JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, farelerin merkezi ve periferik sinir sistemlerinin diseksiyonunu tamamlamak için bir protokol sunuyoruz. Diseke edilen dokular, brüt fotoğraf çekme veya histoloji gibi aşağı akış uygulamalarında daha fazla analiz edilir.

Özet

Hayvan modelleri, sinirbilim alanının beygir gücünü temsil eder. Buna rağmen, bugün, tam bir kemirgen sinir sistemini incelemek için adım adım bir protokol yoktur ve onu temsil eden ve serbestçe temin edilebilen tam bir şema yoktur. Sadece beyni, omuriliği, belirli bir dorsal kök ganglionunu ve siyatik siniri (ayrı ayrı) hasat etmek için yöntemler mevcuttur. Burada, merkezi ve periferik murin sinir sisteminin ayrıntılı resimlerini ve bir şemasını sunuyoruz. Daha da önemlisi, diseksiyonunu gerçekleştirmek için sağlam bir prosedürün ana hatlarını çiziyoruz. 30 dakikalık ön diseksiyon adımı, omur içindeki sağlam sinir sisteminin, iç organlardan ve deriden arındırılmış kaslarla izole edilmesini sağlar. Omuriliği ve torasik sinirleri ortaya çıkarmak için bir mikro diseksiyon mikroskobu altında 2-4 saatlik bir diseksiyon takip eder ve son olarak tüm merkezi ve periferik sinir sistemini karkastan soyar. Bu protokol, küresel olarak sinir sisteminin anatomisini ve patofizyolojisini incelemede ileriye doğru atılmış önemli bir adımı temsil etmektedir. Örneğin, bir nörofibromatozis tip I fare modelinden diseke edilmiş dorsal kök gangliyonları, tümör ilerlemesindeki değişiklikleri çözmek için histoloji için daha fazla işlenebilir.

Giriş

Bu yöntemin genel amacı, bir farenin merkezi ve periferik sinir sistemini tek parça halinde izole etmektir. Şu anda bir kemirgenin tüm sinir sistemini küresel düzeyde incelemek için incelemek için bir protokol yoktur. Sinirbilimciler tipik olarak siyatik siniri herhangi bir periferik sinir1 için bir vekil olarak ve L3 ila L5 ganglionları2'yi herhangi bir ganglion için bir vekil olarak kullanırlar. Bu yöntemleri kullanarak, sonuçların belirli bir sinire / gangliyona özgü olup olmadığı sonucuna varmak imkansızdır. En azından bazı sinir patolojilerinin tüm sinirleri ve ganglionları eşit derecede etkilemediği bilindiğinden 3,4,5, tüm kemirgen sinir sisteminin izolasyonuna izin vermek için küresel olarak incelemek için bir teknik geliştirilmelidir.

Yıllar geçtikçe, farelerin tüm merkezi ve periferik sinir sistemlerini incelemek için bir yöntem geliştirdik ve rafine ettik. İlk adım, esasen, diseksiyon mikroskobu altında mikro diseksiyon adımlarına hazırlık olarak farelerin kaba bir diseksiyonudur. 2'den 4'e kadar olan adımlarda, omurilik ve torasik sinirler açığa çıkar, beyin diseke edilir ve tüm omurilik ve periferik sinirler karkastan soyulur.

Bu yöntem, herhangi bir makroskopik veya mikroskobik değişikliği belgelemek için görüntüleme veya histoloji ile birleştirildiğinde güçlüdür 6,7,8,9. Küresel değişimi araştırmak veya hipoteze dayalı olmayan deneyler yapmakla ilgilenen sinirbilimciler, küresel sinir sistemini araştırmak için bu yöntemi kullanmalıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan protokoller, Kanada Hayvan Bakımı Sertifikalı Kurum Konseyi olan Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke tarafından onaylanmıştır.

1. Mikrodiseksiyon için hazırlık (pre-diseksiyon)

  1. % 5 izofluran ile anestezi yapın, ardından% 2 izofluran ve 10 psi CO2 ile ötanazi uygulayın.
    NOT: Omuriliğe ve servikal ganglionlara zarar verdiği için servikal çıkık yapmayın.
  2. Ötenazi yapılmış fareyi yukarı bakacak şekilde (ön görünüm) bir diseksiyon pedine yerleştirin ve kürkü% 70 etanol ile püskürtün.
  3. Ardından, diseksiyon sırasında fareyi yerinde tutmak için dört küçük çaplı pim kullanarak üst ve alt uzuvları sabitleyin.
  4. Cerrahi makas kullanarak, alt karın bölgesinden boğaza kadar cildi kesin.
  5. İç organları ortaya çıkarmak için cildi soyun ve karın boşluğunu açığa çıkarırken cildi her iki tarafta tutmak için ek pimler kullanın.
  6. Kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesin.
  7. Bir çift standart anatomik forseps kullanarak, yemek borusu ve trakeayı kavrayın ve forsepsin hemen üstünden kesin.
  8. Ardından, kaudal yaklaşımla tüm iç organları soymaya başlayın. Bunu yapmak için, tüm iç organları tek parça halinde çıkarmak için diyaframı omur sütunu boyunca kesin.
  9. Fareyi çıkarın ve karın boşluğundaki fazla fare kanını bir lavaboda durulayın.
  10. Fareyi yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin (arka görünüm). Diseksiyon sırasında fareyi yerinde tutmak için dört pim kullanarak üst ve alt uzuvları sabitleyin.
  11. Cerrahi makas kullanarak, cildi baştan arka bacaklara kadar soyun.
  12. Sol siyatik siniri (alt ekstremite) açığa çıkarın.
    1. Sol alt ekstremitenin alt kısmındaki kasları kesin.
    2. Etrafındaki kası çıkararak siyatik siniri bulun ve açığa çıkarın.
    3. Siyatik siniri sural, tibial ve peroneal sinir dallanmasında dikkatlice kesin ve kan damarlarını koruyun.
    4. Siyatik siniri standart anatomik forseps ve ekstra ince Bonn makası kullanarak, vertebral kolona paralel hale gelene ve yaklaşık 2 cm'lik serbest bir sinir bırakana kadar izole etmeye devam edin.
    5. Cerrahi makası omuriliğe paralel olarak yerleştirin ve kalçayı kesin.
    6. Parmaklarınızı kullanarak sakrum ve uyluk kemiğini ayırarak kalçayı yerinden çıkarın.
      NOT: Bu işlem sırasında, bozulmayı önlemek için siyatik siniri forseps kullanarak nazikçe çekmek için sık sık durmak gerekir.
    7. Sonunda, arka bacak fare karkasından nazikçe koparın ve yaklaşık 4 cm uzunluğunda bir siyatik sinir bırakın.
      NOT: Bu işlem sırasında, L2 sinirini bulun ve L2'ye zarar vermemek için arka bacaktan çıkarın. Sağ taraf için adım 1.12'yi tekrarlayın.
  13. Brakiyal sinirleri (üst ekstremiteler) açığa çıkarın.
    1. Fare karkasını düz bir yüzey (diseksiyon pedi) yerine ellerde manipüle edin.
    2. Sol koltuk altındaki yağ ve kasları ayırarak sol brakiyal pleksusu bulun.
    3. Yerleştirildikten sonra, ana brakiyal pleksus dallanmalarını (radyal, aksiller, supraskapular) ve bunların ulna etrafındaki alt dallanmalarını ekstra ince Bonn makası ile kesin ve yaklaşık 1,5 cm'lik serbest sinirler bırakın. Sol üst ekstremitedeki pleksusu nazikçe soyun.
    4. Sol üst ekstremiteyi yerinden çıkarın; Sinirsiz olduğundan emin olun. Sağ taraf için adım 1.13'ü tekrarlayın.
  14. Beyni açığa çıkarın.
    1. Şimdi, fareyi yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin (ön görünüm)
    2. Ekstra ince Bonn makasının bir bıçağını ağzınıza sokun ve mandibulayı boğazdan kesin.
    3. Yanaklardan boğaza kadar daha fazla keserek mandibulayı çıkarın.
    4. Daha sonra bir kulaktan diğerine geçen kafatası kemiğini kesin.
      NOT: Çok derine inmemek ve beyne zarar vermemek için dikkatli olun.
    5. Kafatasını açmak için damak ve burun kemiklerini kesin ve çıkarın.
    6. Kafatasının tabanındaki C1 omurunu kesin, beyinciği ve omuriliğin başlangıcını serbest bırakın.
    7. Son olarak, kafatasını göze kadar enlemesine kesin ve beyni ortaya çıkarmak için kafatasının parçalarını çıkarın.
      NOT: Sinirler soyulana kadar beyni boşluğunda tutun.
  15. Karkastan fazla yağ veya kasları çıkarın. Karkası oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca %10 formalin içine yerleştirin, ardından sabitleyici koku kalmayana kadar kısa 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) yıkayın ve bir sonraki adıma geçin.
    NOT: Sinir sistemi önümüzdeki 2 hafta içinde diseke edilirse, PBS'de 4 ° C'de saklayın. Aksi takdirde, süresiz olarak% 10 formalin içinde saklayın. Formalini manipüle ederken daima kimyasal bir başlık kullanın.

