JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, [68Ga] D-dodekapeptid antagonistinin pozitron emisyon tomografik görüntülemesine dayanarak, programlanmış ölüm ligandı 1'in tüm vücuttaki dağılımını değerlendirmek için invaziv olmayan ve gerçek zamanlı bir yöntem geliştirmiştir. Bu tekniğin konvansiyonel immünohistokimyaya göre avantajları vardır ve immün kontrol noktası blokaj tedavisinden fayda görecek uygun hastaları belirleme etkinliğini artırır.

Özet

Programlanmış hücre ölüm proteini 1 (PD-1)/programlanmış ölüm ligandı 1'e (PD-L1) dayalı immün kontrol noktası blokaj tedavisinin geliştirilmesi, son yıllarda kanser tedavilerinde devrim yaratmıştır. Bununla birlikte, tümör hücrelerinde PD-L1'in heterojen ekspresyonu nedeniyle hastaların sadece bir kısmı PD-1 / PD-L1 inhibitörlerine yanıt verir. Bu heterojenlik, yaygın olarak kullanılan immünohistokimya (IHC) yaklaşımı ile tümör hücrelerinin kesin olarak saptanmasında bir zorluk teşkil etmektedir. Bu durum, tedavi etkinliğini artırmak için immün kontrol noktası blokaj tedavisinden fayda görecek hastaları sınıflandırmak için daha iyi yöntemler gerektirmektedir. Pozitron emisyon tomografisi (PET), tüm vücut PD-L1 ekspresyonunun noninvaziv bir şekilde gerçek zamanlı olarak görüntülenmesini sağlar. Bu nedenle, PET görüntüleme yoluyla tümörlerde PD-L1 dağılımını tespit etmek için radyoaktif işaretli izleyicilerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.

L-muadilleriyle karşılaştırıldığında, dekstrorotary (D)-peptitler, proteolitik direnç ve oldukça uzun metabolik yarılanma ömürleri gibi özelliklere sahiptir. Bu çalışma, tümör taşıyan farelerde bir D-dodekapeptid antagonisti (DPA) olan 68Ga etiketli PD-L1 hedefli D-peptidin PET görüntülemesine dayalı PD-L1 ekspresyonunu tespit etmek için yeni bir yöntem tasarladı. Sonuçlar, [68Ga] DPA'nın in vivo olarak PD-L1 aşırı eksprese eden tümörlere spesifik olarak bağlanabildiğini ve mükemmel görüntüleme yeteneğinin yanı sıra uygun stabilite gösterdiğini gösterdi, bu da [68Ga] DPA-PET'in tümörlerde PD-L1 durumunun değerlendirilmesi için umut verici bir yaklaşım olduğunu düşündürdü.

Giriş

İmmün kontrol noktası proteinlerinin keşfi, tümör tedavisinde bir atılımdı ve immün kontrol noktası blokaj tedavisiningeliştirilmesinde büyük ilerlemelere yol açtı 1. Programlanmış hücre ölüm proteini 1 (PD-1) ve programlanmış ölüm ligandı 1 (PD-L1), Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından onaylanan çeşitli antikorlara sahip potansiyel ilaç hedefleridir. PD-1, CD4+, CD8+ T hücreleri ve düzenleyici T hücreleri gibi tümöre sızan bağışıklık hücreleri tarafından eksprese edilir. PD-L1, çeşitli tümör hücrelerinde aşırı eksprese edilen PD-1 ligandlarından biridir 2,3. PD-1 ve PD-L1 arasındaki etkileşim, PD-1'i inaktive eder, böylece antitümör bağışıklık tepkisinibaskılar 4. Bu bulgular, PD-L1'in inhibisyonunun bağışıklık hücrelerinin öldürme etkisini artırabileceğini ve tümör hücrelerini ortadan kaldırabileceğini düşündürmektedir5. Şu anda, kromojenik immünohistokimya (IHC), immün kontrol noktası tedavisineyanıt verme olasılığı en yüksek olan hastaları belirlemek için en yaygın kullanılan yaklaşımdır 6,7. Bununla birlikte, tümör hücrelerinde PD-L1'in heterojen ekspresyonu nedeniyle, biyopsilerden elde edilen IHC sonuçları, hastalarda PD-L1 ekspresyonu hakkında doğru bilgi verememektedir8. Önceki çalışmalar, hastaların sadece %20-40'ının immün kontrol noktası blokaj tedavisindenuzun vadeli faydalar sağladığını bildirmiştir 1,9,10. Bu nedenle, bu bağışıklık kontrol noktası proteinlerinin heterojen ekspresyonunun neden olduğu yanlış negatif sonuçları atlatmak için yeni bir yöntem geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır.

Pozitron emisyon tomografisi (PET) gibi moleküler görüntüleme teknolojisi, tüm vücudun invaziv olmayan bir şekilde gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar ve böylece geleneksel IHC yönteminden daha iyi performans gösterebilir 11,12,13. Radyoaktif işaretli antikorlar, peptitler ve küçük moleküller, kanser hastalarında PD-L1 ekspresyonunu izlemek için umut verici izleyicilerdir 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. FDA, üç PD-L1 terapötik monoklonal antikoru onayladı: avelumab, atezolizumab ve durvalumab26. Bu antikorlara dayanan immüno-PET izleyicileri iyi belgelenmiştir 27,28,29,30,31,32. Erken faz klinik çalışmalar, elverişsiz farmakokinetik nedeniyle klinik uygulama için sınırlı değer ortaya koymuştur30. Antikorlarla karşılaştırıldığında, peptitler sağlıklı organlardan daha hızlı kan ve organ temizliği sergiler ve kimyasal olarak kolayca değiştirilebilir33. PD-1 / PD-L1 için yüksek afiniteye sahip çoklu peptitler bildirilmiştir2; WL12, PD-L134'e spesifik bağlanma gösteren rapor edilmiş bir peptittir. Radyoaktif işaretli izleyicilerin, [64Cu] WL12, [68Ga] WL12 ve [18F] FPyWL12'nin, tümörlerde PD-L1 ekspresyonunun yüksek kaliteli görüntülerinin toplanmasına izin veren yüksek in vivo spesifik tümör hedefleme yeteneği gösterdiği bildirilmiştir 26,35,36,37. Ayrıca, radyoaktif işaretli WL12'nin ilk insan içi değerlendirmesi, [68Ga] WL12'nin (NOTA ile şelatlanmış) klinik tümör görüntüleme için güvenli ve verimli bir potansiyele sahip olduğunu göstermiştir38. Yüksek hidrofobikliği ve sağlıklı karaciğerde yüksek alımı nedeniyle, WL12'nin klinik kullanımı sınırlıdır. PD-L1'e spesifik olarak bağlanan TPP1 ve SETSKSF gibi diğer radyoaktif işaretleme peptitleri de tüm vücut PD-L1 ekspresyonunugörselleştirmek için potansiyel stabilite ve özgüllük göstermiştir 39,40. Bununla birlikte, modifiye edilmemiş peptitler proteazlar tarafından kolayca parçalanır ve böbrek tarafından hızla metabolize edilir. Dekstrorotary(D)-peptitler, solak (L)-peptitlerin 41,42,43 zayıf stabilitesi nedeniyle etkili aracılar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. D-peptitler, proteolitik bozunmaya karşı aşırı dirençlidir ve oldukça uzun metabolik yarılanma ömürlerine sahiptir. L-muadilleriyle karşılaştırıldığında, D-peptitler çoğunlukla spesifik bağlanma yetenekleri gösterir 44,45,46.

Bu çalışma, tümör taşıyan bir fare modelinde 68Ga etiketli PD-L1 hedefli D-peptid, D-dodekapeptid antagonistinin (DPA) PET görüntülemesine dayanan PD-L1 ekspresyonunu tespit etmek için yeni bir yöntem tasarladı47. [68Ga] DPA'nın stabilitesi ilk olarak fosfat tamponlu salin (PBS) ve fare serumunda incelendi, daha sonra PD-L1 aşırı eksprese eden tümörlerde [68Ga] DPA'nın bağlanma afinitesi test edildi. Daha sonra, [68Ga] DPA'nın tümörlerde PD-L1 ekspresyonunu izlemek için ideal bir PET izleyici olup olmadığını doğrulamak için glioblastoma ksenogreft modellerinde PET görüntüleme yapıldı. PET görüntüleme ve DPA'nın kombinasyonu, PD-L1'in heterojen ekspresyonu ile ilişkili zorlukların üstesinden gelmek için yeni bir yaklaşım sağlamakla kalmaz, aynı zamanda D-peptit bazlı radyoizleyicilerin geliştirilmesinin temelini oluşturur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan deney prosedürleri, Nanjing Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi veya Ulusal Kuantum Bilimi ve Teknolojisi Enstitüleri tarafından onaylandı. Fare deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin kurumsal yönergelerine sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirildi.

