LC3 İmmünofloresan Kullanılarak İki Farklı Pankreas Hücre Modelinde Otofaji Düzeylerinin Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokolün amacı, LC3 immünofloresan ve LC3 nokta ölçümü yoluyla pankreas kanseri ve pankreas asinar hücrelerinde otofajik düzeyleri belirlemektir.

Özet

Otofaji, proteinler ve hasarlı organeller de dahil olmak üzere sitoplazmik bileşenleri seçici olarak bozan özel bir katabolik süreçtir. Otofaji, hücrelerin stres uyaranlarına fizyolojik olarak yanıt vermelerini ve böylece hücresel homeostazı korumalarını sağlar. Kanser hücreleri, hipoksi, besin eksikliği veya kemoterapinin neden olduğu hasar gibi olumsuz koşullara uyum sağlamak için otofaji seviyelerini modüle edebilir. Duktal pankreatik adenokarsinom en ölümcül kanser türlerinden biridir. Pankreas kanseri hücreleri, otofaji proteinlerinin transkripsiyonel upregülasyonu ve post-translasyonel aktivasyonu nedeniyle yüksek otofaji aktivitesine sahiptir.

Burada, PANC-1 hücre hattı pankreas insan kanseri hücrelerinin bir modeli olarak kullanıldı ve AR42J pankreas asinar hücre hattı, oldukça farklılaşmış memeli hücrelerinin fizyolojik bir modeli olarak kullanıldı. Bu çalışmada, otofaji aktivasyonunun durumunun bir göstergesi olarak mikrotübül ile ilişkili protein hafif zincir 3'ün (LC3) immünofloresansı kullanılmıştır. LC3, bazal koşullarda, sitoplazmada yaygın bir dağılım paterni gösteren bir otofaji proteinidir (bu durumda LC3-I olarak bilinir). Otofaji indüksiyonu, LC3'ün yeni oluşan otofagozomların yüzeyindeki fosfatidiletanolamine konjugasyonunu tetikler ve otofagozomların oluşumuna ve genişlemesine yardımcı olan zara bağlı bir protein olan LC3-II'yi oluşturur. Etiketli otofajik yapıların sayısını ölçmek için, açık kaynaklı yazılım FIJI, "3D Nesneler Sayacı" aracının yardımıyla kullanıldı.

Hem fizyolojik koşullarda hem de kanser hücrelerinde otofajik seviyelerin ölçülmesi, hipoksi, kemoterapi tedavisi veya belirli proteinlerin yıkılması gibi çeşitli koşullar altında otofajinin modülasyonunu incelememizi sağlar.

Giriş

Makrootofaji (genellikle otofaji olarak adlandırılır), proteinler ve hasarlı organeller ^1,2 dahil olmak üzere sitoplazmik bileşenleri seçici olarak parçalayan özel bir katabolik süreçtir. Otofaji, hücrelerin stres uyaranlarına fizyolojik olarak yanıt vermelerini ve böylece hücresel homeostazı korumalarını sağlar³. Otofaji sırasında, çift zarlı bir vezikül oluşur: otofagozom. Otofagozom kargo moleküllerini içerir ve onları bozunma için lizozoma götürür ^1,4.

Otofagozomlar, otofajik protein mikrotübül il....

Protokol

1. Hücre hazırlığı

1. 12 mm'lik yuvarlak kapakları mutlak etanol içine batırın ve dikey olarak 24 delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin.
2. Kapağı çıkarın ve çok kuyucuklu plakayı 15 dakika boyunca ultraviyole radyasyona maruz bırakın.
3. Kapakları yatay olarak konumlandırın ve Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile yıkayın.
4. Pankreas hücrelerinin düşük geçiş sayısını tohumlayın. Miktar, fiksasyon gününde% 50 -% 75 akıcılık elde etmek için ayarlanmalıdır¹⁶.
   NOT: 3 gün sonra hücreleri sabitlemek için kuyucuk başına 2,5 × 10 4 PANC-1 veya⁴ × 10⁴ AR42J hücresi....

Sonuçlar

Bu protokol, farklı koşullarda otofaji seviyelerini belirlemek için pankreas hücre hatlarında LC3'ün immünofloresansını gerçekleştirir. Bu deneyin sonucu, LC3 ve DAPI'ye karşılık gelen kırmızı ve mavi kanallardan hücresel görüntülerin gizlenmesiydi. LC3 görüntüleri bu proteinin hücresel dağılımını gösterirken, DAPI nükleer lokalizasyonu gösterir. Şekil 2A , LC3'ün immünofloresansının temsili bir görüntüsünü ve bazal veya gemsitabin tedavi koşullar?.......

Tartışmalar

Bu protokolde açıklanan yöntem, hücredeki endojen LC3 dağılımının görselleştirilmesine ve farklı koşullar altında otofajik seviyelerin ölçülmesine izin verir. LC3 dağılımını analiz etmek ve otofaji aktivasyonunu belirlemek için kullanılan bir başka benzer yöntem, floresan etiketli LC3 transfeksiyonunu (RFP-LC3 gibi) ^içerir19. RFP-LC3 transfeksiyonu, fiksasyona ihtiyaç duymama (bu yöntemin canlı hücre görüntüleme^20'de uygulanmasına izin ver.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning	46-013-CM
12 mm round coverslips	HDA	CBR_OBJ_6467
24 Well- Cell Culture Plate	Sorfa	220300
Absolute ethanol	Biopack	2207.10.00
Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	R37119
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 800
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	62248
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902
DMEN	Sartorius	01-052-1A
Fetal Bovine Serum	NATOCOR	Lintc-634
Gemcitabina	Eli Lilly	VL7502
LC3B (D11) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	3868S
Methanol	Anedra	6197
Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film)	Bemis/Curwood	PM-996
Pen-Strep Solution	Sartorius	03-031-1B
PP242	Santa Cruz Biotechnology	SC-301606
Trypsin EDTA	Gibco	11570626