2. Omurilik maruziyeti

  1. Omuriliği ortaya çıkarmak için kranial-kaudal bir yaklaşım kullanın. Her bir omuru ve yukarıdaki kas tabakasını çıkarmak için, Vannas yaylı makas kullanarak ventral tarafta saat on ve saat iki pozisyonlarında kesin. Dumont mini forseps kullanarak omuru parçalayın. Bu işleme servikal ve torasik omurlar üzerinden devam edin.
  2. Bel bölümü için, omurun her iki tarafındaki enine işlemi kesin. Ardından, bir çift Vannas yaylı makasın bıçağını omur kanalına sokarak saat iki ve on konumlarında kesin. Bazen kemiklere yapışan sinirlere dikkat ederek dokuları çıkarın.
  3. Kaudal kısım için de benzer şekilde ilerleyin.

3. Torasik sinir maruziyeti

  1. Ön tarafı görselleştirmek için karkası diseksiyon mikroskobunun altına koyun.
  2. Vannas yaylı makas kullanarak, periferik sinirleri açığa çıkarmak için her bir kaburga boyunca (sternumdan alt ekstremitelere kadar) kesin.
  3. Daha sonra, ganglionu ortaya çıkarmak için ganglionun her iki tarafındaki omurları (yanal olarak) kesin.

4. Periferik sinir soyulması

  1. Omuriliği soymak ve periferik sinirleri daha fazla yerinden çıkarmak için, omuriliği nazikçe yuvarlamak ve omuriliğin kaudal kısmından başlayarak sinirleri birer birer çıkarmak için Dumont mini forsepslerini kullanın.
    NOT: Soyulmadan önce, RT'de 15 dakika boyunca% 10 formalin içinde ek bir fiksasyon yapılabilir, ardından adım 1.15'te yapıldığı gibi daha fazla fiksatif koku kalmayana kadar kısa 1x PBS yıkamaları yapılabilir.
  2. Torasik kısım için siniri 90°'lik bir açıyla (omuriliğe dik olarak) çekin.
  3. Brakiyal pleksus için, sinire yer açmak için sinirin yanındaki omuru kesin.
    NOT: Brakiyal pleksus, torasik bölgede olduğu gibi omurun altından geçirilemez.
  4. Sinirleri temizlemek için fazla kasları çıkarın.
  5. PBS'de 4 ° C'de toplam 2 haftaya kadar veya RT'de% 10 formalin içinde süresiz olarak saklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Kemirgenler, sinir sistemi biyolojisi ve patofizyolojisi10. Şaşırtıcı bir şekilde, gerçek zamanlı bir modeldeanatomiyi ve patolojik varyasyonu değerlendirmek için bir kemirgenin merkezi ve periferik sinir sisteminin tam diseksiyonunu sunan hiçbir yöntem yoktur 1,2,11. Şekil 1, adım 1'den adım 4'e kadar olan bir genel bakış su...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kasların ve sinirlerin kurumasını önlemek için, karkas her 10 dakikada bir PBS'ye batırılmalıdır. Alt ekstremiteleri yerinden çıkarırken (adım 1.12.6), siyatik sinir pleksusu ve L2'nin zarar görmesini/yırtılmasını önlemek için her zaman görünürde olması önemlidir. Beyni incelerken (adım 1.14.4), beyne zarar vermemek için çok derine inmekten kaçınmak çok önemlidir. Dorsal kök gangliyonlarını ve genel olarak periferik sinirleri diseke ederken, sinir yapı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmediler.

Teşekkürler

JPB, FRSQ J1 araştırma görevlisidir ve ABD Savunma Bakanlığı'ndan Erken Araştırmacı Araştırma Ödülü'nün sahibidir. LQL, Burroughs Wellcome Fund'dan Tıp Bilim Adamları için Kariyer Ödülü'ne ve Thomas L. Shields, MD Dermatoloji Profesörlüğüne sahiptir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Dumont mini-forcepsFine Science Tools#11200-10
Extra Bonn scissorsFine Science Tools#14084-08
Formalin 10%Fischer Scientific#22-046-361
PBS 1xBioShopCanada#PBS404.500
Standard anatomical forcepsFine Science Tools#91100-12
Surgical scissorsFine Science Tools#140001-12
Vannas spring scissorsKent Scientific#INS600124

Referanslar

  1. Bala, U., Tan, K. L., Ling, K. H., Cheah, P. S. Harvesting the maximum length of sciatic nerve from adult mice: a step-by-step approach. BMC Reserach Notes. 7, 714(2014).
  2. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Reserach Notes. 9, 82(2016).
  3. Ikram, A., Rehman, A. Paraganglioma. StatPearls. , Treasure Island, FL. (2022).
  4. Ehara, Y., Koga, M., Imafuku, S., Yamamoto, O., Yoshida, Y. Distribution of diffuse plexiform neurofibroma on the body surface in patients with neurofibromatosis 1. The Journal of Dermatology. 47 (2), 190-192 (2020).
  5. Plotkin, S. R., et al. Updated diagnostic criteria and nomenclature for neurofibromatosis type 2 and schwannomatosis: An international consensus recommendation. Genetics in Medicine. 24 (9), 1967-1977 (2022).
  6. Brosseau, J. P., et al. NF1 heterozygosity fosters de novo tumorigenesis but impairs malignant transformation. Nature Communications. 9 (1), 5014(2018).
  7. Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the hippo pathway. Cancer Discovery. 9 (1), 114-129 (2019).
  8. Liao, C. P., et al. Contributions of inflammation and tumor microenvironment to neurofibroma tumorigenesis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2848-2861 (2018).
  9. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807(2021).
  10. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , Elsevier, Academic Press. New York. (2012).
  11. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  12. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  13. Brosseau, J. P., et al. The biology of cutaneous neurofibromas: Consensus recommendations for setting research priorities. Neurology. 91, 14-20 (2018).
  14. Wu, J., et al. Preclincial testing of sorafenib and RAD001 in the Nf(flox/flox);DhhCre mouse model of plexiform neurofibroma using magnetic resonance imaging. Pediatric Blood & Cancer. 58 (2), 173-180 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Merkezi Sinir SistemiPeriferik Sinir SistemiKemirgen DiseksiyonuN robilim ProtokolMurin AnatomisiOmurilik DiseksiyonuDorsal K k GanglionuN rofibromatozis Tip IHistoloji Haz rlamaMikrodiseksiyon Tekni iAnatomik al maPatofizyoloji Ara t rmalar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır