İnsan mezenkimal kök hücrelerinin elektriksel davranışını karakterize etmek için ışığa bağlı dielektroforez

Özet

Burada, ışığa bağlı dielektroforezi, heterojen hücre hatlarını, özellikle insan mezenkimal kök hücrelerini (hMSC'ler) karakterize etmek için etiketsiz bir yaklaşım olarak sunuyoruz. Bu makalede, hMSC'lerin doğal durumlarını değiştirmeden elektriksel davranışlarını karakterize etmek için fotoiletken bir tabakaya sahip bir mikroakışkan cihazın kullanılması ve optimize edilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC'ler), hastalıkların mekanik çalışmalarını yürütmek veya çeşitli terapötik uygulamalar için hasta kaynaklı bir hücre kaynağı sunar. Çeşitli olgunlaşma aşamalarındaki elektriksel davranışları gibi hMSC özelliklerinin anlaşılması son yıllarda daha önemli hale gelmiştir. Dielektroforez (DEP), hücre zarı kapasitansı ve geçirgenliği gibi hücrelerin elektriksel özellikleri hakkında bilgi edinilebilen, düzgün olmayan bir elektrik alanındaki hücreleri manipüle edebilen bir yöntemdir. Geleneksel DEP modları, hücrelerin DEP'ye tepkisini karakterize etmek için üç boyutlu elektrotlar gibi metal elektrotlar kullanır. Bu yazıda, kolayca uyumlu geometrilere sahip in situ sanal elektrotlar gibi davranan ışık projeksiyonları yoluyla hücreleri manipüle edebilen fotoiletken bir tabaka ile inşa edilmiş bir mikroakışkan cihaz sunuyoruz. Burada, hMSC'leri karakterize etmek için ışık kaynaklı DEP (LiDEP) adı verilen bu fenomeni gösteren bir protokol sunulmaktadır. Hücre hızları olarak ölçülen LiDEP kaynaklı hücre yanıtlarının, giriş voltajı, ışık projeksiyonlarının dalga boyu aralıkları ve ışık kaynağının yoğunluğu gibi değişen parametrelerle optimize edilebileceğini gösteriyoruz. Gelecekte, bu platformun etiketsiz teknolojilerin önünü açabileceğini ve hMSC'lerin veya diğer kök hücre hatlarının heterojen popülasyonlarının gerçek zamanlı karakterizasyonunu gerçekleştirebileceğini öngörüyoruz.

Giriş

İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC'ler), tip II diyabet², greft versus host hastalığı³ ve karaciğer hastalığı⁴ gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde terapötiklerde kullanılmalarına yol açan immünsüpresif özellikleri¹ ile tanınmaktadır. HMSC'ler heterojendir ve adipositlere, kondrositlere ve osteoblastlara farklılaşan hücrelerin alt popülasyonlarını içerir. HMSC'ler yağ dokusu, göbek kordonu dokusu ve kemik iliğinden türetilir ve farklılaşma potansiyelleri orijin dokuya ve kullanılan hücre kültürü sürecine bağlıdır⁵. Örneğin, Sakaguchi ve ark. tarafından yapılan bir araştırmaya göre, yağ dokusundan türetilen hMSC'lerin adipositlere farklılaşma olasılığı daha yüksektir, oysa kemik iliğinden türetilen hMSC'lerin osteositlere farklılaşması daha olasıdır⁶. Bununla birlikte, hMSC'lerin doku kökeninin farklılaşma potansiyelleri üzerindeki etkisi, hala daha fazla anlaşılması gereken bir olgudur. Ek olarak, hMSC'lerin çeşitli farklılaşma potansiyelleri, doğal heterojenliklerine katkıda bulunur ve hMSC'lerin terapötikler için uygulanmasında zorluklar yaratır. Bu nedenle, heterojen kök hücre hatlarının karakterizasyonu ve sıralanması, bu hücrelerin in vitro ve klinik uygulamalarını geliştirmek için kritik öneme sahiptir. Hücresel fenotiplerdeki farklılıkları incelemek için altın standart teknik olan akış sitometrisi, hedef hücreleri etiketlemek ve ışık saçılması veya hücreye özgü floresan özelliklerine göre karakterize etmek için hücre yüzeyi antijenlerini ve floresan boyaları kullanır ^6,7,8. Bu yöntemin dezavantajları, hücre yüzeyi antijen biyobelirteçlerinin sınırlı mevcudiyeti, ekipman ve operasyonun yüksek maliyeti ve hücre yüzeyi boyamasının hücre zarına potansiyel olarak zarar verebileceği ve terapötik uygulamaları etkileyebileceği gerçeğini içerir ^9,10,11. Bu nedenle, hücresel zarın doğal durumundan ödün vermeden hücre karakterizasyonu için yeni tekniklerin araştırılması, kök hücre terapötiklerinin klinik performansına fayda sağlayabilir.

Yüzey etiketleri kullanmayan bir hücre karakterizasyonu yöntemi olan dielektroforez (DEP), bu güncel çalışmanın odak noktasıdır. DEP, heterojen hücre popülasyonlarını elektriksel özelliklerine göre karakterize etmek için mikroakışkan platformlarda uygulanan etiketsiz veya lekelenmeyen bir yöntemdir. DEP, floresan boyamanın yerine alternatif akım (AC) elektrik alanı kullanır (yani, etiket tabanlı bir yöntem)⁷. Hücre karakterizasyonu için DEP tabanlı mikroakışkan cihazların kullanılmasının diğer avantajları arasında küçük hacimlerin (mikrolitre) kullanılması, hızlı analiz süresi, minimum hücre numunesi hazırlama gereksinimleri, minimum numune kontaminasyonu riski, minimum atık üretimi ve düşük maliyetli^12,13 yer almaktadır. DEP'nin bir diğer yararı,^14,15,16 hücrelerinin gerçek zamanlı izlenmesidir. DEP için, süspansiyondaki hücreler elektrotlarla oluşturulan düzgün olmayan bir AC elektrik alanına maruz kalır ve polarize olurlar⁶. Bu polarizasyon hücre hareketine neden olur ve uygulanan AC elektrik alanının frekansına ve voltajına bağlı olarak hücre manipülasyonuna izin verir. Frekansı, tipik olarak 5 kHz ila 20 MHz arasında ayarlayarak, hücreler sırasıyla pozitif ve negatif DEP davranışına karşılık gelen elektrotlara çekilebilir veya elektrotlardan uzaklaştırılabilir^6.

DEP karakterizasyonunun birden fazla modu vardır, yani elektrot konfigürasyonu ve / veya operasyonel stratejileri¹⁷ ile sınıflandırıldığı gibi, geleneksel, alan akışı fraksiyonasyonu ve ışık kaynaklı olarak. Geleneksel bir DEP modu olan 3DEP analizörü, fiziksel metal elektrotları içerir ve bir AC elektrik alanına hücresel yanıtı izler. Bu sistem, birden fazla üç boyutlu dairesel elektrotlu mikro kuyucuklardan oluşan bir çip kullanır ve hücre DEP davranışını karakterize etmek için ışık yoğunluklarındaki değişiklikleri tespit eder 18,19,20,21. Pozitif DEP, hücreler mikro kuyunun duvarları boyunca dairesel elektrotların kenarlarına doğru hareket ettikçe gözlenir ve bu da mikro kuyucuğun merkezinde artan ışık yoğunluğuna neden olur. Negatif DEP, mikro kuyunun merkezinde dairesel elektrotlardan uzakta kümelenen hücreler olarak gözlenir ve bu da mikro kuyucuğun merkezinde ışık yoğunluğunun azalmasına neden olur. Bu iki fenomen Şekil 1'de temsil edilmektedir. Geleneksel DEP yöntemleri, heterojen hücre popülasyonlarının elektriksel özelliklerini karakterize etme yeteneğine sahiptir 18,20,21. Örneğin, Mulhall ve ark., 3DEP analizörünü kullanarak membran kapasitans^21'deki farklılıklara dayanarak normal oral keratinositler (HOK) ve malign oral keratinosit (H357) hücre hatları arasında ayrım yapma potansiyelini göstermiştir. Bununla birlikte, geleneksel DEP modlarının bir sınırlaması sabit elektrot geometrisidir. hMSC'ler heterojen olduğundan, DEP değerlendirmeleri sırasında elektrot geometrilerini kolayca değiştirme yeteneğine sahip olmak avantajlıdır. Örneğin, tek hücreli yakalama için elektrotları veya elektrot dizilerini gerçek zamanlı olarak değiştirebilmek, hücrelerin hız ve DEP davranışına göre karakterize edilmesini sağlar. hMSC'lerin DEP değerlendirmelerinde gerçek zamanlı elektrot modifikasyonunun uygulanması, numune popülasyonunun heterojenliğini karakterize etmek için hMSC'lerin numune dokusundan tedarik edildikten hemen sonra tek hücreli analizine izin verir.

Geleneksel DEP modlarının (yani, sabit fiziksel elektrotlar) sınırlamasının üstesinden gelmek ve DEP fenomenini kullanarak gerçek zamanlı elektrot konfigürasyon modifikasyonları için yeni fırsatları keşfetmek için, ışık kaynaklı DEP (LiDEP) araştırılmıştır. LiDEP, ışık projeksiyonları yoluyla fotoiletken bir mikroakışkan cihaz^22,23 kullanarak hücreleri manipüle eden geleneksel olmayan bir DEP modudur^, lokalize elektrotlar geleneksel DEP yöntemine benzer şekilde düzgün olmayan bir elektrik alanı oluşturur. Bu yaklaşım aynı zamanda elektrot geometrisinde esneklik ve elektrotların mikroakışkan cihaz içinde hareket ettirilmesini sağlar. Bu, sabit elektrotlarla görülen sınırlamayı hafifletir ve hücresel heterojenite hakkında daha fazla bilgi edinme fırsatı sağlar. LiDEP, homojen ve heterojen hücre popülasyonlarında farklı hücre tiplerini tespit etmek ve analiz etmek için kullanılmıştır^22,23,24. Örneğin, Liao ve ark., epitel hücresi adezyon modülünü (EpCAM^neg) eksprese eden dolaşımdaki tümör hücrelerini (CTC'ler) kanser metastazı^22'deki önemini araştırmak için kırmızı kan hücrelerinden ayırmak için LiDEP'yi kullandılar. LiDEP ile tek hücreli analiz, pankreas tümörijenisitesinin^{tabakalaşması 23} ve metastaz öncesi ve sonrası örneklerde CTC'lerin analizi ile kanser hücrelerini karakterize etmek ve manipüle etmek için başarıyla kullanılmıştır²⁴.

Burada, LiDEP'in hMSC'leri çeşitli elektrot geometrileri (daire, elmas, yıldız ve paralel çizgiler) ve sistem ayarlarıyla (uygulanan voltaj, ışık yoğunluğu ve mikroakışkan cihaz malzemesi) manipüle etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz, böylece insan kaynaklı kök hücrelerin davranışını sanal elektrotlarla karakterize etmek için bir yaklaşım sunuyoruz.

Protokol

1. LiDEP mikroakışkan cihaz imalatı

NOT: İmalat süreci, üç katmanlı bileşenin birleştirilmesinden oluşur: (i) bir indiyum kalay oksit (ITO) cam substrat üzerine biriken amorf silikon (A: Si) ve molibden içeren fotoiletken bir tabaka; (ii) çift taraflı banttan kesilmiş bir mikrokanal tabakası; ve (iii) hücre süspansiyonunun giriş ve çıkışı için delinmiş deliklere sahip bir üst ITO cam substratı.

1. Fotoiletken indiyum kalay oksitin (ITO) cam kaplaması
   1. ITO kaplı cam alt tabakayı (15-20 Ω direnç) yüzeydeki azot_(N2) gazını görünür toz parçacıklarını hareket ettirmek için yeterli bir akış hızında akıtarak temizleyin. Bu adımdan sonra, substratı asetonla durulayın.
   2. Aseton kalıntılarını yıkamak, DI suyuyla durulamak ve substrat tamamen kuruyana kadar tekrar N₂ gazı akıtmak için ITO kaplı cam sürgüyü bir izopropil alkol banyosuna aktarın.
   3. Cam sürgüyü ITO kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde vakum püskürtme sistemine yerleştirin.
   4. ITO kaplı cam substrat (molibden hedefi) üzerine 0,7 Å/s biriktirme oranı ve 140 s biriktirme süresi ile 10 nm kalınlığında bir molibden tabakası püskürtün.
   5. Elektrik bağlantıları için cam alt tabakanın kenarından 2 mm uzakta bırakmak için cam alt tabakanın bir tarafına bir gölge maskesi ekleyin. Medjdoub ve ^ark.25'te açıklandığı gibi, endüktif olarak eşleşmiş plazma-plazma ile güçlendirilmiş kimyasal buhar birikimi (ICP-PECVD) kullanarak 1 μm A: Si biriktirin.
   6. Tozu ve diğer safsızlıkları gidermek için sürgüyü N₂ gazı ile temizleyin. Gölge maskesinin altında biriken herhangi bir A: Si için, A: Si'yi aşındırmak için% 25'lik bir w / v potasyum hidroksit çözeltisine kadar kenarı 2 mm'ye kadar batırın.
2. LiDEP çip cihazı imalatı
   1. Mikrokanalı oluşturmak için, çift taraflı bant (52 mm x 25 mm) elde edin ve kısa boyutun kenarından 5-6 mm uzakta ve bandın uzun kenarları arasında ortalanmış delikler (çap = 4 mm) elde edin. Delikler boyunca iki düz çizgiyi (3 mm aralıkla) kesmek için bir neşter kullanın. Çift taraflı bandın her iki yüzündeki koruyucu tabakaların tüm mikrokanal kesme adımı boyunca açık olduğundan emin olun.
   2. Üst ITO cam kızağında 3 mm çapında iki delik açın. Bant, ITO kaplı camın üstüne, bandın uzun kenarı camın uzun kenarı ile aynı hizada olacak şekilde hizalanabilir. Delik konumunu yıkanabilir bir işaretleyici ile işaretleyin. Delinen deliklerin çift taraflı bantta delinen deliklerle aynı hizada olduğundan emin olun. Bu iki delik, mikroakışkan cihazın giriş ve çıkış delikleri olarak işlev görecektir.
   3. Çift taraflı bant üzerindeki koruyucu filmin bir tarafını çıkarın, banttaki delikleri ve üst ITO cam kızağı hizalayın ve birlikte bastırın. Özellikle mikro kanalın yakınındaki hava ceplerini çıkarmak için hafifçe bastırın. Hava cepleri, ortamın veya diğer çözeltilerin bandın altına sızmasına izin verebilir, bu da mikroakışkan cihaza zarar verebilir veya küflenmeye neden olabilir.
   4. Diğer koruyucu filmi çift taraflı banttan çıkarın ve molibden ve A:Si kaplı ITO cam tarafına bastırın. 2 mm boşluk tarafının karşısındaki fotoiletken slaytın kenarını, üst ITO cam slaytın ortasına doğru olan çift taraflı bandın kenarıyla eşleştirin. Üst ITO cam slayttan ve fotoiletken malzeme kaplı ITO cam slayttan akşamdan kalma olacaktır.
   5. İyi yapışmayı sağlamak için düz bir yüzeye bastırın. Cam substratın ve çift taraflı bant katmanlarının bir şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir. Yandaki fazla bandı kesin.
   6. Fonksiyon üretecini bağlamak için A katmanının ve C katmanının kenarlarına bakır bant uygulayın. Bunu, bandı ITO'nun veya fotoiletken malzemenin yan tarafına, A katmanı mı yoksa C tabakası mı olduğuna bağlı olarak, çift taraflı bandın kenarından cam alt tabakanın kaplanmamış tarafına yaklaşık 3 cm'ye kadar sararak yapın.
   7. Başarılı bir cihaz üretimi sağlamak için, hem cam yüzeylerin kaplanmış kızakları hem de cama tutturulmuş bakır bant arasında bir direnç okuması olup olmadığını test etmek için bir multimetre kullanın.
3. DEP arabellek hazırlığı
   1. 4.25 g sakkaroz ölçün ve 50 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin. Ardından, 0.15 g glikozu ölçün ve aynı 50 mL konik tüpe yerleştirin.
   2. Konik tüpü 25 mL ultra saf suyla doldurun, kapağı kapatın ve karıştırın. Sakkaroz ve glikozun yaklaşık yarısı çözüldükten sonra, konik tüpü 50 mL hattına kadar ultra saf suyla doldurun. Tüm sakkaroz ve glikoz çözülene kadar kuvvetlice karıştırın. DEP tampon çözeltisi %8,5 (w/v) sakkaroz ve %0,3 (w/v) glikoz içerir.
   3. Hazırlanan sükroz ve glikoz çözeltisinden 20 mL elde edin ve 50 mL'lik bir konik tüpe yerleştirin. Daha sonra, 0.1 g sığır serum albümini (BSA) ölçün ve sakkaroz ve glikoz çözeltisini içeren 50 mL konik tüpe yerleştirin. BSA çözülene kadar vorteks. Son DEP arabellek çözeltisi %0,5 (w/v) BSA içerir.
4. Hücre hazırlama
   1. Önceki çalışmalarda açıklanan hücre kültürü protokolünü kullanarak 1 mL büyüme ortamında askıya alınmış en az 1 x 10⁶ hücre (hMSC'ler veya HEK 293) elde edin^26,27. Hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
   2. HEK 293 hücrelerini 201 x g'de 5 dakika ve hMSC'leri 290 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin ve hücreleri% 0.5 BSA ile DEP tampon çözeltisinin 1 mL'sinde yeniden askıya alın. Arabellek çözeltisini çok hızlı eklemediğinizden emin olun, çünkü kabarcıklar oluşabilir.
   3. Santrifüjleme işlemini iki kez daha tekrarlayın ve ardından DEP karakterizasyonu için DEP arabelleğindeki hücreleri %0,5 BSA ile yeniden askıya alın. Listelenen hücre hazırlama protokolü 10 çalıştırma için yeterlidir. Örneğin, bir frekans testi en az 15 çalışma gerektirir ve bu nedenle, 1 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonda 2 mL hücre yapılması gerekir.

2. LiDEP karakterizasyonu

1. Deneysel kurulum
   1. LiDEP'e hücresel yanıtları ölçmek için deneysel kurulum için aşağıdaki ekipmanları bir araya getirin: bir dizüstü bilgisayar, bir projektör, bir objektif lens, bir dijital mikroskop ve bir fonksiyon üreteci. Işık projeksiyonlarını (yıldız, elmas, üç çizgi ve oval) tasarlamak için dizüstü bilgisayarı kullanın ve projektöre bağlayın.
   2. Işık projeksiyonlarını LiDEP yongasının fotoiletken yüzeyine (C katmanı) görüntülemek için projektörü ışık kaynağı olarak kullanın. Işık kaynağından (projektör) gelen ışığın 10x objektif lensten LiDEP çipinin mikrokanal bölgesine geçeceği şekilde ayarlayın. 10x objektif lens, projektör lensinin üzerine oturur. Ek Şekil 1 , projektörün LiDEP sistemine entegrasyonunu göstermektedir.
   3. AC elektrik alanını uygulamak için LiDEP çipini fonksiyon üretecine bağlayın. Görüntüleme ve video kaydı için dijital mikroskop kullanarak LiDEP kuvvetini yaşayan hücreleri gözlemleyin. Şekil 1B, deney cihazının bir şemasını göstermektedir. Test edilen tüm hücreler için standart hücre kültürü protokolleri^26,27'yi izleyin.
2. Deneysel prosedürler
   1. Mikrokanalı% 70 etanol, ardından% 0.5 BSA çözeltisi ile yıkayın. Etanol ve önceki hücrelerin tamamen yıkandığından emin olmak için mikrokanalı% 0.5 BSA çözeltisi ile iki kez daha yıkayın. DEP alanına zaten maruz kalmış olan hücreler, yeni hücrelerden farklı yanıt verir ve veri toplamayı kesintiye uğratabilir.
   2. %0,5'lik BSA çözeltisini bir pipetle çıkarın ve mikroakışkan cihazı cihaz tutucusuna takın.
   3. Timsah klipslerini cihazdaki bakır bant bağlantılarının her birine takın. Fonksiyon üretecini istenen voltaja (voltaj tepeden tepeye, V_pp) ve frekansa (Hz) ayarlayın. Burada test edilen frekans aralığı 30 kHz ila 20 MHz idi.
   4. Cihaz mikro kanalına 70 μL hücre süspansiyonu (hücreler +% 0,5 BSA içeren DEP tampon çözeltisi) ekleyin. Mikrokanalın inceliği (~ 0,05 mm) nedeniyle, giriş ve çıkış deliklerinden dökülme meydana gelebilir. Dökülme miktarını azaltmaya yardımcı olmak için daha küçük bir pipet ucu kullanın ve ucu deliğin içinde mikro kanala doğru hafifçe eğin. Herhangi bir erişim çözeltisi (% 0,5 BSA veya çözelti içindeki hücreler) tek kullanımlık kağıt mendillerle silinebilir ve biyolojik tehlike atıklarına atılabilir.
   5. İstenilen sanal elektrot geometrisini (burada, daireler, elmaslar, yıldızlar ve / veya paralel çizgiler) LiDEP çipine yansıtın.
   6. Dijital mikroskop yazılımında, video uzunluğunu 3 dakikaya ayarlayın. Bir laboratuvar zamanlayıcısını 2 dakika 30 sn'ye ayarlayın. Hücreler LiDEP çipinin mikro kanalında durduktan sonra, video kayıt işlemine başlamak için dijital mikroskop yazılımında Başlat'a basın.
   7. 10 saniye bekleyin, ardından AC elektrik alanını uygulamak için işlev üreteci kanal çıkışının Açma düğmesine basın ve zamanlayıcı için Başlat'a basın. Hücre DEP davranışını dijital mikroskopla izleyin ve kurulumun etrafında titremeyi veya hareketi önleyin.
   8. Zamanlayıcı söndüğünde, fonksiyon üreteci kanal çıkışının Açma (ON ) düğmesine basın. Bu, fonksiyon jeneratörü kanal çıkışını kapatır ve AC elektrik alanı artık elektrotlardan beslenmez. Video kaydını 3 dakikada durdurun ve gelecekteki analizler için dijital mikroskopa kaydedin.
   9. %0,5 BSA içeren 60 μL DEP arabelleğini yavaşça mikro kanala iterek ve aynı anda çıkışta toplayarak hücreleri LiDEP yongasının çıkış ucundan dışarı pipetleyin. Mikrokanalda çok az hücre olana veya hiç hücre kalmayana kadar devam edin.
   10. Tüm frekanslar test edilene kadar 2.2.3-2.2.9 arasındaki adımları yineleyin.

Sonuçlar

Gerilim ve elektrot renk testleri, adım 2.2.3 ve adım 2.2.10'da küçük bir değişiklikle yukarıdaki prosedür kullanılarak tamamlanmıştır. Gerilim testi için elektrot rengi ve frekansı sabit kaldı ve 5 V pp, 10 V pp ve 20 V_pp uygulandı. Elektrot renk testi için, uygulanan voltaj ve frekans 30 kHz ve 20 V_pp'de sabit tutuldu ve mavi, kırmızı, beyaz ve sarı (sırasıyla HEX renk kodları #4472C4, #FF0000, #FFFFFF ve #FFFF00 ile referans verilen) yansıtılan elektrotlar incelendi. Hücre canlılığı, hücrelerin tripan mavisi ile boyanması ve hemositometre kullanılarak canlı ve ölü hücre sayısının sayılmasıyla incelendi.

LiDEP kurulumuyla, hMSC'leri manipüle edebildik ve hücrelerin elektriksel davranışını karakterize etmenin bir yolu olan giriş frekansına yanıt olarak DEP yanıt eğrileri oluşturabildik. Sanal elektrotlarla üretilen düzgün olmayan AC elektrik alanına tutarlı hücre davranışını gözlemlemek için uygulanan voltaj ve yansıtılan elektrot rengi (yani, bir grafik düzenleyici yazılımı ile oluşturulan farklı renklere sahip şekiller) gibi parametreleri manipüle ederek en uygun çalışma koşullarını bulmak için bir dizi deney yapılmıştır. Geleneksel olmayan DEP olan LiDEP kullanılarak hücre yanıtları için toplanan veriler, geleneksel DEP olan 3DEP analizöründen elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldı.

İlk optimizasyon testi, LiDEP çipindeki hMSC'lerin (yani, sanal elektroda doğru hareket eden hücrelerin) pozitif DEP tepkisine odaklandı. Pozitif bir DEP yanıtı göstermeyen hücreler ya sanal elektrottan uzaklaşarak negatif bir DEP yanıtı gösterdiler, durağan ve dönüyorlardı ya da elektrik alanına yanıt vermiyorlardı. Hücrelerin yanıtı, 2 dakikalık 30 sn'lik bir süre boyunca ImageJ'deki hızları (μm / s) izlenerek ölçüldü. Sanal elektrot için sarı oval bir projeksiyon kullanıldı ve 5 V pp, 10 V pp ve 20 V _pp uygulanan voltajlar 30 kHz'lik bir frekansta incelendi. AC elektrik alanı tutarlılık ve aykırı değerleri en aza indirmek için açıkken sanal elektrotun 50 μm içindeki hücrelere odaklandık. 20 V pp, HEK 293 hücrelerinin ortalama 0.035 μm / s hızıyla en hızlı hücre hareketi ile sonuçlandı ve bunu 10 V_pp'de 0.032 μm / s ve 5 V_pp'de 0.020 μm / s izledi, yani bu hücreler nispeten homojen bir kontrolü temsil ediyor. Benzer bir eğilim, Şekil 2A'da olduğu gibi 20 V pp'de 0.051 μm / s, 10 V_pp'de 0.036 μm / s ve 5 V_pp'de 0.025 μm / s ortalama hıza sahip olan hMSC'ler için de gözlenmiştir (burada, * p < 0.05'i gösterir). 20 V_pp'de, hMSC'lerin aynı anda pozitif ve negatif DEP yaşadıkları gözlendi. Bu, 10 V pp ve 5 V_pp'de gözlenmedi. DEP kuvvetini deneyimledikten sonra hMSC'lerin canlılık bulguları, daha yüksek voltajların genellikle daha düşük hücre canlılığı ile sonuçlandığını, hücrelerin% 66'sının 5 V pp'de canlı olduğunu, hücrelerin% 58'inin 10 V pp'de canlı olduğunu ve hücrelerin% 57'sinin 20 V _pp'de canlı olduğunu, Şekil 2B'de olduğu gibi (burada, ** p < 0.01'i gösterir).

LiDEP'in optik tabanlı bir sistem olması nedeniyle, ışık yoğunluğu ve elektrot rengi, LiDEP çipinin performansını kontrol etmek için kolayca ayarlanabilen parametrelerdir. Burada, hücrelerin DEP yanıtları üzerindeki etkiyi belirlemek için, yansıtılan şekle bağlı olarak üretilen farklı elektrot renkleri (beyaz, sarı, kırmızı ve mavi) değerlendirildi. HEK 293 hücreleri ve hMSC'ler 20 V_pp ve 30 kHz'de değerlendirildi. Beyaz, sarı, kırmızı ve mavi renkli elektrotlar seçildi, ancak LiDEP çipinden geçen aydınlatma, kırmızı-turuncu renge sahip fotoiletken tabakadan etkilendi. Böylece, yansıtılan beyaz elektrot beyaz bir iç mekanla sarı göründü, kırmızı elektrot kırmızı bir anahat ile turuncu göründü ve mavi elektrot açık yeşil göründü (Şekil 3A-D). Bu dört renk için güç çıkışları aşağıdaki gibidir: sırasıyla beyaz, sarı, kırmızı ve mavi için 77,7 μW ± 0,7 μW, 92,7 μW ± 1,3 μW, 21,9 μW ± 0,2 μW ve 56,7 μW ± 0,9 μW. Bu, sarı ve beyazın en güçlü DEP alanına sahip olduğunu, mavi ve kırmızının ise Şekil 3E'de olduğu gibi daha zayıf olduğunu güçlü bir şekilde göstermektedir (burada, ***, HEK 293 hücreleri için p < 0.001'i ve **, hMSC'ler için p < 0.01'i gösterir). DEP kuvvetinin uygulanması sırasında sarı ve beyaz sanal elektrotların kenarlarındaki hücrelerin sabit dönüşü de gözlendi. Tüm elektrot renk varyasyonları için, voltaj testi için 20 V_pp'de gösterilenlerle ilişkili olarak eşzamanlı negatif ve pozitif DEP yanıtları meydana geldi. Ek olarak, hücrelerin hızı elektrot rengine göre değişirken, 50 μm sınırındaki hemen hemen tüm hücreler LiDEP'e yanıt verdi. hMSC'lerin boyutu 19.2 μm ± 5.8 μm olarak ölçüldü.

LiDEP'in geleneksel elektrotlarla DEP'e kıyasla kapasitesini değerlendirmek için, LiDEP kullanan hücrelerin DEP davranışı ile 3DEP analizörü tarafından analiz edilen hücrelerin DEP davranışı arasındaki farkları değerlendirdik. hMSC'lerin DEP yanıtı, %0,5 BSA (~100 μS/cm) ile düşük iletkenliğe sahip bir DEP tampon çözeltisinde ölçülmüştür. 3DEP analizörünü taklit etmek için, 10 V_pp'de tek bir oval sarı sanal elektrot yansıtıldı. hMSC'lerin DEP davranışı 30 kHz ila 20 MHz arasında karakterize edildi. 25 kHz'den daha düşük frekanslarda, elektroliz gözlemledik, bu da mikroakışkan cihaz içindeki metal tabakanın yüzeyinde kabarcık oluşumuna neden oldu. LiDEP için, daha düşük frekanslarda, hMSC'ler, sanal elektrota çekilen hücrelerin yüzdesi olarak temsil edilen Şekil 4A'da olduğu gibi pozitif DEP kuvveti yaşadılar. Hücreler, frekans arttıkça zayıflayan güçlü bir pozitif DEP kuvveti ile başladı. Hücreler 30 kHz'den 97 kHz'e kadar en güçlü pozitif DEP kuvvetini yaşadılar. AC elektrik alanını bu frekanslarda uyguladıktan sonra, bazı hücreler yanıt vermezken, diğer hücreler negatif DEP davranışı gösterdi. Bu eğilim, 3DEP analizörü kullanılarak ölçülen gözlemlenen yanıttan sapmaktadır; hücreler pozitif DEP'de 37 kHz'den 255 kHz'e yükseldi ve pozitif DEP'de Şekil 4B'de olduğu gibi 1.772 kHz'den 20 MHz'e düştü.

Şekil 1: hMSC'ler için burada açıklanan LiDEP protokolü için deneysel kurulum. (A) LiDEP çipinin fotoiletken katman ve deney düzeneği ile şematik ve gerçek görüntüsü. (B) 3DEP analizöründeki hücrelerin pozitif ve negatif DEP yanıtlarının temsili görüntüleri (geleneksel DEP elektrotları kullanılarak, üstte) ve LiDEP kullanan hücrelerin pozitif ve negatif DEP yanıtlarının şematik gösterimi (sanal elektrotlar olarak ışık projeksiyonları kullanılarak, alt). (C) Cihaza sanal elektrotlar olarak yansıtılabilecek farklı şekillere örnekler. Şekil BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: hMSC'lerin DEP yanıtlarının (hızının) karakterizasyonu ve verilen koşullar altında yaşayabilirlikleri. (A) hMSC'lerin pozitif DEP yanıtlarının 5 V pp, 10 V_pp ve 20 V _pp'ye ölçülen hızları. hMSC'ler 20 V pp'de 0,051 μm/s'de, 10 V pp'de 0,036 μm/s'de ve 5 V _pp'de 0,025 μm/s'de hareket etti. (B) Sanal elektrotlarla üretilen pozitif DEP kuvvetini deneyimledikten sonra hMSC'lerin yaşayabilirliği. Canlılık, 20 V_pp, 10 V pp ve 5 V_pp için sırasıyla% 57,% 58 ve% 66 idi. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil eder. İstatistiksel analiz, t-testleri kullanılarak havuzlanmış veri setleri üzerinde tamamlanmıştır (*p < 0.05 ve **p < 0.01). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Homojen (HEK 293) ve heterojen (hMSC) hücre hatları arasındaki DEP yanıtlarının karşılaştırılması. hMSC hücrelerinin 20 V_pp ve 30 kHz'de (A) beyaz, (B) sarı, (C) kırmızı ve (D) mavi elektrotlara pozitif DEP yanıtı. (E) HEK 293 hücrelerinin ve hMSC'lerin farklı renkli elektrotlara hız tepkileri. HEK 293 hücreleri, sırasıyla 0.035 μm / s ve 0.033 μm / s'de sarı ve kırmızı elektrotlarla en yüksek hızları sergiledi. HEK 293 hücreleri, mavi elektrotlarla 0.027 μm / s'de en düşük hızı sergiledi. hMSC'ler, sırasıyla 0.068 μm / s ve 0.049 μm / s'de sarı ve beyaz elektrotlarla en yüksek hızları sergiledi. hMSC'ler, kırmızı elektrotlarla 0.039 μm / s'de en düşük hızı yaşadı. Hata çubukları SD'yi temsil eder. t-testleri kullanılarak havuza alınmış veri kümelerinde tamamlanan istatistiksel analiz (*p < 0,05, **p < 0,01 ve ***p < 0,001). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: LiDEP ve 3DEP kullanarak hMSC'lerin DEP yanıtlarını karşılaştırma. hMSC'lerin DEP yanıtları (A) LiDEP ve (B) 3DEP analizörü ile 10 V_pp'de ölçülmüştür. LiDEP ile, hMSC'lerin pozitif DEP yanıtında 30 kHz'den 20 MHz'e bir düşüş oldu. 3DEP analizöründen, hücreler pozitif DEP'de 37 kHz'den 255 kHz'e yükseldi ve pozitif DEP'de 1.772 kHz'den 20 MHz'e düştü. Hata çubukları SD'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Bu protokoldeki deneyler için kullanılan LiDEP kurulumunun temsili görüntüleri. Projektörün entegrasyonunu gösteren LiDEP sisteminin yakınlaştırılmış resmi. Işık, kaynaktan (projektör) 10x objektif lensten LiDEP çipinin mikro kanalına geçer. 10x objektif, projektör lensinin üst kısmında yer alır. Her bileşen resimlerde numaralandırılmıştır ve yan tarafta listelenmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: Beyaz, sarı, kırmızı ve mavi sanal elektrotlara yanıt veren hMSC'lerin temsili videosu. Hücreler pozitif DEP (sanal elektrota doğru hareket eden), negatif DEP (sanal elektrottan uzaklaşan), sabit ve dönen veya elektrik alanına yanıt vermeyen deneyimler olarak görselleştirilir. HMSC'ler 37 kHz ve 20 V_pp'de test edildi ve video 20 kat hızlandırıldı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

HCSC'lerin heterojenliğinin incelenmesi, terapötiklerdeki ilerlemeleri için önemlidir. Bu çalışma, LiDEP'i hMSC'lerin değerlendirilmesi için analitik bir araç olarak kullanmak için ilk adımı sağlar. LiDEP'deki hücrelerin pozitif DEP yanıtının voltaj bağımlılığını, hızı ölçerek inceledik. Daha yüksek gerilimlerin daha güçlü pozitif DEP kuvveti üretmesi bekleniyor ve bu paterni ölçülen hızlarla gözlemledik. 10 V pp ve 20 V_pp voltajlar, LiDEP kullanılarak hMSC'lerin manipülasyonu için yeterliydi. Düşük voltajlar (yani, 5 V_pp) daha yavaş hücre tepkileriyle sonuçlandı; hMSC'ler için optimal olmasa da, bu diğer hücre tipleri için avantajlı olabilir. hMSC'lerin yaşayabilirliğinde voltaja bağlı olarak yaklaşık% 9'luk bir azalma vardı. Bu, biyolojik hücrelerin incelenmesinde geleneksel DEP ve LiDEP kullanımının hücre canlılığını azaltmadığı önceki literatür 6,12,28,29'dan biraz farklıdır. Bununla birlikte, her çalışmada deneysel amaç değişmiştir. Glasser ve Fuhr, hücre kültürü ortamı^28'deki metal elektrotlar üzerinde yapışkan L929 fare fibroblastlarının büyümesini izledi. Tersine, Lu ve ark. AC elektrik alanlarına farklı süreler boyunca maruz kalan nöral kök hücrelerin yaşayabilirliğini incelemişlerdir¹². Adams ve ark. hMSC'lerin dielektrik özelliklerini metal elektrotlar¹² ile karakterize ettiler ve Li ve ark. Lösemi hücrelerini LiDEP²⁹ ile manipüle ettiler. Bu çalışmalarla bizim aramızdaki fark, gözlemlediğimiz canlılıktaki azalmanın nedeni olabilecek BSA kullanımıydı. Bununla birlikte, daha düşük genel canlılık, burada oluşturulan protokolde kullanılan maruz kalma süresinden (2 dakika 30 sn) de kaynaklanabilir. Bu süre, düzgün olmayan AC elektrik alanına maruz kalma sırasında hücre manipülasyonunu görselleştirmek için yeterli zaman sağlamak için seçildi.

Hücre karakterizasyonu yöntemleri, protokolde açıklandığı gibi inşa edilen LiDEP sistemimizin yeteneklerini ve sınırlamalarını belirlemek için elektrot rengi aracılığıyla test edilmiştir. Bu özel protokolde, elektrot rengi, bir grafik düzenleyici dosyası aracılığıyla yansıtılan şeklin rengine göre kontrol edilebilir. Dört renk kullandık: beyaz, sarı, kırmızı ve mavi. Her renk için güç çıkışı okumalarından, öngörülen sarı (#FFFF00) ve beyaz (#FFFFFF) elektrotların daha yüksek yoğunluklara sahip olduğu ölçüldü, bu da bu renklerin sonraki deneylerde kullanılmasının neden daha uygun olduğunun temelini oluşturdu. Ek olarak, fotoiletken malzemelerin^30,31 ışık yoğunluğuna bağımlılığı nedeniyle^, sonuçlar LiDEP cihazlarının performansının fotoiletken A: Si'ye dayandığını ve yansıtılan elektrot renginin seçimi ile ayarlanabileceğini göstermektedir. HMSC'lerin pozitif ve negatif DEP yanıtlarının bir kombinasyonu, geleneksel DEP yöntemlerinde görülen fenomene benzeyen LiDEP kullanılarak da gözlenmiştir. Her elektrot renginde, hMSC'ler negatif DEP kuvveti, pozitif DEP kuvveti ve hücre rotasyonu yaşadı, bu da hücre örneğinin tek bir frekansta heterojen olduğunu gösterdi (Ek Video 1). Bu, Adams ve ^ark.6'nın hMSC'lerin tek bir frekansta hem negatif hem de pozitif DEP davranışı sergilediği bulgularıyla aynı fikirdedir. Bu koşullar (elektrot rengi, elektrot şekli ve fotoiletken malzeme), hMSC numunelerinde heterojenlik seviyesini tespit etmek için ek parametreler sağlayabilir.

Son olarak, LiDEP değerlendirmesinin sonuçları, hMSC DEP davranışının bir ölçütü olarak 3DEP analizöründen elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır. hMSC'lerin pozitif DEP yanıtının frekans aralığında bir fark gözlendi, ancak LiDEP ve 3DEP analizörü aracılığıyla toplanan verilerdeki eğilimler genel olarak benzerdi (yani, pozitif DEP yanıtı artan frekansla azaldı). AC elektrik alanı LiDEP çipine verildiğinde ve üzerine ışık yansıtıldığında, ışık projeksiyonu içindeki alandaki iletkenlik düştü ve düzgün olmayan bir elektrik alanı oluşturdu. Bu nedenle, ışık kaynağının özellikleri (yani, yoğunluk ve dalga boyu), voltaj ve elektrot renk değişimi testlerinin sonuçlarından görüldüğü gibi, LiDEP çipi içindeki hücrelerin beklenen tepkisini etkiler. Değiştirilebilen diğer parametreler, fotoiletken tabakanın malzemesi ve DEP tampon çözeltisinin iletkenliğidir. Bu nedenle, hücrelerin DEP davranışını değerlendirmek için kullanılan koşullar, LiDEP sisteminin kurulumuna göre değerlendirilmelidir. Tersine, 3DEP analizörü veya DEP kuvvetini uygulamak için metal elektrotlar kullanan diğer yöntemler için, elektrot özellikleri sabittir ve incelenen hücreler için gerekli olana uyum sağlamak için anında değiştirilemez. Pozitif DEP davranışının bu varyasyonu, hMSC örnekleri, tek hücreli analiz veya hücre sıralama içindeki farklı hücre tiplerinin karakterizasyonuna yönelik gelecekteki araştırmalar için yararlı olabilir. Ek olarak, hücreler sanal elektrotlardan uzaklaştıkça, AC elektrik alanı zayıflar. Bununla birlikte, 3DEP analizörü veya metal elektrotlar kullanan diğer geleneksel DEP modlarıyla, daha fazla hücrenin manipüle edilmesine izin veren daha büyük bir elektrik alanı bölgesi uygulanabilir. Bu nedenle, LiDEP deneyi başına daha az hücre, LiDEP çipinin mikro kanalı içindeki AC elektrik alanının etkilerini yaşadı. Daha fazla tutarsızlık, halen araştırılmakta olan zaman içinde cihaz performansındaki değişikliklerden (yani, 2 saat veya 3 saat) kaynaklanabilir. Su, etanol ve DEP tampon çözeltisinin sürekli akışı, mikrokanal tabakasının yüzeyini (yani fotoiletken malzemeyi) parçalayabilir ve dikkate alınması gerekir. Hücre karakterizasyonu için zaman içindeki cihaz performansının, bir LiDEP yongasının uzun süreli kullanımı için de dikkate alınması gerekir. Deneysel parametrelerde gerçek zamanlı olarak yapılan değişiklikler sadece birkaç saniye ila birkaç dakika sürdü. Elektrot rengi ve geometrileri, grafik düzenleyici yazılımındaki ayarlar kullanılarak anında ayarlandı.

Özetle, bu makale LiDEP'in hMSC'ler gibi heterojen hücre popülasyonlarına sahip bir hücre hattını manipüle etme ve karakterize etme yeteneklerini göstermektedir. Bu kurulumu ve açıklanan protokolü kullanarak, 20 V_pp ve öngörülen sanal sarı elektrotlar koşulları altında hMSC'lerin başarılı bir şekilde karakterize edilmesini sağladık. Gelecekteki çalışmalar, hMSC'lerin LiDEP aracılığıyla oluşturulan AC elektrik alanına maruz kalma süresini ayarlamaya, sanal elektrotların ışık yoğunluğunu artırmaya ve heterojen kök hücre popülasyonlarının elektriksel imzalarının bir LiDEP kataloğunu geliştirmek için farklı hMSC kaynaklarını (veya diğer kök hücre popülasyonlarını) değerlendirmeye odaklanmalıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300054
10x objective	AmScope	---	Ordered from Amazon.
Amorphous silicon (A:Si)	Millipore Sigma	S5130
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240-062
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9706-100
Copper Tape	Zehhe	BF4964
Dextrose	Fisher	D16-1	This is glucose.
Digital microscope	Keyence	VHX-7000
Double Sided Tape	Insulectro	FLX000484
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Fetel Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
Function Generator	Tektronix	AFG 31102
Graphic editor software	Microsoft Office Powerpoint	---
Indium tin oxidec coated glass slides	MSE Supplied	GL0333
L-Alanyl-L-Glutamine	ATCC	PCS-999-034
Laptop	Dell	Inspiron 14, 2-in-1
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium	ATCC	PCS-500-030
Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs	ATCC	PCS-500-040
Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X)	Giblo	A10490-01
Molybdenum	Kurt J. Lesker	EJTMOXX352A4
Phenol Red	Sigma	P5530
Power Meter	Thor Labs	S130VC/PM400
Projector	Vecupoi	---	Ordered from Amazon.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco	11875-093	This media has L-Glutamine and Phenol Red.
Sucrose	Fisher	BP220-1
Trypan Blue Stain	Gibco	15250-061	0.40%
Trypsin Neutrilizer	Gibco	R002100
Vacuum Sputtering System	Denton	DV-502M