İnsan Tedavisi için Yenilikçi Bir Ksenojenik İçermeyen Yöntemle İnsan Adipoz Türevi Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Hücre tedavisi hazırlığı/manipülasyon aşamalarında kullanılmaya başlanan ksenojenik (kimyasal veya hayvansal türevli) ürünler, konakçı hastalarda immün reaktivite ve patojenik bulaşma riskinin artmasıyla ilişkilidir. Burada, insan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için tam bir ksenojenik içermeyen yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Kök hücre tedavisinin artan etkisi göz önüne alındığında, in vitro manipülasyon sırasında hayvansal kaynaklı ürünlerin piyasaya sürülmesi nedeniyle potansiyel kontaminasyon veya enfeksiyon bulaşması ile ilgili biyogüvenlik endişeleri dile getirilmiştir. Hücre izolasyonu ve genişleme adımları sırasında yaygın olarak kullanılan kollajenaz veya fetal sığır serumu gibi ksenojenik bileşenler, alıcı hastalarda immün reaktivite veya viral, bakteriyel ve prion enfeksiyonunun potansiyel riskleri ile ilişkili olabilir. İyi üretim uygulamaları kılavuzlarını takiben, kimyasal doku ayrışmasından kaçınılmalı, fetal sığır serumu (FBS) ksenojenik içermeyen takviyelerle ikame edilebilir. Ayrıca, hücre ürünlerinin güvenliğini sağlamak için, daha güvenilir ve tekrarlanabilir yöntemlerin tanımlanması önemlidir. Kollajenaz FBS kültürlü standart protokollere kıyasla özelliklerini değiştirmeden insan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için yenilikçi, tamamen ksenojenik içermeyen bir yöntem geliştirdik. Burada, insan adipoz kaynaklı kök hücreler (hASC'ler) abdominal yağ dokusundan izole edildi. Numune makas / neşter ile mekanik olarak kıyılmış, mikro disseke edilmiş ve mekanik olarak 10 cm'lik bir Petri kabında dağılmış ve doku parçalarının bağlanmasını ve hASC'lerin göçünü kolaylaştırmak için neşter kesileri ile hazırlanmıştır. Yıkama adımlarını takiben, hASC'ler enzimatik sindirim olmadan plastik yapışmaları nedeniyle seçildi. İzole edilmiş hASC'ler,% 5 heparin içermeyen insan trombosit lizatı ile desteklenmiş orta dereceli olarak kültürlendi ve hayvansız tripsin ikamesi ile ayrıldı. İnsan tedavisine yönelik hücre ürünlerinin üretimine ilişkin iyi üretim uygulamaları (GMP) talimatlarını takiben, hiçbir kültür ortamında antibiyotik kullanılmamıştır.

Giriş

Son yıllarda, yenilikçi terapötik tedavilere olan talebin artması, translasyonel tıp alanında önemli çabalara ve kaynak yatırımlarına yol açmıştır¹. Hücre bazlı ürünler, hücre kaynağı, üretim süreci (izolasyon, genişleme veya genetik modifikasyon) ve hücresel olmayan takviyeler (enzimler, büyüme faktörleri, kültür takviyeleri ve antibiyotikler) tarafından belirlenen risklerle ilişkilidir ve bu risk faktörleri spesifik terapötik endikasyona bağlıdır. Nihai ürünün kalitesi, güvenliği ve etkinliği, yukarıda belirtilen unsurlardan derinden etkilenebilir². Kök hücre tedavisi biyogüvenlik ilkelerine bağlı kalmayı gerektirir; Hücre kültüründe hayvansal kaynaklı ürünlerle patojenik bulaşmanın potansiyel riskleri sorunlu olabilir ve üretime dahil edilen herhangi bir ürünün kapsamlı bir şekilde test edilmesi esastır³.

İnsan adipoz türevi kök hücreleri (hASK'ler) izole etmek için kullanılan geleneksel yöntem, kollajenaz ile gerçekleştirilen enzimatik bir sindirimi ve ardından santrifüjleme yoluyla yıkama adımlarını içerir⁴. Enzimatik izolasyon genellikle hücre verimi ve canlılığı açısından diğer mekanik tekniklerden daha verimli olarak kabul edilirken, kollajenaz gibi kullanılan hayvan kaynaklı bileşenlerin ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından minimum düzeyde manipüle edilmesinden daha fazlası olduğu düşünülmektedir. Bu, immün reaksiyonlar veya hastalık bulaşma riskinin önemli ölçüde arttığı anlamına gelir, böylece hASC tedavisinin klinik ortamlara çevrilmesi sınırlandırılır ^5,6.

Tripsin bazlı sindirim, ASC'leri izole etmek için başka bir enzimatik protokoldür. Tripsin konsantrasyonu, santrifüjleme hızı ve inkübasyon süresi açısından küçük değişikliklerle farklı teknikler tanımlanmıştır. Ne yazık ki, bu yöntem iyi tanımlanmamıştır ve literatürde, özellikle mekanik izolasyon protokolleri⁷ ile karşılaştırma eksikliği vardır. Bununla birlikte, yaklaşımın çevrilebilirliği açısından, tripsin aynı kollajenaz dezavantajlarına sahiptir.

ASC'leri elde etmek için mekanik kuvvetlere dayanan ve enzim ilavesi olmayan alternatif izolasyon yöntemleri, yağ dokusu parçalarının yüksek hızlı santrifüjlenmesini (800 x g veya 1.280 x g, 15 dakika) içerir. Daha sonra, pelet bir kırmızı kan hücresi lizis tamponu (5 dakika) ile inkübe edilir, ardından kültür ortamında yeniden süspansiyondan önce 600 x g'de başka bir santrifüjleme adımı izlenir. İlk günlerde eksplant yöntemlerine kıyasla daha fazla sayıda hücre izole edilmesine rağmen, önceki bir çalışma, kültür^8'in ikinci haftasından sonra daha düşük veya hiç proliferasyon göstermediğini göstermiştir.

Bunun yanı sıra, hücre kültürü için bir büyüme faktörü takviyesi olarak kullanılan fetal sığır serumu (FBS) gibi ksenojenik eklenmiş ortamlarla daha fazla manipülasyon, immün reaktivite riskinin artması ve konakçı hastanın viral, bakteriyel veya prion enfeksiyonlarına maruz kalma riski ile ilişkilidir ^9,10. İmmün reaksiyonlar ve ürtiker form döküntü gelişimi, FBS¹¹ ile üretilen birkaç doz mezenkimal kök hücre alan bireylerde zaten tanımlanmıştır. Ayrıca, FBS, nihai ürün kalitesi¹² üzerinde bir etkisi olabilecek partiden partiye değişkenliğe tabidir.

İyi üretim uygulamaları (GMP) kılavuzlarına uygun olarak, enzimatik doku ayrışmasından kaçınılmalı ve FBS, ksenojenik içermeyen takviyelerle değiştirilmelidir. Bu adımlar, daha güvenilir ve tekrarlanabilir protokollerle birlikte, hücre tedavisinin uygulanmasını desteklemek için gereklidir ^3,13.

Bu bağlamda, insan trombosit lizatı (hPL), hücre içermeyen, protein içeren, büyüme faktörü bakımından zenginleştirilmiş bir takviye olduğu için FBS'nin yerine önerilmiş ve daha önce klinik sınıf hücre bazlı ürünler arasında in vitro hücre kültürü ve genleşme^14,15 için bir büyüme ortamı katkısı olarak tanıtılmıştır. hPL, insan kaynaklı bir ürün olduğundan, klinik uygulamalara yönelik hASC'lerin in vitro kültürü sırasında FBS'nin yerine sıklıkla kullanılır, böylece FBS çevrilebilirliği ile ilgili immünolojik reaksiyonlar ve enfeksiyonlarla ilgili sorunları azaltır^15,16.

Daha yüksek üretim maliyetlerine rağmen, FBS ile karşılaştırıldığında, hPL'nin birçok hücre tipi için hücre canlılığını desteklediği, proliferasyonu arttırdığı, yaşlanmayı geciktirdiği, genomik stabiliteyi sağladığı ve geç hücre pasajlarında bile hücresel immünofenotipi koruduğu gösterilmiştir; tüm bu unsurlar bu kültüre geçişi desteklemektedir ek¹¹.

Bu çalışmanın amacı, klasik FBS kültürlü hASC'lere kıyasla hücre fizyolojisini ve kök özelliklerini değiştirmeden, hASC'leri tam bir hayvansız yöntemle izole etmek ve kültürlemek için standartlaştırılmış bir protokol geliştirmekti (Şekil 1).

Protokol

hASK'ler, Lozan Üniversitesi Hastanesi, CHUV, Lozan, İsviçre'de abdominal otolog flepler (derin inferior epigastrik perforatör flepler, [DIEP]) kullanılarak meme rekonstrüksiyonu yapılan sağlıklı bir kadının abdominal yağ dokusundan izole edildi. Flebin atılan kısmı ve yağ dokusu hasta bilgilendirilmiş onam imzaladıktan sonra elde edildi. Tüm protokoller, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak hastanenin Biobank Departmanı DAL (sayı 314 GGC) ve etik komiteler tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

NOT: Tüm adımlar laminer bir davlumbaz altında ve aseptik koşullarda gerçekleştirilmelidir. Kişisel koruma için eldivenler ve laboratuvar önlükleri her zaman giyilmeli ve tüm yüzeyler uygun biyositlerle yıkanmalıdır. Fazla doku biyomedikal atık olarak uygun şekilde bertaraf edilmelidir.

1. İhtiyaç duyulan malzemeler ve kültür çözümlerinin hazırlanması

1. Hücre izolasyonu, genişleme ve kriyoprezervasyon için aşağıdaki aletleri edinin: steril makas; steril neşterler; steril cımbız; 10 cm'lik bir Petri kabı; 15 mL tüpler; T25 şişeleri; bir Burker odası; kriyovyaller; bir hücre dondurma kabı; 4x ve 10x büyütme hedeflerine sahip bir optik mikroskop; ve sallanan bir kova santrifüjü.
2. İmmünofenotipleme için, aşağıdaki aletleri ve reaktifleri elde edin: FACS tüpleri, steril fosfat tamponlu salin (PBS); Dulbecco'nun minimal esansiyel ortamı (DMEM); hPL; dimetil sülfür; ve hayvansız tripsin.
3. DMEM'i% 5 heparin içermeyen hPL ile destekleyerek tam kültür ortamını hazırlayın. Ortamı 4 ° C'de 3 haftaya kadar saklayın ve her zaman ılık kullanın (oda sıcaklığı ile 37 ° C arasında). İnsan tedavisine yönelik hücre ilaçlarının üretimi için GMP kılavuzlarını takiben, kültür ortamına herhangi bir antibiyotik eklemeyin.
4. DMEM'de% 20 hPL ve% 10 dimetil sülfür içeren dondurma ortamı hazırlayın.

2. HSC'lerin yağ dokusu örneğinden izolasyonu

1. Yağ dokusu örneğini elde ettikten sonraki 6 saat içinde işleyin. Kurulan mekanik ksenojenik içermeyen izolasyon yöntemine geçmeden önce, bağ dokusu ve kan serbest bırakılana kadar 10 dakika boyunca PBS ile 2x dokuyu yıkayın.
2. Abdominoplastik cerrahiden elde edilen yağ dokusu örneğini, hASC canlılığına zarar vermemek için PBS'de işlenene kadar 4 ° C'de ve her durumda 24 saatten fazla olmamak üzere saklayın.
3. Yağ dokusunu steril makasla yaklaşık 1^cm2'lik daha küçük parçalara bölün.
4. Bir neşterle, her bir parçayı <5 mm çapında küçük parçalara mikro disseke edin ve beşini 10 cm'lik bir Petri kabına dağıtın (Şekil 2A).
5. Her bir parçayı tutturmak için, plastik yüzeyde kesikler oluşturmak için neşteri kullanın ve her bir parçayı Petri kabına sıkıca yapışana kadar sürükleyin. Parçayı işlemeye yardımcı olması için cımbız kullanın (Şekil 2B).
6. Tüm parçaları ayırmadan örtmek için yavaşça 10 mL tam kültür ortamı ekleyin.
7. Petri kaplarını 37 ° C'de ve% 5 CO_{2'de inkübe edin}. hASK'ler dokudan dışarı göç edecek ve enzimatik sindirim olmadan plastik yapışmaları nedeniyle seçilecektir.
8. Hücre birleşene kadar, hASC genişlemesini optik mikroskop altında günde bir kez 4x büyütmede izleyin. HSC'ler dokudan çıkmaya başladıkça, tipik bir fibroblast benzeri morfolojiye sahip doku parçalarının etrafında küçük kümeler halinde görünürler. hASK'ler, plastik yüzeye yapışma yetenekleri nedeniyle seçilir. Her 72 saatte bir, mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarın ve hücre kalıntılarını gidermek için taze tam bir ortamla değiştirin.
9. Doku parçalarını, genellikle 7 gün sonra olan hücrelerin ilk geçişine kadar yerinde bırakın.

3. İzolasyon aşamasından sonra hASC kültürü

1. hASC kültürü% 70 -% 80 akıcılığa ulaştığında, hASC'ler diğer deneyler veya uzun süreli depolama için kullanılmak üzere ayrılmaya ve daha da genişletilmeye hazırdır.
2. Steril cımbızla, Petri kabındaki tüm doku parçalarını çıkarın ve atın. Tükenmiş ortamı çıkarın ve atın, çıkarmamak için hASCO'lara dokunmamaya dikkat edin.
3. Hücreleri bir kez 10 mL PBS ile dikkatlice yıkayın. 1 mL 1x hayvansız tripsin ekleyin ve Petri kabını inkübatörde 5 dakika boyunca 37 ° C'de bırakın.
4. Tüm hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını 4x büyütmede optik mikroskop altında kontrol edin; Aksi takdirde, Petri kabını inkübatörde 2 dakika daha bırakın ve sonunda hücre ayrılmasını desteklemek için plastik yüzeye hafifçe dokunun.
5. 2 mL tam ortam ekleyerek tripsin hareketini durdurun ve tüm hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
6. Kalan tripsisini çıkarmak için, tüpü 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. Süper nantantı atın, hücreleri 5 mL tam ortam ile askıya alın ve hücre süspansiyonunu yeni bir T25 şişesine aktarın. hASK'leri kültürde tutun ve ihtiyaç duyulana kadar genişletin.

4. Akım sitometrisi ile immünofenotipin incelenmesi

1. hASC kültürü %70-%80 akıcılığa ulaştığında, daha önce bölüm 3'te açıklandığı gibi hASC'leri ayırın.
2. Hücreleri topladıktan sonra, onları 1 mL'lik tam bir ortamda askıya alın ve 10x büyütmede optik mikroskop altında hücre sayacı ile bir aliquot sayın.
3. hASC'leri 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve 1 x 10⁶ hücre/mL FACS tamponunda askıya alın. 1 x 10⁵ hücre içeren süspansiyonun 100 μL'sini bir FACS tüpüne aktarın. İncelenen her antijen için bir FACS tüpü ve ayrıca her izotipik kontrol için bir tane daha kullanın.
4. FACS tamponunda seyreltilmiş aşağıdaki antikorların 100 μL'si ile hücreleri sabitleyin: anti-CD73 (1:1.000, IgG1, FITC etiketli), anti-CD105 (1:200, IgG1, PE etiketli); anti-CD34 (1:66, IgG1, FITC etiketli); anti-CD45 (1:66, IgG1, FITC etiketli); ve her florofor için izotipik kontroller, IgG1 FITC etiketli (1:1.000) ve IgG1 PE etiketli (1:50).
5. Numuneleri karanlıkta 1 saat boyunca 4 ° C'de ajitasyonla inkübe edin. Tüpleri 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin, süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL FACS tamponunda askıya alın.
6. Hücre immünofenotipini bir akış sitometri cihazı ile değerlendirin, hücre kalıntılarını dışlamak için seçilen kapının içindeki her tüp için 50.000 olay kaydedin. Eksprese eden hücrelerin yüzdesini, spesifik izotipik kontrolden fark olarak hesaplayın.

5. hASC'nin proliferasyon testi

1. hASC kültürü %70-%80 akıcılığa ulaştığında, bölüm 3'te açıklandığı gibi hASC'leri ayırın.
2. Hücreleri topladıktan sonra, onları 1 mL'lik tam bir ortamda askıya alın ve 10x büyütmede optik mikroskop altında hücre sayacı ile bir aliquot sayın.
3. 96 delikli şeffaf plakalarda²⁰⁰ μL komple ortamda tohum 5 x 10 2 hASC. Hücreleri teknik olarak tohumlayın, her zaman noktası için bir kuyu ile.
4. Tohumlamadan 3 gün sonra, üreticinin talimatlarını izleyerek bir proliferasyon testi kiti kullanarak hücre proliferasyonunu tespit etmeye başlayın. Kısacası, kültür ortamını, kuyucuk başına 20 μL tahlil reaktifine eklenen 100 μL taze ortam ile değiştirin. hASC'leri 37 ° C'de 2,5 saat, reaktif gelişimi için% 5 CO₂ için inkübe edin ve ardından bir spektrofotometre ile 490 nm'de absorbansı tespit edin.
5. Boş absorbansı çıkardıktan sonra hASC proliferasyonunu yüzde absorbans olarak ifade edin.

6. hASK'lerin kriyoprezervasyonu ve depolanması

1. Hücreleri bölüm 3'te açıklandığı gibi ayırın ve 10x büyütmede optik mikroskop altında hücre sayacı ile bir aliquot sayın.
2. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücreleri dondurucu karışımla 1 x 10⁶ hASC / mL yoğunlukta askıya alın ve hücre çözeltisinin 1 mL'sini bir kriyovyal içine aktarın.
3. Kriyovalleri -80 ° C'de, sıcaklığı 1 ° C / dak düşüren bir dondurucu kaba koyun ve ardından kriyovyalleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojene taşıyın.

Sonuçlar

Yukarıda detaylandırılan izolasyon yöntemi uygulanarak kollajenaz kullanılmadan abdominal yağ dokusu örneklerinden hASC'ler başarıyla elde edildi. Dahası, hASC'ler hPL varlığında ve hayvansal kökenli başka herhangi bir bileşen olmadan tamamen ksenojenik içermeyen koşullarda genişletildi. Aşağıdaki sonuçlar protokolü destekler ve hPL ile paralel olarak kültürlenmiş hASC'lerden ve kontrol koşulu olarak FBS ile elde edilir.

İlk küme görünümünden sonra, hASC'ler k...

Tartışmalar

Adipoz türevi kök hücreler, bollukları, hızlı ve uygun fiyatlı izolasyon yöntemleri, yüksek in vitro/in vivo proliferasyon oranları ve köklülük/farklılaşma özellikleri ^18,19,20 nedeniyle son on yılda translasyonel araştırmaların ilgisini çekmiştir. Sonuç olarak, hASC'ler rejeneratif tıpta hücre bazlı stratejiler için mükemmel bir aday olarak kabul edilir²¹. Ya...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tubes	euroclone	et5015b
anti-CD105	BD Biosciences	BD560839
anti-CD34	BD Biosciences	BD555821
anti-CD45	BD Biosciences	BD555482
anti-CD73	BD Biosciences	BD561254
autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer)	Miltenyi	130-091-222
BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument)	BD accuri	-
Burker chamber	Blaubrand	717810
Cell freezing container	corning	CLS432002
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582
CoolCell Freezing container	Corning	CLS432002
Cryovials	clearline	390701
Dimethyl sulfide	Sigma Aldrich	D2650-100mL
disposabile blade scalpel	paragon	bs 2982
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	GIBCO	11965092
Human Platelet Lysate FD (GMP grade)	Stemulate	PL-NH-500
Infinite F50 spectrophotometer	Tecan	-
Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives	Olympus	CKX41
Petri dish 10 cm	Greiner bio-one	664160
Sterile scalpels	Reda	07104-00
Sterile scissors	Bochem	4071
Sterile tweezers	Bochem	1152
Swinging bucket centrifuge	Sigma	3-16K
T25 flasks	Greiner bio-one	6910170
TrypLe (animal free trypsin substitute)	GIBCO	12604-013