1. Peptit sentezi

  1. HafifN2 köpürme altında 30 dakika boyunca 1 mL N-metil-2-pirolidon (NMP) içinde 100 mg 4-metilbenzhidrilamin (MBHA) reçinesini (0.37 mmol / g yükleme kapasitesi) şişirin.
  2. 1 mL NMP'de Fmoc korumalı amino asitler (5.0 eşdeğer), HCTU (4.9 eşdeğer) ve DIPEA'dan (10.0 eşdeğer) oluşan taze bir stok tamponu hazırlayın ve reçineye (100 mg) ekleyin. Bağlanma reaksiyonunun 1.5-2 saat devam etmesine izin verin.
  3. NMP'de %50 (hacim/hacim) morfolinden oluşan koruma giderme tamponu hazırlayın. Amin grubundaki Fmoc grubunu çıkarmak için reçineyi (100 mg) 2 x 30 dakika her yıkamada 1 mL koruma giderici tampon ile yıkayın. Reçineyi diklorometan (DCM; 1 mL) ile 1 dakika yıkayın, DCM'yi çıkarın ve reçineyi NMP (1 mL) ile 1 dakika daha tekrar yıkayın. Ardından, NMP'yi çıkarın ve reçineyi 1 dakika boyunca DCM ile tekrar yıkayın.
    NOT: Tüm yıkama prosedürleri hafifN2 köpürme altında gerçekleştirilir. Yukarıdaki prosedürler son amino aside kadar tekrarlanır.
  4. Peptitin üzerine 1,4,7,10-tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetik asit (DOTA) eklemek için, DOTA'yı N- (3-dimetilaminopropil) -N-etilkarbodiimid hidroklorür (EDC · HCl) ve N-hidroksisüksinimid (NHS). DOTA/EDC'nin stok tamponunu inkübe edin· 3 saat boyunca dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1:1:1 molar oranda HCl/NHS, son DOTA konsantrasyonu 1 M'dir. Daha sonra, stok tamponunu (1 mL) reçineye (100 mg) ekleyin ve reaksiyonun hafifN2 köpürme ile 2 saat devam etmesine izin verin.
    NOT: 1,4,7-triazasiklononan-1,4,7-triasetik asit (NOTA), 68Ga kompleksleşmesi için bir şelatör olarak da kullanılabilir. Aynı prosedürler NOTA bağlantısı için de kullanılabilir.
  5. DCM kullanarak reçineyi üstten iyice durulayın ve aynı anda kalan reaksiyon çözeltisini çıkarmak için bir vakum uygulayın. Reçineyi DCM (1,5 mL) kullanarak 3x durulayın ve ardından reçineyi küçültmek için MeOH (1,5 mL) ile durulayın. Reçineyi gece boyunca nitrojen altında veya reçine kuruyana kadar en az 4 saat yüksek vakum altında koyun.
  6. Kurutulmuş DPA peptit içeren reçineyi vidalı kapaklı 2 mL'lik bir polipropilen kaba koyun. Uygun bölünme kokteylini (95/2.5/2.5 TFA/TIS/H2O hacim; 1 mL/100 mg reçine) ekleyin ve kabı bir vidalı kapak kullanarak sıkıca kapatın. Reaksiyonu, çeker ocaktaki bir orbital çalkalayıcıda 20-25 °C'de 2 saat boyunca hafifçe çalkalayın.
    DİKKAT: Trifloroasetik asidi (TFA) son derece aşındırıcı yapısı nedeniyle koruyucu giysi giyerek çeker ocakta hazırlayın.
  7. Çeker ocaktaki nitrojen altında buharlaştırarak TFA'nın çoğunu çıkarın. Dietil eter (~ 1.5 mL / 100 mg reçine) ekleyerek peptitleri çökeltin.
  8. Peptitleri ezmek için karışımı vorteksleyin ve oda sıcaklığında (10.000 × g, 5 dakika) santrifüjleyin. Çözücüyü dikkatlice kabın dışına dökün. 1.7-1.8 arasındaki adımları tekrarlayın.
  9. Kalıntıyı açık kapta 10 dakika havayla kurutun. Ürünleri çözmek için %50 (hacim/hacim) sulu asetonitril ekleyin ve 1-2 saniye vorteksleyin (1 mL/100 mg reçine).
  10. Karışımı filtreleyerek reçineyi çıkarın ve ardından reçineyi 0,2 mL %50 (hacim/hacim) sulu asetonitril kullanarak 2x yıkayın. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) saflaştırması için filtratları karıştırın. Aşağıdaki HPLC koşullarını kullanın. Sütun: YMC-Triat-C18 (4,6 mm iç çap [id], 150 mm, 5 mm); çözücü gradyanı: çözücü A-deiyonize su; çözücü B-asetonitril (% 0.1 TFA); akış süresi: 20 dakika, asetonitril ile% 10 ila% 90; akış hızı: 1 mL/dak.
  11. Toplanan HPLC eluentlerini gece boyunca -80 °C'de dondurun ve liyofilize edin (-50 °C ve <1 pa). Radyo-etiketleme için, katı peptidi sodyum asetat tamponu (100 mM, pH 5.0) içinde stok tamponu olarak 1 mg/mL'lik bir nihai konsantrasyonda çözün.

