makasla lomber L4 etrafındaki sakrumu kesin. İzole edilmiş lomber L4'ü salin ile üç kez yıkayın ve cımbız ve mikro makasla salin içindeki fazla kas dokusunu çıkarmaya devam edin.
  11. Tibia ve L4 omurunu oda sıcaklığında% 10 formalin doku sıvısı içinde (Malzeme Tablosuna bakınız) 3 gün boyunca saklayın.
  12. Karkası özel bir kadavra torbasına koyun ve bir hayvan karkası saklama dolabına koyun.

2. Mikro-BT görüntüleme16

  1. Mikro-CT tarayıcıyı açmak için yeşil güç düğmesine basın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve x-ışını kaynağını ısıtmak için yazılımı başlatın.
    NOT: X-ışınlarının dağılmasını önlemek için, başlamadan önce herhangi bir metal nesneyi görüntüleme alanının yakınına taşıyın. Yetersiz x-ışını ışınlaması ile adım 1.11'deki sıçan tibial dokusunun mikro-BT incelemesi bulguları etkileyebilir. Mikro-BT taraması sırasında kemik nemli tutulmalıdır. Hayvan yatağı ısınırken dışarı çıkarılmalıdır. Anahtarın, CT cihazının önünde sol alt köşede bulunan GÜVENLİK ANAHTARI üzerindeki AÇIK konuma çevrildiğinden emin olun.
  2. Bir sonraki elde etmek üzere verileri kaydetmek üzere bir dosya oluşturmak için yeni bir veritabanına tıklayarak bir veritabanı oluşturun.
  3. Yazılım kontrol penceresinde veri toplama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: x-ışını tüpü voltajı (50 kV); CT x-ışını tüpü akımı (100 μA); canlı x-ışını tüpü akımı (100 μA); görüş alanı (FOV) (18 mm); geçit tekniği yok; tarama tekniği (yüksek çözünürlüklü 4 dk).
  4. Kaval kemiğini üç kez tuzlu su ile yıkayın ve fazla suyu filtre kağıdı ile kurulayın. Konumunu sabitlemek için tibia dokusunu yatağın üzerine plastik bir film ile sarın. Cihazdaki düğmeyi çevirerek tibia dokusunu görüntüleme alanının merkezine ayarlayın.
  5. Alet kapağını kapatın ve canlı modu açın. Tibial dokuyu görüntülemek için yakalama düğmesine basın.
  6. CT tarama düğmesine tıklayarak taramayı başlatın. Görüntüyü oluşturmak için Evet'i tıklatın.
    NOT: X-ray açıldıktan sonra, cihazın üst kısmındaki turuncu ışık yanacak ve operatörün güvenliği için sürgülü kapı açılmayacaktır. Tarama tamamlandığında, 2D Görüntüleyici yazılımında yeniden yapılandırılmış çapraz ekseni, koronal düzlemi ve sagital düzlemi gösteren yeni bir pencere açılır. Kaydetmek için çizim tahtasına yapıştır'a tıklayın.
  7. Kaval kemiğini hayvan yatağından çıkarın. Analyze 12.0 yazılımını açın ve Dosya > Yükleme > İşlemi'ne tıklayarak hedef CT görüntüsünü içe aktarın. Alt Bölge iletişim kutusunu görüntülemek için Görüntü Hesaplayıcı... ve Bölge Paneli seçeneklerini tıklatın.
    1. İnteraktif seçeneğine tıklayın ve 2 mm kalınlıktaki alandaki kemiği seçin. Yüklenen birimin bir kopyasını değiştir'i seçmek için Uygula'yı tıklatın. Analiz 12.0 ekranında, BMA'yı seçmek için Uygulamalar seçeneğine tıklayın.
    2. Segment Cortex ve Segment Trabeculae'yi tıklayın, ardından Son Nesne Haritasını Kaydet'i tıklayın. Kemik mineral yoğunluğu (BMD, g/cm3), kemik hacmi fraksiyonu (kemik dokusu hacmi/doku hacmi [BV/TV], %), kemik trabekülü sayısı (Tb.N, 1/mm), kemik trabeküler kalınlığı (TB.Th, μm) ve trabeküler ayrılma derecesi (Tb.Sp, μm) dahil olmak üzere belirli parametre göstergelerinin değerini görüntülemek için Kemiği Ölç'e tıklayın.
      NOT: L4 vertebra ile mikro-BT yapılmadı.

3. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama

  1. Adım 1.11'de sıçanın tibia ve L4 omur örneklerini çıkarın ve 4 günlük bir dekalsifikasyon için% 20 formik asit çözeltisinde saklayın.
    NOT: %20 formik asit çözeltisi, 2.400 mL formaldehit çözeltisi ve 600 mL formik asit çözeltisinin karıştırılmasıyla hazırlanır.
  2. Sıçanın işlenmiş tibia ve L4 omur örneğini 3.1. adımdan itibaren gömme kutusuna koyun ve 6 saatten fazla akan su ile yıkayın.
  3. Numuneleri otomatik bir doku işlemcisi kullanarak gradyan konsantrasyonlu alkol çözeltileri (1 saat boyunca %60 etanol, 1 saat boyunca %70 etanol, 1 saat boyunca %90 etanol, 2 saat boyunca %95 etanol ve 2 saat boyunca %100 etanol) ile dehidre edin.
  4. Doku örneklerini yarı saydam hale getirmek için 2 saat ksilene yerleştirin. Dehidrasyonun sonunda, geçirgen numuneleri 3 saat boyunca 60 ° C'de parafin mumuna yerleştirin ve bunları otomatik bir işlemciye gömün.
  5. Döner bir dilimleyici kullanarak 4 μm'lik bölümleri elde edin. Bölümleri 3-8 dakika hematoksilen boyasına ve 1-3 dakika eozin boyasına yerleştirin.
  6. Lekeli bölümleri sırasıyla saf alkol ve ksilene aktarın. Optik mikroskop altında patolojik inceleme için lekeli bölümleri nötr sakızla kapatın ve sabitleyin.
  7. Dilimleri bir slayt tarayıcı ile (Malzeme Tablosuna bakınız) 40x büyütmede tarayın ve tüm tibia ve L4 omurun H&E boyama sonuçlarını elde etmek için görüntüleme yazılımını kullanın.

4. İmmünohistokimya

  1. Adım 3.5'te elde edilen 4 μm tibia kesitlerini kullanarak ısıya bağlı epitop alımını gerçekleştirin. Mikrodalgaya uygun bir kaba uygun antijen onarım tamponunu (sitrik asit tamponu, pH = 6.0) ekleyin. Taşıyıcı levhayı mikrodalgaya uygun kabın içine yerleştirin ve kabı mikrodalga fırına yerleştirin. Programı, antijen onarımını 98 ° C'de 20 dakika tutacak şekilde ayarlayın.
  2. Kabı çıkarın ve içini 10 dakika soğuk musluk suyuyla durulayın. Endojen peroksidaz aktivitesini hidrojen peroksit (% 3 H2O2) ile bloke edin (Malzeme Tablosuna bakınız), daha sonra dilimi oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  3. Bölümleri fosfat tamponlu tuzlu su içinde (PBS) yıkayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) her biri 5 dakika olmak üzere üç kez.
  4. Bölümleri normal keçi serumu bloke etme solüsyonuna koyun (Malzeme Tablosuna bakınız), ardından numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika nemli bir odada inkübe edin.
  5. Dilim örneklerine 200 μL RANKL antikoru (1:200) (Malzeme Tablosuna bakınız), OPG antikoru (1:300) (Malzeme Tablosuna bakınız) ve sklerostin antikoru17 (1:200) (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve karanlıkta 4 °C'de bir gece inkübe edin.
    NOT: Sklerostin, kemik büyümesinin negatif bir düzenleyicisidir. C-terminal sistein düğüm benzeri bir alana sahip salgılanan bir glikoproteindir ve kemik morfogenetik protein antagonistlerinin17 DAN ailesine bir dizi benzerliğine sahiptir. Bu protein RANKL yolunun bir üyesi değildir.
  6. Bölümlere biotin etiketli keçi tavşan önleyici IgG ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bölümleri PBS ile durulayın ve bölümleri oda sıcaklığında 3-5 dakika lekelemek için diaminobenzidin (DAB) ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.
  7. Bölümleri hematoksilen ile 1-2 dakika boyayın. Bölümleri kuruttuktan ve kuruttuktan sonra, nötr sakızla kapatın.
  8. Bir slayt tarayıcı kullanarak bölümleri 40x büyütmede tarayın (Malzeme Tablosuna bakın) ve otomatik mikroskop görüntüleme sistemi kullanarak dijital görüntüler yakalayın (Malzeme Tablosuna bakın).
  9. Imagepro Plus yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın).
    1. Analiz görüntüsünü içe aktarmak için Dosya'ya tıklayın. Optik yoğunluk düzeltmesi için Measure > Calibration > Intensity Calibration (Yoğunluk Kalibrasyonu) öğesine tıklayın. Segmentasyon arayüzünü görüntülemek için Ölçüm, IOD, Sayı/Boyut ve Renk Seç seçeneklerini tek tek tıklayın.
    2. HIS'i seçmek için Histogram Tabanlı seçeneğine tıklayın ve Dosya Yükle'ye tıklayın. IOD değerini ve Alan değerini oluşturmak için Sayı'ya tıklayın.

5. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) protokolü

  1. 17β-estradiolü tespit etmek için ELISA kitinin anti-17β-estradiol IgG kaplı mikroplaka (12 x 8 kuyucuk), 15 mL durdurma solüsyonu, 22 mL 17β-estradiol-HRP konjugatı, 15 mL 3,3 ', 5,5' tetrametilbenzidin (TMB) substrat çözeltisi, 50 mL 10x yıkama solüsyonu, kapak folyoları, bir şerit tutucu, 17β-estradiol kontrolü ve 17β-estradiol standardının farklı bir konsantrasyon gradyanı (bkz.
  2. 17β-estradiol kitini buzdolabından çıkarın ve tüm reaktifleri oda sıcaklığına (18-25 °C) yerleştirin.
  3. Reaktif hazırlama: 1 x yıkama solüsyonu hazırlamak için 10x yıkama solüsyonunu deiyonize su ile seyreltin. 500 mL 1x yıkama solüsyonu yapmak için 50 mL 10x yıkama solüsyonunu 450 mL deiyonize su ile karıştırın.
  4. Serum örneğini buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün.
  5. Fazla mikrotitre şeritlerini plaka çerçevesinden çıkarın, kurutucu paketi içeren folyo torbaya geri koyun, tekrar kapatın ve 4 °C'de saklayın.
  6. İlgili kuyucukların her birine 25 μL kontrol, standart veya numune ekleyin. Daha sonra, her bir kuyucuğa 200 μL 17β-estradiol-HRP konjugatı ekleyin.
  7. Tüm kuyucukları folyo ile örtün ve plakayı 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
  8. Folyoyu ve sıvıyı her bir kuyucuktan çıkarın ve kuyuyu 300 μL 1x yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın.
    NOT: Reaksiyon kuyularının taşmasını önleyin. Ayrıca, her yıkama döngüsü arasındaki ıslatma süresi >5 s olmalıdır. Sonunda, bir sonraki adımdan önce kağıt mendil şeritlerine dokunarak kalan sıvıyı dikkatlice çıkarın.
  9. Her oyuğa 100 μL TMB substrat çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika karanlıkta inkübe edin.
  10. Her bir oyuğa 100 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve mikrotitre plakasını 30 saniye boyunca hafifçe sallayın. Numunenin absorbansını 30 dakika içinde 450 nm'de ölçün.
  11. Konsantrasyona karşı standartların ortalama absorbansını çizin. Çizilen noktalara göre en uygun eğriyi çizin.
  12. Numunelerin değerlerini standart eğri üzerinde enterpolasyon yaparak pg/mL cinsinden ifade edilen karşılık gelen konsantrasyon değerlerini elde edin.
    NOT: Üreticinin talimatlarına göre serum Ca2+, fosfor, SOST, TRACP-5b ve β-CTX'i tespit etmek için diğer protokoller 17β-estradiol ölçümü ile aynıdır.

6. İstatistiksel analiz

  1. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunuldu. Çoklu karşılaştırmalar tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey testi ile yapılmıştır. p < 0.05 olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Tibianın kemik mikroyapısı mikro-BT taraması ile değerlendirildi
Over sıçanlarının BZBS ile tedavisi, OVX'in neden olduğu trabeküler yapısal değişiklikleri önemli ölçüde azalttı. Sağ tibianın rekonstrüktif mikro-BT görüntülerinde gösterildiği gibi (Şekil 1A,B), OVX grubundaki trabeküler kemik, SHAM grubuna kıyasla KMY (Şekil 1C), B/TV (Şeki...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ovariektomi sonrası, süngerimsi kemiğin sürekli azalması ve kemik döngüsünün artması nedeniyle östrojen seviyeleri keskin bir şekilde azaldı. Esasen, menopozdan sonra azalan östrojen sekresyonunun azalması önemli kemik kaybına18 neden olabilir ve bu da yumurtalıklı sıçanlarda Ca2+ kaybınayol açabilir 19,20. Östrojen almanın yumurtalıklı sıçanların metafiz kırığı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Mühendislik Akademisi'nin Stratejik Danışmanlık Projesi tarafından desteklenmiştir: Geleneksel Çin Tıbbının yaşlanma karşıtı etkisi üzerine stratejik araştırma (Hibe No.: 2022-XY-45), Çin'deki Hebei Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No.:2022106065), Hebei, Çin S&T Programı (Hibe No.:22372502D) ve Shijiazhuang Üst Düzey S&T İnovasyon ve Girişimcilik Yetenek Projesi, Hebei, Çin (Hibe No.: 07202203).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% neutral buffered formalinProteintech Group, Inc.23408-1AP-100
17-Beta-Estradiol ELISA kitsProteintech Group, Inc.21933-1-AP
3%H2O2ShanDong LIRCON Medical Technology Incorporated Company20221027
Anti-osteoprotegerin antibodyAbcamab203061
Bazibushen capsulesShijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd.XB2103001
Biotin goat anti-rabbit IgGAbcamab207995
Calcium assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC004-2-1
DiaminobenzidineZSGB-BIOZLI-9018
Estradiol valerate tabletsBayer AG156A
Gene 1580R centrifugeGENE Co. Ltd. GZ422515090077
Image-Pro PlusMedia CyberneticsIPP 6.0
Leica DM6000B Microscope (fully automated upright microscope system)Leica361715
Normal Goat Serum Blocking SolutionVector LaboratoriesS-1000-20
Phosphate assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC006-1-1
Phosphate buffered salineServicebio, Wuhan, ChinaCR10201M
Quantum GX2 microCT Imaging SystemPerkinElmerCLS149276
RANKL rabbit polyclonal antibodyElabscience Biotechnology Co. Ltd.E-EL-R3032-96T
Rat SOST (Sclerostin) ELISA kitElabscience Biotechnology Co. Ltd.E-EL-R1405c-96T
Rat TRACP-5b (Tartrate Resistant Acid Phosphatase 5b) ELISA kitAbcamab108667
Rat β-CTx (Beta Crosslaps) ELISA kitElabscience Biotechnology Co., Ltd.E-EL-R0939c-96T
Sclerostin rabbit polyclonal antibodyBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK(JING)2016-0006
Slide scannerHamamatsu Photonics K.K.Nano Zoomer-SQ
Sprague Dawley female ratsBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.ZLI-9381

References

  1. Zhai, X., et al. Muscone ameliorates ovariectomy-induced bone loss and receptor activator of nuclear factor-κb ligand-induced osteoclastogenesis by suppressing TNF receptor-associated factor 6-mediated signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 11, 348(2020).
  2. Wang, S., et al. An antioxidant sesquiterpene inhibits osteoclastogenesis via blocking IPMK/TRAF6 and counteracts OVX-induced osteoporosis in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 36 (9), 1850-1865 (2021).
  3. Xia, C., et al. Bushenhuoxue formula promotes osteogenic differentiation of growth plate chondrocytes through β-catenin-dependent manner during osteoporosis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 127, 110170(2020).
  4. Chen, Y., et al. Shikonin relieves osteoporosis of ovariectomized mice by inhibiting RANKL-induced NF-κB and NFAT pathways. Experimental Cell Research. 394 (1), 112115(2020).
  5. Lorenzo, J. From the gut to bone: connecting the gut microbiota with Th17 T lymphocytes and postmenopausal osteoporosis. The Journal of Clinical Investigation. 131 (5), e146619(2021).
  6. Meng, X., et al. Estrogen-mediated downregulation of HIF-1α signaling in B lymphocytes influences postmenopausal bone loss. Bone Research. 10 (1), 15(2022).
  7. Yue, H., et al. Comparative study of holothurin A and echinoside A on inhibiting the high bone turnover via downregulating PI3K/AKT/β-catenin and OPG/RANKL/NF-κB signaling in ovariectomized mice. Food & Function. 13 (8), 4748-4756 (2022).
  8. Wang, Z., et al. An emerging role of Prevotella histicola on estrogen deficiency-induced bone loss through the gut microbiota-bone axis in postmenopausal women and in ovariectomized mice. The American Journal of Clinical Nutrition. 114 (4), 1304-1313 (2021).
  9. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278(2022).
  10. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  11. Huang, D., et al. Bazi Bushen Capsule alleviates post-menopausal atherosclerosis via GPER1-dependent anti-inflammatory and anti-apoptotic effects. Frontiers in Pharmacology. 12, 658998(2021).
  12. Genazzani, A. R., Monteleone, P., Giannini, A., Simoncini, T. Hormone therapy in the postmenopausal years: considering benefits and risks in clinical practice. Human Reproduction Update. 27 (6), 1115-1150 (2021).
  13. Saville, P. D. Changes in skeletal mass and fragility with castration in the rat; a model of osteoporosis. Journal of the American Geriatrics Society. 17 (2), 155-166 (1969).
  14. Huyut, Z., Alp, H. H., Bakan, N., Yıldırım, S., Şekeroğlu, M. R. Stimulating effects of vardenafil, tadalafil, and udenafil on vascular endothelial growth factor, angiogenesis, vitamin D3, bone morphogenic proteins in ovariectomized rats. Archives of Physiology and Biochemistry. 128 (4), 1121-1127 (2020).
  15. Tian, Y., Xu, K. H., Qiao, L. Comparative study of effects of hormonal therapies on the healing of fracture in ovariectomized rats and Rats' endometria. Journal of Sichuan University. Medical Science Edition. 37 (3), 416-420 (2006).
  16. Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica. 30 (6), 619-634 (2014).
  17. Xu, C., et al. Sclerostin antibody promotes bone formation through the Wnt/β-catenin signaling pathway in femoral trochlear after patellar instability. Connective Tissue Research. 64 (2), 148-160 (2023).
  18. Shang, Q., et al. Jingui Shenqi pills regulate bone-fat balance in murine ovariectomy-induced osteoporosis with kidney yang deficiency. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, 1517596(2020).
  19. Ge, G., et al. Theaflavin-3,3'-digallate promotes the formation of osteoblasts under inflammatory environment and increases the bone mass of ovariectomized mice. Frontiers in Pharmacology. 12, 648969(2021).
  20. Quintero-García, M., et al. Calcium bioavailability of Opuntia ficus-indica Cladodes in an ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Nutrients. 12 (5), 1431(2020).
  21. Mattix Kramer,, J, H., Grodstein, F., Stampfer, M. J., Curhan, G. C. Menopause and postmenopausal hormone use and risk of incident kidney stones. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (5), 1272-1277 (2003).
  22. Ohlsson, C., et al. The effects of estradiol are modulated in a tissue-specific manner in mice with inducible inactivation of ERα after sexual maturation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 318 (5), E646-E654 (2020).
  23. Yahiro, Y., et al. BMP-induced Atoh8 attenuates osteoclastogenesis by suppressing Runx2 transcriptional activity and reducing the Rankl/Opg expression ratio in osteoblasts. Bone Research. 8 (1), 32(2020).
  24. Zhu, M., et al. Vinpocetine inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis and attenuates ovariectomy-induced bone loss. Biomedicine & Pharmacotherapy. 123, 109769(2020).
  25. Ardawi, M. S. M., et al. High serum sclerostin predicts the occurrence of osteoporotic fractures in postmenopausal women: the Center of Excellence for Osteoporosis Research Study. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (12), 2592-2602 (2012).
  26. Bai, S. Y., Chen, Y., Dai, H. W., Huang, L. Effect of sclerostin on the functions and related mechanisms of cementoblasts under mechanical stress. West China Journal of Stomatology. 37 (2), 162-167 (2019).
  27. Wang, T., et al. Therapeutic potential and outlook of alternative medicine for osteoporosis. Current Drug Targets. 18 (9), 1051-1068 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

T pSay 194strojen Benzeri EtkiTrabek ler KemikKemik li i H creleriYa H creleri17 estradiolSklerostinRANKLOPG