2. 68Ga radyo etiketleme

NOT 68Ga, Nanjing First Hospital'da (Nanjing, Çin) 68Ge/68Ga jeneratör kullanılarak şirket içinde üretilmiştir.

  1. 5 μL stok tamponunu vidalı kapaklı 1,5 mL'lik bir polipropilen kaba pipetleyin. Kaba 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL) ekleyin.
  2. Karışımı 5 saniye boyunca vorteksleyin. pH test şeritlerini kullanarak pH'ı ölçün. NaOH (0,1 M) ile pH'ı 4-4,5'e ayarlayın.
    NOT: 68Ga ve DOTA arasındaki kompleksleşme için uygun bir pH kritik öneme sahiptir.
  3. Çözeltiyi oda sıcaklığında 5-10 dakika inkübe edin. Aşağıdaki koşullar altında radyo-işaretleme verim analizi için reaksiyon karışımını radyo-HPLC'ye tabi tutun: sütun: YMC-Triat-C18 (4.6 mm iç çap, 150 mm, 5 mm); çözücü gradyanı: çözücü A-deiyonize su; çözücü B-asetonitril (% 0.1 TFA); akış süresi: 20 dakika, asetonitril ile% 10 ila% 90; akış hızı: 1 mL/dak.
    NOT: Radyo ince tabaka kromatografisi (TLC), radyoetiketleme verimini incelemek için alternatif bir yaklaşım olarak kullanılabilir. Önerilen TLC elüsyon tamponu 0.1 MNa3C6H5O7, pH 4'tür.

3. İzleyici stabilite testi

  1. PBS'de izleyici stabilite testi
    1. PBS'ye (990 μL) [68Ga] DPA (10 μL, 3.7 MBq, NaOAc cinsinden) ekleyin. Hafif çalkalama ile 37 °C'de 1, 2 ve 4 saat inkübe edin.
    2. Her zaman noktasında 200 μL çözelti toplayın. Analiz için radyo-HPLC'ye enjekte edin.
  2. Fare serumunda izleyici stabilitesi
    1. Fare serumuna (90 μL, taze hazırlanmış) [68Ga] DPA (10 μL, ~ 3.7 MBq, NaOAc'de) ekleyin. Hafif çalkalama ile 37 °C'de 1, 2 ve 4 saat inkübe edin.
    2. Her zaman noktasında 20 μL çözelti toplayın. MeCN ve su (100 μL, 1:1, v/v) ekleyin.
    3. Karışımı 10 dakika (5.000 × g, 25 °C) santrifüjleyin. Süpernatanı radyo-HPLC kullanarak analiz edin.

4. PD-L1 ekspresyonunun akış sitometrisi ile analizi

  1. RPMI-1640 ortamını %10 (hacim/hacim) fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin (hacim/hacim) ile destekleyerek kültür ortamını hazırlayın. U87MG hücrelerini kültür ortamında yeniden süspanse edin ve 105 hücre / kuyucuk yoğunluğunda 12 oyuklu plakalarda tohumlayın. Hücreleri bir inkübatöre (% 5 CO2, 37 ° C) yerleştirin ve rahatsız etmeden en az 24 saat kültürleyin.
  2. Hücreleri 0.5 mL PBS ile yıkayın ve 250 μL tripsin-EDTA (% 0.25) ekleyin. Hücreleri 2 dakika boyunca inkübatöre (% 5 CO2, 37 ° C) geri yerleştirin.
  3. Hücre ayrışmasını durdurmak için 1 mL kültür ortamı ekleyin. Hücrelere orta madde ekleyerek bulaşıklardan ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek 1,5 mL'lik tüplerde toplayın. Hücreleri 5 dakika (100 × g) santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri 5 dakika (100 × g) santrifüjleyin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
  5. Floresein izotiyosiyanat (FITC) ile konjuge PD-L1 antikorunu% 3 sığır serum albümini (BSA) ile 20 nmol / L'ye seyreltin.
  6. Hücreleri 5 dakika (100 × g) santrifüjleyin, ardından iki kez soğuk PBS ile yıkayın. Bir akış sitometresi ve analiz yazılımı kullanarak PD-L1 pozitif hücreleri analiz edin.

5. İmmünositokimya

  1. U87MG hücrelerini, oyuk başına 2.5 × 105 hücre yoğunluğunda cam tabanlı hücre kültürü kaplarına (35 mm) tohumlayın. % 60 birleşmeye ulaşıldığında, kültür ortamını aspire edin ve 1 mL PBS ekleyin. Hafifçe birkaç kez sallayın ve aspire edin. Yıkama adımını 3x gerçekleştirin.
  2. Bulaşıklara 500 μL% 4 paraformaldehit ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığına yerleştirin ve 30 dakika sabitleyin.
  3. Hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın. 1 mL %3 BSA (PBS cinsinden ağırlık/hacim) ekleyin ve sabit hücreleri oda sıcaklığında 2 saat bloke edin.
  4. % 3 BSA'yı çıkarın ve hücreleri gece boyunca 4 ° C'de birincil anti-PD-L1 antikoru (mAb, 1: 100,% 3 BSA ile seyreltilmiş) ile doğrudan inkübe edin.
    NOT: Hücreleri BSA ile bloke ettikten sonra PBS ile yıkamayın.
  5. Hücreleri %3 BSA tamponu ile 3x yıkayın. Hücreleri 1 saat boyunca FITC konjuge anti-insan IgG Fc sekonder antikoru (1:500, PBS'de seyreltilmiş) ile inkübe edin.
  6. Hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın. Hücrelere 0,5 mL DAPI (1 μg/mL) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Lekeli hücreleri PBS ile 3x yıkayın ve konfokal floresan mikroskobu kullanarak gözlemleyin.

6. Hücresel alım ve inhibisyon deneyi

  1. Hücresel alım deneyi
    1. U87MG hücrelerini% 80 birleşmeye ulaşılana kadar 12 oyuklu plakalarda kültürleyin. Ortamı çıkarın ve hücreleri 0.5 mL PBS ile yıkayın.
    2. [68Ga] DPA'yı taze ortamda 74 KBq / mL'lik bir konsantrasyona seyreltin. Her oyuğa 0.5 mL seyreltilmiş [68Ga] DPA tamponu ekleyin.
    3. Hücreleri farklı sürelerde (10, 30, 40 ve 120 dakika) 37 ° C'de [68Ga] DPA ile inkübe edin. Bir pipet kullanarak ortamı aspire edin. Hücreleri PBS (0.5 mL) ile üç kez yıkayın.
    4. Hücreleri parçalamak için NaOH çözeltisi (0.5 M, oyuk başına 300 μL) ekleyin. 30 saniye sonra, viskoz hücre lizatlarını 1.5 mL'lik tüplerde toplayın.
    5. Plakayı iki kez 0.4 mL PBS ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu yukarıdaki 1,5 mL'lik tüpte toplayın.
    6. Otomatik gama sayacının yerleşik bilgisayarını başlatın; Tüpleri yerleşik rafa koyun. Tüm numuneleri konveyöre yükledikten sonra BAŞLAT düğmesine basın. Sonuçlar dahili yazılımda hesaplanır. Okuma, her bir tüpün dakika başına bozunma ile ilişkili sayımlarını (CPM) kaydeder.
  2. Rekabetçi bağlayıcı test
    1. U87MG hücrelerini% 80 birleşmeye ulaşılana kadar 12 oyuklu plakalarda kültürleyin. Ortamı çıkarın ve hücreleri 0.5 mL PBS ile yıkayın.
    2. [68Ga] DPA'yı taze ortamda 74 KBq / mL konsantrasyona seyreltin. 10 mM konsantrasyon (400 μL) elde etmek için uygun miktarda BMS202 bileşiğini% 10 DMSO içinde çözün.
    3. 100 μM'lik bir konsantrasyon elde etmek için 4 μL 10 mM BMS202'yi 396 μL PBS içinde seyreltin. Çeşitli BMS202 konsantrasyonları (1 μM, 10 nM, 100 pM ve 1 pM) elde etmek için bu adımı tekrarlayın.
    4. Her oyuğa 0.5 mL seyreltilmiş [68Ga] DPA tamponu ekleyin (kuyucuk başına 0.37 MBq). Her kuyucuğa 5 μL BMS202 çözeltisi ekleyin (her konsantrasyon için üç kuyu). Hücreleri bir hücre inkübatöründe 37 ° C'de 120 dakika inkübe edin.
    5. Bir pipet kullanarak ortamı aspire edin. Hücreleri 3 x 0.5 mL PBS ile yıkayın.
    6. Hücreleri parçalamak için NaOH çözeltisini (0.5 M, oyuk başına 300 μL) ekleyin. 30 saniye sonra, viskoz hücre lizatlarını 1.5 mL'lik tüplere toplayın. Plakayı 2 x 0,4 mL PBS ile yıkayın.
    7. Yıkama solüsyonunu yukarıdaki 1,5 mL'lik tüpte toplayın. Tüpleri otomatik gama sayacının yerleşik rafına yerleştirin.
    8. Adım 6.1.6 ile aynı prosedürleri izleyin.

7. PET görüntüleme

NOT: 159 cm yatay görüş alanı ve 0.796 cm eksenel görüş alanı ile 10 mm aralıklı (merkezden merkeze) 12.7 enine eksenel kesit sağlayan bir mikro PET tarayıcı kullanarak küçük hayvan PET görüntülemesi gerçekleştirin. Liste modunda toplanan tüm veriler üç boyutlu sinogramlar halinde düzenlenir. Fourier daha sonra iki boyutlu sinogramlara yeniden birleştirilir (çerçeve × dk: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).

  1. Bu çalışmada erkek, 5-8 haftalık BALB / C çıplak fareler kullanın. 4.1-4.4 adımlarını izleyerek U87MG hücrelerini toplayın ve hücreleri 0.5 mL'lik bir şırıngaya aspire edin. Hücreleri deri altından farelere enjekte edin (tümör başına 1 × 106 hücre, fare başına iki tümör). Enjeksiyondan sonra tümör hacmi 100-300 mm olana kadar tümör büyümesini izleyin3.
  2. Fareleri %1-2 (h/h) izofluran (1 mL/dak) kullanarak uyuşturun. Isıtma cihazını açın ve PET'in hayvan yatağını 37 °C'de tutun.
  3. Anestezi uygulanmış fareleri PET makinesinin hayvan yatağında doğru pozisyona getirin. Kuruluğu önlemek için her iki göze de oftalmik merhem sürün.
    DİKKAT: Tarama sırasında ölümü önlemek için fareleri yüzüstü pozisyonda tutun. Tüm görüntüleme işlemi sırasında, önceden takılmış bir tüp kullanarak burun yoluyla izofluran akışını (1.0 mL / dak) uygulayın.
  4. Hayvan yatağı konumunu kontrol panelinden ayarlayın. İzleyicileri (10-17 MBq / 100-200 μL) önceden takılmış bir kuyruk ven kateterinden intravenöz olarak enjekte edin.
  5. Başvurulan yazılımı kullanarak bir ana bilgisayarda bir tarama iş akışı oluşturun (bkz. Malzeme Tablosu) Bir çalışma klasörü oluşturun ve edinme protokolünü üreticinin protokolüne göre ayarlayın. 3D liste modunda tüm farelerde dinamik taramalar (her fare için 60 dakika) gerçekleştirin.
  6. Üreticinin protokolünü takip eden bir histogram protokolü ve bir yeniden yapılandırma protokolü tanımlayın. Filtrelenmiş geri projeksiyon yoluyla PET dinamik görüntülerini (25-30 dakika ve 55-60 dakika) yeniden oluşturmak için 0,5 döngü/piksel Nyquist kesimli Hanning'in filtresini kullanın. Tüm fareler için maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP) görüntüleri oluşturun.
  7. Protokolleri bir iş akışında birleştirin ve iş akışını çalıştırın. Üreticinin protokolünü izleyerek yazılımı kullanarak ortaya çıkan üç boyutlu görüntüleri analiz edin.
    NOT: İlgilendiğiniz hacimleri seçmek için simülasyon yazılımını kullanın. Radyoaktivite, enjeksiyon zamanına göre çürümeye göre düzeltilir ve toplam enjeksiyon dozunun yüzdesi / gram doku başına (% ID / g) olarak sunulur.

8. Ex vivo biyodağıtım

  1. Kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla U87MG taşıyan BALB/C çıplak farelere [68Ga] DPA (1.85 MBq/100 μL) uygulayın. Fareleri% 1 -% 2 (v / h) izofluran (1 mL / dak) kullanarak uyuşturun, daha sonra enjeksiyondan sonra 5, 30, 60 ve 120 dakika boyunca servikal çıkık yoluyla üç fareyi feda edin.
    NOT: Bu prosedürü gösteren bireyler, bilinç kaybının hızla indüklenmesini sağlamak için servikal çıkıkla ilgili teknik beceriler konusunda eğitilmelidir. Bu, bu deneydeki ötenazi prosedürlerinin hepsinin insanca yapılmasını sağlayacaktır.
  2. Ölüm onaylandıktan sonra, farelerin göğüs duvarını açın. Sonra kalbi açın. Kan almak için 1 mL'lik bir şırınga kullanın; şırıngadaki kanı gama sayacı için bir radyoimmünoassay (RIA) tüpüne (13 mm çapında) sıkın.
  3. Ana organları ve tümörleri eksize edin ve gama sayacı için RIA tüplerine (13 mm çapında) yerleştirin. Başlıca organlar arasında toplam kan, kalp, timus, karaciğer, dalak, kemik, mide, böbrekler, kas, bağırsak lenf nodu, ince bağırsak, pankreas, testis, beyin ve akciğerler bulunur. Tüm organları tartın.
  4. Bir otogama sayacı kullanarak toplanan organlardaki radyoaktiviteyi ölçün ve değerleri bozunarak düzeltin. Bir gram ıslak doku başına enjekte edilen dozun yüzdesini hesaplayın (% ID/g).

9. İmmünohistokimya

  1. Glioma dokularını toplayın ve PBS ile 3 kez yıkayın. Taze dokuları %4 paraformaldehite koyun ve gece boyunca 4 °C'de sabitleyin.
  2. Sabit dokuları parafine gömün ve 10 μm kalınlığa kadar bölümlere ayırın. Bölümleri bir inkübatöre (60 °C) yerleştirin ve 2 saat inkübe edin. Bölümleri her biri 10 dakika inkübe ederek mumdan arındırın ve nemlendirin: ksilen (iki kez), mutlak alkol, %95 alkol, %90 alkol, %80 alkol, %75 alkol.
  3. Bölümleri 0,01 M sodyum sitrat içine koyun ve 92-95 °C'ye ısıtın. Antijen alımını sağlamak için sıcaklığı 40 dakika koruyun.
  4. Bölümlere 200 μLH2O2çözeltisi (% 3) ekleyin ve endoperoksidazları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inaktive edin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca% 3 BSA ile muamele ederek spesifik olmayan bölgeleri bloke edin.
  5. Bölümleri primer anti-PD-L1 antikorunda (mAb, 1:100,% 3 BSA ile seyreltilmiş) gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    NOT: BSA ile bloke ettikten sonra PBS ile yıkamayın.
  6. Bölümleri 3x PBS ile yıkayın. Bölümleri HRP etiketli keçi anti-tavşan ikincil antikoru (1:500, PBS ile seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  7. Hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın. Bölümlere 200 μL 3,3-diaminobenzidin (DAB) çalışma solüsyonu (çözelti A: çözelti B: çözelti C = 1:1:18) ekleyin ve karanlıkta 5 dakika inkübe edin.
  8. Bölümleri 3x PBS ile yıkayın. 500 μL hematoksilen çözeltisi (% 100) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Bölümleri 30 saniye suyla yıkayın. Bölümleri 30 saniye boyunca farklılaşma çözeltisine (%75 alkol: HCL = 99:1) koyun. Bölümleri 1 dakika su kullanarak yıkayın.
  9. %75 alkol, %80 alkol, %90 alkol, %95 alkol, mutlak alkol ve ksilen (her biri 10 dakika) ile sırayla inkübe ederek numuneleri kurutun. Tüm bölümleri nötr reçine kullanarak monte edin ve optik mikroskop altında gözlemleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

[68Ga]DPA radyoetiketleme ve kararlılık
Model peptit, DPA, etkili bir PD-L1 antagonistidir. DOTA-DPA, %>95 saflık ve %68 verim ile elde edilmiştir. DOTA-DPA'nın kütlesi deneysel olarak 1,073.3'te ([M+2H]2+) gözlemlenmiştir. 68Galyum, PET görüntüleme için peptitleri etiketlemek için uygun bir radyonüklid olarak kabul edilir ve bu nedenle bu çalışma için seçilmiştir. DPA'yı 68Ga (yarı ömür: 68 dakika) i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yöntemde açıklanan kritik adımlar, 68Ga'nın DPA'ya etkili bir şekilde etiketlenmesini ve tümördeki DPA'nın farmakodinamik paternine mükemmel şekilde uyması gereken PET görüntüleme için uygun bir zaman penceresinin seçilmesini içerir.

IHC'nin aksine, PET görüntüleme, tüm vücut PD-L1 ekspresyonunun noninvaziv bir şekilde gerçek zamanlı olarak saptanmasını sağlayarak heterojen bir tümördeki her pozitif alanın görselleştirilmesine olanak tanır

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Çatışan çıkarlar beyan edilmez.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Tıp Bilimleri Akademisi'nin kar amacı gütmeyen Merkezi Araştırma Enstitüsü Fonu (no. 2022-RC350-04) ve CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (no. 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 ve 2022-I2M-2-002) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA)Merck60239-18-168Ga  chelation
3,3-diaminobenzidine (DAB) KitSigma-AldrichD7304-1SETImmunohistochemistry
anti-PD-L1 monoclonal antibodyWuhan Proteintech17952-1-apImmunohistochemistry: primary antibody
BMS202Selleck1675203-84-5Competitive binding assay: inhibitor
BSAMerckV900933Immunofluorescent : blocking 
DAPIMerckD9542Immunofluorescent: staining of nucleus
Dichloromethane (DCM)Merck34856Solvent
DIPEAMerck3439Peptide coupling
EDC·HClMerckE6383Activation of DOTA
FBSGibco10099Cell culture: supplement
FITC-conjugated anti-human IgG Fc AntibodyBiolegend409310Immunofluorescent: secondary antibody
FITC-conjugated anti PD-L1 antibodyBiolegend393606Flow cytometry: direct antibody
HCTUEnergy ChemicalE070004-25gPeptide coupling
HRP labeled goat anti-rabbit antibodyServicebioGB23303Immunohistochemistry: secondary antibody
Hydroxysuccinimide (NHS)Merck130672Activation of DOTA
MeCNMerckPHR1551Solvent
MorpholineMerck8.06127Fmoc- deprotection
NMPMerck8.06072Solevent
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Fixation of tissues
PBSGibco10010023Cell culture: buffer
Penicillin-streptomycin Gibco10378016Cell culture: supplement
RIA tubePolyLabP10301AAs tissue sample container
RPMI-1640 mediumGibco11875093Cell culture: basic medium
Sodium acetateMerck1.06264Salt for buffer
Trypsin-EDTAGibco25200056Cell culture: dissociation agent
U87MG cell lineProcell Life Science & Technology CoCL-0238Cell model
Equipment
68Ge/68Ga generatorIsotope Technologies Munich, ITMNot applicableGeneration of [68Ga]
Autogamma counterPerkin Elmer Wizard2Detection of radioactivity
Confocal fluorescent microscopyKeyenceObservation of immunofluorescent results
Flow cytometerBecton Dickinson, BDLSRIIMonitoring the PD-L1 positive cells
High-performance liquid chromatography (HPLC)SHIMAZULC-20AT Purification of DPA peptide
PET scannerSiemens Medical SolutionsInveon MultiModality SystemPET imaging
Optical microscopyNikon Eclipse E100Observation of immunohistochemistry results
Solid phase peptide synthesizerPromega Vac-Man Laboratory Vacuum ManifoldLOT#11101Synthesis of DPA-DOTA peptide
Software
ASIProSiemens Medical SolutionsNot applicableAnalysis of PET-CT results
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1Analysis of the flow cytometer results
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical SolutionsNot applicableManagement of PET mechine
PrismGraphpadPrism 8.0Analysis of the data 

Referanslar

  1. Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
  2. Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747(2022).
  3. Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
  4. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  5. Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297(2022).
  6. Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
  7. Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
  8. Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
  9. Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
  10. Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535(2019).
  11. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (7), 591-607 (2008).
  12. Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
  13. Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538(2022).
  14. Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
  15. Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664(2018).
  16. Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
  17. Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
  18. Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
  19. Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
  20. Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
  21. Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
  22. Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
  23. Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
  24. Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294(2021).
  25. Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572(2020).
  26. Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
  27. Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
  28. Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
  29. Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
  30. Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738(2020).
  31. Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
  32. Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
  33. Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
  34. (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
  35. Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
  36. De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
  37. Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189(2019).
  38. Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
  39. Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
  40. Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
  41. Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
  42. Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
  43. Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
  44. Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
  45. Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
  46. Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
  47. Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
  48. Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
  49. Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
  50. Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
  51. Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
  52. Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
  53. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  54. Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
  55. Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
  56. Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 192Programlanm l m Ligand 1 Ekspresyonumm n Kontrol Noktas Blokaj TedavisiPD 1PD L1 nhibit rleriT m r H crelerimm nohistokimya IHCPozitron Emisyon Tomografisi PETRadyoaktif aretli zleyicilerDekstrorotary D peptitlerProteolitik DirenMetabolik Yar lanma m rleri68Ga etiketli PD L1 hedefli D peptidD dodekapeptid Antagonisti DPAT m r Ta yan FarelerStabiliteG r nt leme Yetene i

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır