JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, Zanba-karıştır-kızartılmış Tiebangchui için Box-Behnken tepki yüzeyi yöntemi ile birlikte CRITIC kullanılarak etkili ve standart bir detoksifikasyon işleme yöntemini açıklamaktadır.

Özet

Çince'de Tiebangchui (TBC) olarak adlandırılan Aconitum sarkaç Busch.'un kurutulmuş kökü, en ünlü Tibet ilaçlarından biridir. Kuzeybatı Çin'de yaygın olarak kullanılan bir bitkidir. Bununla birlikte, TBC'nin yoğun toksisitesi ve terapötik ve toksik dozlarının benzer olması nedeniyle birçok zehirlenme vakası meydana gelmiştir. Bu nedenle, toksisitesini azaltmak için güvenli ve etkili bir yöntem bulmak acil bir iştir. Tibet tıbbı klasikleri arasında yapılan bir araştırma, Zanba ile karıştırılmış TBC'nin işleme yönteminin "Qinghai Eyaleti Tibet tıbbının işleme spesifikasyonunda (2010)" kaydedildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, spesifik işleme parametreleri henüz net değildir. Bu nedenle, bu çalışma Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'nin işleme teknolojisini optimize etmeyi ve standartlaştırmayı amaçlamaktadır.

İlk olarak, dört faktör üzerinde tek faktörlü bir deney yapıldı: TBC'nin dilim kalınlığı, Zanba miktarı, işleme sıcaklığı ve zaman. İndeks olarak Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'deki monoester ve diester alkaloid içeriği ile CRITIC, Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'nin işleme teknolojisini optimize etmek için Box-Behnken tepki yüzeyi yöntemi ile birleştirilmiştir. Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'nin optimize edilmiş işleme koşulları, 2 cm'lik bir TBC dilim kalınlığı, TBC'den üç kat daha fazla Zanba, 125 °C'lik bir işleme sıcaklığı ve 60 dakikalık kızartma idi. Bu çalışma, Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'nin kullanımı için optimize edilmiş ve standart işleme koşullarını belirlemiş, böylece Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'nin güvenli klinik kullanımı ve endüstriyel üretimi için deneysel bir temel sağlamıştır.

Giriş

En ünlü Tibet ilaçlarından biri olan Aconitum sarkaç Busch ve A. flavum Hand.-Mazz.'ın kurutulmuş köküne Çince 1,2'de Tiebangchui (TBC) denir. TBC'nin kurutulmuş kökleri soğuk ve rüzgarı dağıtmada, ağrıyı azaltmada ve şoku sakinleştirmede yardımcı olur. TBC'nin kurutulmuş köklerinin romatoid artrit, çürükler ve diğer soğuk algınlığı hastalıklarını tedavi etmek için yaygın olarak kullanıldığını belirten "Çin Halk Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı İlaç Standartları (Tibet Tıbbı)" nın ilk cildinde kaydedilmiştir3. Bununla birlikte, TBC'nin klinik terapötik dozu toksik dozuna benzer ve yanlış kullanım nedeniyle zehirlenme veya ölüm olayları sıklıkla bildirilmiştir4. Bu nedenle, toksisitenin azaltılması ve TBC'nin etkinliğinin korunması, yıllar içinde bir araştırma sıcak noktası haline gelmiştir.

Tibet tıbbında işleme, TBC'nin toksisitesini azaltmak için en etkili yöntemlerden biridir. "Qinghai Eyaleti Tibet tıbbının işleme spesifikasyonu (2010)" uyarınca, orijinal otlar (TBC) demir bir tencereye yerleştirilmeli ve Zanba sararana kadar Zanba ile karıştırılarak kızartılmalı, daha sonra Zanba çıkarılmalı ve otlar havada kurutulmalıdır 5,6. Bununla birlikte, işleme teknolojisini ve Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'nin kalitesini kontrol etmeyi zorlaştıran belirli bir proses parametresi belgelenmemiştir. CRITIC yöntemi, bulanıklaşmayı ve öznelliği önleyebilen ve7 tartımın nesnelliğini artırabilen objektif bir ağırlık yöntemidir. Box-Behnken tepki yüzeyi yöntemi, polinom uydurma8 aracılığıyla her bir faktör arasındaki etkileşimi doğrudan yansıtabilir. Box-Behnken yanıt yüzeyinin ve CRITIC yönteminin kombinasyonu, optimize edilmiş işleme protokolü 9,10'u elde etmek için işleme teknolojisini optimize etmek için yaygın olarak kullanılır. Bu yazıda değerlendirme indeksi olarak bir monoester-diterpenoid alkaloid (MDA) (benzoylakonitin) ve iki diester-diterpenoid alkaloid (DDA) (akonitin, 3-deoksiakonitin) kullanılmıştır. CRITIC, Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'nin işleme teknolojisini optimize etmek ve klinik güvenli kullanım için standart bir işleme yöntemi oluşturmak için Box-Behnken tepki yüzeyi yöntemi ile birleştirilerek uygulandı.

Protokol

Zanba-karıştır-kızartılmış TBC işleme yöntemi, Box-Behnken tepki yüzeyi yöntemiyle birlikte CRITIC tarafından optimize edildi ve standartlaştırıldı. Bu işlem sırasında değerlendirme indeksleri olarak benzoyalonitin, akonitin ve 3-deoksiakonitin kullanıldı.

1. Numune çözeltisi hazırlama

  1. Referans madde stok solüsyonunu hazırlayın. Elektronik analitik terazide tam olarak 9.94 mg benzoylakonitin, 8.49 mg akonitin ve 6.25 mg 3-deoksiakonitin (Malzeme Tablosu) tartın ve bunları 10 mL'lik bir hacimsel şişeye yerleştirin. Daha sonra, katıları çözmek ve hacmi 10 mL'ye çıkarmak için% 0.05 hidroklorik asit metanol çözeltisi ekleyin. Son olarak, 0.9940 mg / mL benzoylaconitine, 0.8490 mg / mL aconitine ve 0.6250 mg / mL 3-deoksiakonitin kütle konsantrasyonları ile referans madde stok çözeltisini elde etmek için karışımı iyice çalkalayın.
    DİKKAT: Hidroklorik asit oldukça aşındırıcı bir malzemedir11. Eldiven, laboratuvar önlüğü, gözlük ve duman başlığı gibi uygun korumayı kullanın.
  2. Test numunesi çözeltisini hazırlayın.
    1. Konik bir şişede 2 g Zanba-karıştır-kızartılmış TBC tozu tartın.
      1. 30 g TBC (2 cm) ve 90 g Zanba tartarak ve önceden ısıtılmış kızartma makinesine ekleyerek Zanba karıştırarak kızartılmış TBC'yi hazırlayın. Kızartma makinesinin süresini ve sıcaklığını sırasıyla 40 dakika ve 140 ° C'ye ayarlayın. Makineyi işlemeyi tamamlayacak şekilde ayarlayın.
      2. Zanba karıştırılarak kızartılmış TBC'yi ayrı ayrı 50 ağlı (0,355 mm) bir elek içinden geçebilen toz numuneler halinde öğütmek için yüksek hızlı bir parçalama makinesi kullanın.
    2. Önceki çalışmalara dayanarak yukarıdaki konik şişeye 3 mL amonyak çözeltisi ve 50 mL karışık izopropil alkol ve etil asetat çözeltisi (1: 1 v / v oranı) ekleyin12,13.
      NOT: Amonyak çözeltisini hazırlamak için, 100 mL'lik bir hacimsel şişeye 40 mL konsantre amonyak çözeltisi ekleyin ve ölçüm hattına arıtılmış suyla doldurun. Güçlü bir kokusu olduğu için konsantre amonyak çözeltisi kullanırken uygun koruyucu önlemleri alın.
    3. Yukarıdaki numuneyi ve konik şişeyi tartın ve ağırlığı kaydedin. 30 dakika boyunca ultrasonikat (voltaj: 220 V, frekans: 40 kHz).
      NOT: Akonitin alkaloidleri ısı ile kolayca ayrışır. Bu nedenle, ultrasonik ekstraksiyon sıcaklığı 25 ° C'nin altında olmalıdır.
    4. Ultrasonik ekstraksiyondan sonra numuneyi ve konik şişeyi tartın.
    5. İzopropil alkol ve etil asetat karışımı (1: 1 v / v oranı) ekleyerek kaybedilen ağırlığı telafi edin.
    6. Örnek çözeltiyi filtreleyin. 40 °C'de döner bir evaporatör kullanarak filtratın 25 mL'sini kuruluğa kadar buharlaştırın.
    7. 5 mL% 0.05 hidroklorik asit metanol çözeltisi ekleyerek kalıntıyı çözün, çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresinden geçirin ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yaparak analiz edin.
  3. 0.1988 mg / mL benzoylaconitine, 0.0509 mg / mL aconitine ve 0.0938 mg / mL 3-deoksiakonitin içeren karışık bir referans çözeltisi hazırlayın.
    NOT: Her standart (0.9940 mg benzoylakonitin, 0.2545 mg akonitin ve 0.4690 mg 3-deoksiakonitin), çözünme ortamı olarak% 0.05 hidroklorik asit metanol içinde 5 mL'lik bir hacimsel şişe içinde çözülür.
  4. 6.16 g amonyum asetat (Malzeme Tablosu) 2 L ultra saf suda (mobil faz A) çözerek 0.04 M amonyum asetat tamponu hazırlayın. Amonyak kullanarak pH'ı 8.50'ye ayarlayın.
    DİKKAT: Amonyak tehlikeli bir maddedir. Eldiven, laboratuvar önlüğü, gözlük ve duman başlığı gibi uygun korumayı kullanın.
  5. 2 L ultra saf% 100 asetonitril (mobil faz B) filtreleyin ve gazını giderin.
    DİKKAT: Asetonitril tehlikeli bir maddedir13. Eldiven, laboratuvar önlüğü, gözlük ve duman başlığı gibi uygun korumayı kullanın.

2. Kromatografik durum

  1. Önceden işlenmiş numune çözeltilerinin 10 μL'sini ikili pompalı bir HPLC sistemine enjekte edin. MDA ve DDA'ların ayrılması için mobil fazları A ve B olan bir ODS-3 sütunu (5 μm x 4,6 mm x 250 mm; 30 °C'de çalışan) kullanan bir HPLC sistemi kullanın. Teknik çoğaltma için her numuneyi üç kez enjekte edin.
  2. ODS-3 sütunu için Tablo 1'de gösterildiği gibi yöntemi programlayın. Akış hızını 1,0 mL/dak ve algılama dalga boyunu 235 nm olarak ayarlayın.
  3. Her hedef bileşiğin tepe alanlarını kaydedin.
    NOT: Enstrümanların detayları Malzeme Tablosunda bulunabilir.

3. Sistem uyarlanabilirlik testi

NOT: 3.1-3.5 adımlarını gerçekleştirmek üzere kromatografik koşullar için bölüm 2'ye bakın.

  1. Konsantrasyon ve tepe alanı arasındaki doğrusal ilişkiyi araştırın.
    1. Çeşitli konsantrasyonlarda - 19.88, 39.76, 59.64, 159.04, 198.80 ve 497.00 μg / mL - benzoylakonitin çözeltisi hazırlayın.
    2. Çeşitli konsantrasyonlarda - 8.49, 16.98, 25.47, 33.96, 50.94 ve 169.80 μg / mL - akonitin çözeltisi hazırlayın.
    3. Çeşitli konsantrasyonlarda - 1.875, 12.50, 37.50, 62.50, 93.75 ve 125.00 μg / mL - 3-deoksiakonitin çözeltisi hazırlayın.
    4. Yukarıdaki referans çözeltilerini düşük kütle konsantrasyonundan yüksek kütle konsantrasyonuna enjekte edin ve pik alanları kaydedin.
    5. Tepe alanına karşı referans çözüm konsantrasyonunun (μg / L) grafiğinden üç doğrusal regresyon denklemi elde edin.
      NOT: Benzoylakonitin, akonitin ve 3-deoksiakonitin konsantrasyonlarının bu standart eğrinin doğrusal aralığına girdiğinden emin olun.
  2. HPLC sistemine sürekli olarak 10 μL'lik numune çözeltisinin altı tekrarını enjekte ederek hassasiyet testleri gerçekleştirin ve numuneleri bölüm 2'de açıklanan aynı HPLC koşulları altında çalıştırın. Benzoylaconitine, aconitine ve 3-deoxyaconitine'in tepe alanlarını kaydedin.
  3. Hazırlanan numune çözeltisinin 10 μL'sini enjekte ederek stabilite testi deneyleri yapın ve 0 saat, 2 saat, 4 saat, 8 saat, 12 saat ve 24 saat sonra tepe alanlarını belirleyin.
    NOT: Tepe bölgeleri, referans alınan HPLC sistemi tarafından otomatik olarak kaydedilir. Bu zaman dilimleri ilgili literatüre dayanmaktadır15,16,17.
  4. Adım 1.2'deki yönteme göre paralel olarak altı test numunesi çözeltisi hazırlamak için aynı parti Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'yi alarak tekrarlanabilirlik testini gerçekleştirin. Her numuneden 10 μL'sini HPLC sistemine enjekte edin ve numuneleri bölüm 2'de açıklandığı gibi çalıştırın.
    NOT: Tekrarlanabilirlik, altı numune arasındaki konsantrasyon farkları karşılaştırılarak değerlendirilmiştir.
  5. Test çözeltisi için aynı Zanba karıştırılmış kızartılmış TBC partisinin altı bölümünü hazırlayarak kurtarma deneyini gerçekleştirin. Ardından, geri kazanım oranını hesaplamak için her bir dizin bileşeninin referans maddesinin ~% 100'ünü test çözeltisinin altı bölümüne ekleyin. Bu numuneleri (10 μL) bölüm 2'de açıklanan koşullar altında HPLC sistemine enjekte edin ve Denklem (1)'i kullanarak geri kazanım oranını hesaplayın:
    figure-protocol-7508(1)
    NOT: Eq (1)'de A, test çözeltisinde ölçülecek bileşenin miktarıdır, B, eklenen referans madde miktarıdır ve C, referans maddeyi ve Zanba-karıştırarak kızartılmış TBC numunesini içeren çözeltinin ölçülen değeridir.

4. Tek faktörlü deneyler

  1. Dilim kalınlığının karşılaştırılması
    1. TBC'nin kalınlığının sırasıyla 0,5, 1, 2, 3 ve 4 cm olduğu testler için her biri 30 g TBC'ye sahip beş grup hazırlayın. TBC'ninkinden (90 g) üç kat daha fazla olan bir miktar Zanba tartın.
      NOT: TBC toksiktir. Eldiven, laboratuvar önlüğü, gözlük ve duman başlığı gibi uygun korumayı kullanın ve kesme işlemi sırasında dikkatli olun. Ön deney boyunca, TBC ve Zanba arasındaki tam temas için Zanba miktarının üç katına ihtiyaç duyulduğu bulundu. Bu nedenle, resmi deneysel tasarımda, çalışma dilim kalınlığını incelerken Zanba miktarının üç katını seçti.
    2. Otomatik kızartma makinesinin sıcaklığını ve süresini sırasıyla 140 °C ve 40 dakika olarak ayarlayın.
    3. Otomatik kızartma makinesi ayarlanan sıcaklığa kadar ısıtıldıktan sonra makineye ~ 30 g TBC ve 90 g Zanba ekleyin.
    4. Adım 1.2'yi izleyerek örnek çözümleri hazırlayın. Farklı işleme ürünlerindeki MDA ve DDA'ların içeriklerini standart eğriye göre hesaplayın (Tablo 2). Bölüm 6'daki CRITIC yöntemi ile sonuçlara dayalı kapsamlı puanı hesaplayın.
    5. Bu şekilde, koşulların optimizasyonu için Zanba miktarlarının yanı sıra işleme sıcaklıklarını ve sürelerini karşılaştırın.
  2. Zanba miktarının karşılaştırılması
    1. Her biri 30 g TBC (2 cm) içeren, Zanba miktarının sırasıyla TBC'nin bir, iki, üç, dört ve beş katı olduğu beş grup test gerçekleştirin.
    2. İşleme için kızartma makinesini açın. Kızartma makinesinin zamanını ve sıcaklığını 40 dakika ve 140 ° C'ye ayarlayın.
    3. Adım 1.2'yi izleyerek örnek çözümleri hazırlayın. Farklı işleme ürünlerindeki MDA ve DDA'ların içeriğini standart eğriye göre hesaplayın (Tablo 2). Bölüm 6'daki CRITIC yöntemi ile sonuçlara dayalı kapsamlı puanı hesaplayın.
  3. İşleme sıcaklığının karşılaştırılması
    1. Her biri 30 g TBC (2 cm) ve 90 g Zanba içeren beş grup test yapın.
    2. İşleme için kızartma makinesini açın. İşleme sıcaklığını 100 °C, 120 °C, 140 °C, 160 °C ve 180 °C'ye ayarlayın. İşlem süresini 40 dakika olarak ayarlayın.
      NOT: Ön deneyler yoluyla, işlem sıcaklığı 100 ° C'nin altında olduğunda Zanba sararma hızının çok düşük olduğu ve sıcaklık çok yüksekse (180 ° C'nin üzerinde) Zanba'nın yanmasının ve siyaha dönmesinin kolay olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, 100 ° C ve 180 ° C, işleme sırasında sırasıyla minimum ve maksimum sıcaklık değerleri olarak ayarlanmıştır.
    3. Adım 1.2'yi izleyerek örnek çözümleri hazırlayın. MDA ve DDA'ların tepe alanlarını kaydedin. Farklı işleme ürünlerindeki MDA ve DDA'ların içeriğini standart eğriye göre hesaplayın (Tablo 2). Bölüm 6'daki CRITIC yöntemi ile sonuçlara dayalı kapsamlı puanı hesaplayın.
      NOT: Deney, 160 °C ve 180 °C'lik yüksek sıcaklıkları içermektedir. Deney sırasında laboratuvarın güvenlik koduna göre güvenliğe dikkat edin.
  4. İşlem süresinin karşılaştırılması
    1. Her biri 30 g TBC (2 cm) ve 90 g Zanba içeren beş grup test yapın.
    2. İşleme için kızartma makinesini açın. İşlem süresini 20, 40, 60, 80 ve 100 dakika olarak ayarlayın. Sıcaklığı 140 °C'ye ayarlayın.
    3. Adım 1.2'deki açıklamayı izleyerek örnek çözümleri hazırlayın. MDA ve DDA'ların tepe alanlarını kaydedin. Farklı işleme ürünlerindeki MDA ve DDA'ların kalitesini standart eğriye göre hesaplayın (Tablo 2). Bölüm 6'daki CRITIC yöntemi ile sonuçlara dayalı kapsamlı puanı hesaplayın.

5. Tepki yüzeyi metodolojisi (RSM) kullanılarak Zanba-karıştırılmış kızartılmış TBC'nin işleme teknolojisi optimizasyonu

  1. Kutu-Behnken tepki yüzeyi tasarımı
    1. Tek faktörlü testler (adım 4.1-4.4) kullanarak ön deneylerle dilim kalınlığı aralığını (A, 1-3 cm), Zanba miktarını (B, 2-4x), işleme sıcaklığını (C, 100-140 °C) ve işlem süresini (D, 40-80 dakika) belirleyin.
      NOT: Dört değişkenin kodlanmış değerleri ve düzeyleri Tablo 3'te gösterilmiştir. Her değişkenin üç düzeyi -1, 0 ve 1 olarak kodlanmıştır.
  2. Matrisi oluşturmak ve yanıt yüzeyi modellerini analiz etmek için yazılım kullanın.
    NOT: Yazılım kullanımı için ekran görüntüleri Ek Dosya 1'de gösterilmiştir.
    1. 24 deneyden oluşan üç seviyeli dört faktörlü bir Box-Behnken tasarımı kullanın (bu çalışmada yapıldığı gibi) ve karelerin saf hata toplamını hesaplamak için beş kopyayı (çalışma sırası 1, 9, 14, 16 ve 25) ölçün (Tablo 4). Yanıt olarak kapsamlı puanı (Y) ayarlayın (1-4 arasındaki adımlar, Ek Dosya 1).
      1. Ana sayfada, Yeni Tasarım'a tıklayın (adım 1, Ek Dosya 1) ve Tasarım sayfasının sol panelinde Yanıt Yüzeyi'ne tıklayın | Box-Behnken ve tablodaki dört faktörün parametrelerini ayarlayın (adım 2, Ek Dosya 1).
      2. İleri'ye tıklayın (adım 2, Ek Dosya 1), yanıt adlarını ayarlayın ve Son'a tıklayın (adım 3, Ek Dosya 1).
      3. Yukarıdaki işlemle yanıt yüzeyi tasarımını oluşturun (adım 4, Ek Dosya 1).
  3. Denemeyi, yanıt yüzeyi için tasarlanmış 29 senaryoya göre tamamlayın.
  4. Adım 1.2'yi izleyerek örnek çözümleri hazırlayın.
  5. MDA ve DDA'ların tepe alanlarını kaydedin.
    NOT: Tepe bölgeleri, referans alınan HPLC sistemi tarafından otomatik olarak kaydedilir.
  6. Farklı işleme ürünlerindeki MDA ve DDA'ların kalitesini hesaplayın.
  7. 6. adımdaki CRITIC yöntemiyle sonuçlara göre kapsamlı puanı hesaplayın.
    Not: belirli yöntem adım 6'da gösterilmiştir.
  8. Elde edilen 29 denemenin kapsamlı puanını bilgisayara girin ve referans verilen yazılımı kullanarak analiz edin (adım 5, Ek Dosya 1).
  9. Yazılım aracılığıyla 3D model grafiklerinde çizilen polinom denklemlerinin ve tepki yüzeyi analizlerinin istatistiksel doğrulamasını gerçekleştirin (adım 6-8, Ek Dosya 1).
    1. Sol Gezinti bölmesinde, Analiz (+) altında, Y'ye tıklayın ve ardından Yapılandır penceresinde Analizi Başlat'a tıklayın (adım 6, Ek Dosya 1).
    2. Üst menüdeki ANOVA'ya tıklayın ve varyans analizini gösteren sonuç tablosunu gözlemleyin (adım 7, Ek Dosya 1).
    3. Üst menüde, işleme parametrelerinin sentetik puanlar üzerindeki etkilerini yansıtan yanıt yüzeyi grafiklerini elde etmek için Model Grafikleri'ne ve ardından 3B Yüzey'e tıklayın (adım 8, Ek Dosya 1).
  10. İşleme teknolojisinin kararlılığını doğrulamak için yanıt yüzey modelinin doğrulamasını tahmin edilen optimum koşullar altında (adım 9, Ek Dosya 1) üçlü olarak gerçekleştirin. Sol Gezinti bölmesinde, Optimizasyon altında, Sayısal'a tıklayın Ardından, üst menüde Çözümler'e tıklayın. Tahmin edilen en uygun koşulları gözlemleyin.

6. Model değerlendirmesi

NOT: Bu adım, her tek faktörlü deney veya tepki yüzeyi deneyi tamamlandıktan sonra gerçekleştirilmelidir. Her deney (örneğin, dilim kalınlığının karşılaştırılması) tamamlandıktan sonra, farklı örneklerdeki MDA ve DDA'ların içeriği, adım 1.2 ve bölüm 2'ye göre beş veri kümesi elde etmek için ölçülür. Veriler Ek Tablo S1'de gösterilmiştir.

  1. İndeksin boyutsuz işlenmesi
    NOT: Bu adım, ölçülen değeri (Xij) boyutsuz bir göreli değere dönüştürür, böylece her endeksin değeri aynı miktar seviyesinde olur. Bu işlem, farklı birimlerdeki veya18 büyüklüğündeki göstergelerin kapsamlı analizini ve karşılaştırılmasını kolaylaştırabilir. Örnekleme amacıyla, aşağıda gösterilen hesaplamalar için dilim kalınlığı değerleri kullanılmıştır (Ek Tablo S1).
    1. MDA'nın içeriğini standartlaştırın (yMDA edinin; MDA, benzoylaconitine) Eq. (2)'deki formülü kullanarak ifade eder.
      NOT: "i" indeksi dört faktörden birini temsil eder ve dilim kalınlığı araştırılan ilk faktördür. Bu nedenle, i'nin değeri 1'e eşittir. "j" endeksi her bir faktör seviyesini temsil eder; Böylece, dilim kalınlığı ilk seviye (0,5 cm) olduğunda, J 1'e eşittir; Dilim kalınlığı beşinci seviye (4 cm) olduğunda, j 5'e eşittir. 0.5, 1, 2, 3 ve 4 cm kalınlıklarındaki işlenmiş TBC'deki MDA (Xij) içeriği sırasıyla 0.9693, 1.0876, 1.3940, 1.4185 ve 1.3614 mg / g idi. Böylece, x j,max 1.4185 ve xj, min 0.9693'tür.
      figure-protocol-16952(2)
      Böyle figure-protocol-17070
      Burada Xij , deneyin MDA'sının i-th faktöründe ve j-th seviyesinde ölçülen içeriğidir; xj, min, bu deney grubundaki MDA'nın minimum içeriğidir; ve xj, max, bu deney grubundaki MDA'nın maksimum içeriğidir. Böylece, i = 1, 2, ..., m ve j = 1, 2, ..., n.
      NOT: Bu nedenle, MDA'nın standartlaştırılmış değerleri Eq (2) kullanılarak 0,0000, 0,2634, 0,9455, 1,0000 ve 0,8729'dur.
    2. DDA'ların toplam içeriğini standartlaştırmak (yDDA'ları edinin; DDA'lar, Eq. (3)'teki formülü kullanarak aconitine ve 3-deoxyaconitine'i ifade eder.
      NOT: i dört faktörden biridir ve j faktörlerin her bir seviyesidir; Xij , deneyin DDA'larının i-th faktöründe ve j-th seviyesinde ölçülen içeriğidir; xj, min, bu grup veri deneyindeki DDA'ların minimum içeriğidir; ve xj, maksimum, bu grup veri deneyindeki DDA'ların maksimum içeriğidir. Bu şekilde, i = 1, 2, ..., m ve j = 1, 2, ..., n. İşlenmiş TBC'deki DDA'ların (Xij) içeriği 0.5, 1, 2, 3 ve 4 cm kalınlıklarında sırasıyla 0.3492, 0.2692, 0.2962, 0.5354, 0.5124 mg / g idi. Böylece, x j,max 0.5354 ve xj, min 0.2692'dir.
      figure-protocol-18516(3)
      figure-protocol-18628
      NOT: Standartlaştırılmış değerler, Eq kullanılarak 0,6995, 1,0000, 0,8986, 0,0000 ve 0,0864'tür.
  2. Eqs'ye göre karşılık gelen kontrast yoğunluğunu (S i), çatışmayı (δ i), bilgiyi (C i) ve indeks ağırlığını (W i) hesaplayın. (4) ila (7), sırasıyla19,20.
    NOT: i = 1, 2, ..., m. yij, deneyin MDA veya DDA'larının içeriğinin i-th faktöründe ve j-th seviyesinde standartlaştırılmış verileridir.
    1. Kontrast yoğunluğunu tahmin etmek için önce ortalama MDA değerini hesaplayın.
      figure-protocol-19440
      MDA'nın ortalama değeri nerede figure-protocol-19563?
      figure-protocol-19656(4)
      figure-protocol-19768
    2. Çakışma değerini hesaplamak için, önce Excel21'deki CORREL işlevini kullanarakij γ korelasyon katsayısını tahmin edin.
      figure-protocol-20037(5)
      figure-protocol-20149
    3. Bilgi değerlerini aşağıdaki gibi hesaplayın.
      figure-protocol-20298(6)
      figure-protocol-20411
      NOT: Benzer şekilde, C1, DDAS = 0,7210
    4. İndeks ağırlığını aşağıdaki gibi hesaplayın.
      figure-protocol-20622(7)
      figure-protocol-20735
      NOT: Bu nedenle, dilim kalınlıklarına kıyasla MDA ve DDA'ların ağırlık katsayıları sırasıyla 0,4945 ve 0,5055 olarak belirlenmiştir.
  3. Dilim kalınlıklarının kapsamlı puanlarını hesaplayın.
    figure-protocol-21040
    figure-protocol-21133
    figure-protocol-21226
    figure-protocol-21319
    figure-protocol-21412
    NOT: Y13 maksimum değerdir. Bu nedenle, dilimleme kalınlıklarının en iyi parametresi üçüncü seviyedir - 2 cm.

   

Sonuçlar

Bu çalışmada, kullanılan elüzyon gradyanı, tekrarlanan hata ayıklamadan sonra belirlendiği gibi, Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'deki üç indeks bileşeni için iyi bir çözünürlüğe (Şekil 1) sahipti. Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'deki üç indeks bileşeni, belirli bir konsantrasyon aralığında iyi bir doğrusal ilişkiye sahipti (Tablo 2). Zanba-karıştır-kızartılmış TBC'nin hassasiyeti (Tablo 5), stabilitesi (Tablo 6),...

Tartışmalar

TBC, soğuk algınlığını giderme ve ağrıyı hafifletme etkileri olan önemli bir Tibet ilacıdır. Çin'de binlerce yıldır travmatik yaralanma ve romatizmal artraljiyi tedavi etmek için çoğunlukla kullanılmaktadır24,25,26. Diterpenoid alkaloidler, TBC27,28,29'un hem aktif hem de toksik bileşenleridir. TBC'nin aconitum alka...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82130113), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (No. 2021MD703800), Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bölümü Gençleri Bilim Vakfı (No. 2022NSFSC1449) ve Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi "Xinglin Scholars" Araştırma Tanıtım Programı (No. BSH2021009).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3-DeoxyaconitineChengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.DST221109-033
AconitineChengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.DSTDW000602
Ammonium acetateTianjin Kermel Chemical Reagent Co., LtdChromatographic grade
BenzoylaconitineChengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.DSTDB005502
Design-Expert softwareStat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USAversion 13.0
Electronic analytical balanceShanghai Liangping Instruments Co., Ltd.FA1004
High performance liquid chromatographySHIMADZU Co., Ltd.LC-20A
High-speed smashing machineBeijing Zhongxing Weiye Instrument Co., Ltd.FW-100
Millipore filterTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltdφ13 0.22 Nylon66
stir-Fry machineChangzhou Maisi Machinery Co., LtdType 5
TiebangchuiGannan Baicao Biotechnology Development Co., Ltd20211012
Ultra pure water systemicRephiLe Bioscience, Ltd.Genie G
Ultrasonic cleansing machineNingbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., LtdSB2200
Zanba27 Chuanzang Road, Ganzi County-

Referanslar

  1. Li, C. Y., et al. Aconitum pendulum and Aconitum flavum: A narrative review on traditional uses, phytochemistry, bioactivities and processing methods. Journal of Ethnopharmacology. 292, 115216 (2022).
  2. Wang, J., Meng, X. H., Chai, T., Yang, J. L., Shi, Y. P. Diterpenoid alkaloids and one lignan from the roots of Aconitum pendulum Busch. Natural Products and Bioprospecting. 9 (6), 419-423 (2019).
  3. Yu, L., et al. Traditional Tibetan medicine: therapeutic potential in rheumatoid arthritis. Frontiers In Pharmacology. 13, 938915 (2022).
  4. Zhao, R., et al. One case of ventricular arrhythmia caused by poisoning of traditional Chinese medicine Aconitum pendulum Busch. Journal of People's Military Medical. 61 (4), 346-348 (2018).
  5. Qinghai Medical Products Administration. Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai province. Qinghai Nationalities Publishing House. , 96-97 (2010).
  6. Li, J., et al. Comparison of three objective weighting methods to optimize the extraction process of Jianwei Chupi granules. Journal of Guangdong Pharmaceutical University. 38 (6), 91-97 (2022).
  7. Feng, Z. G., et al. Processing methods and the underlying detoxification mechanisms for toxic medicinal materials used by ethnic minorities in China: A review. Journal of Ethnopharmacology. 305, 116126 (2023).
  8. Hsu, Y. T., Su, C. S. Application of Box-Behnken design to investigate the effect of process parameters on the microparticle production of ethenzamide through the rapid expansion of the supercritical solutions process. Pharmaceutics. 12 (1), 42 (2020).
  9. Cheng, F., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with box-behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (8), 1838-1842 (2022).
  10. Huang, X., et al. Optimization of microwave processing technology for carbonized Gardenia jasminoides by Box-Behnken response surface methodology based on CRITIC weighted evaluation. Chinese Herbal Medicines. 48 (6), 1133-1138 (2017).
  11. Elling, U., et al. Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells. Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).
  12. Gu, J., Wang, Y. P., Ma, X. Simultaneous determinnation of three diester diterpenoid alkaloids in the toots of Aconiti flavi et penduli by HPLC method. Chinese Pharmaceutical Affairs. 28 (6), 618-621 (2014).
  13. Zhang, Y., Fu, X. UPLC simultaneous determination of six esteric alkaloids components in Aconitum Flaram Hand.Mazz. Asia-Pacific Traditional Medicine. 16 (5), 62-65 (2020).
  14. Rumachik, N. G., Malaker, S. A., Paulk, N. K. VectorMOD: Method for bottom-up proteomic characterization of rAAV capsid post-translational modifications and vector impurities. Frontiers In Immunology. 12, 657795 (2021).
  15. Wang, Y. J., Tao, P., Wang, Y. Attenuated structural transformation of aconitine during sand frying process and antiarrhythmic effect of its converted products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 7243052 (2021).
  16. Wang, H. P., Zhang, Y. B., Yang, X. W., Zhao, D. Q., Wang, Y. P. Rapid characterization of ginsenosides in the roots and rhizomes of Panax ginseng by UPLC-DAD-QTOF-MS/MS and simultaneous determination of 19 ginsenosides by HPLC-ESI-MS. Journal of Ginseng Research. 40 (4), 382-394 (2016).
  17. vander Leeuw, G., et al. Pain and cognitive function among older adults living in the community. Journals of Gerontology Series A. Biological Sciences and Medical Sciences. 71 (3), 398-405 (2016).
  18. Lao, D., Liu, R., Liang, J. Study on plasma metabolomics for HIV/AIDS patients treated by HAART based on LC/MS-MS. Frontiers in Pharmacology. 13, 885386 (2022).
  19. Li, Y., et al. Evaluation of the effectiveness of VOC-contaminated soil preparation based on AHP-CRITIC-TOPSIS model. Chemosphere. 271, 129571 (2021).
  20. Zhong, S., Chen, Y., Miao, Y. Using improved CRITIC method to evaluate thermal coal suppliers. Scientific Reports. 13 (1), 195 (2023).
  21. Lewis, N. S., et al. Magnetically levitated mesenchymal stem cell spheroids cultured with a collagen gel maintain phenotype and quiescence. Journal of Tissue Engineering. 8, (2017).
  22. Chinese Pharmacopoeia Committee. . Pharmacopoeia of the People's Republic of China. 4, (2020).
  23. Li, G., et al. Effect of response surface methodology-optimized ultrasound-assisted pretreatment extraction on the composition of essential oil released from tribute citrus peels. Frontiers in Nutrition. 9, 840780 (2022).
  24. Liu, X. F., et al. Hezi inhibits Tiebangchui-induced cardiotoxicity and preserves its anti-rheumatoid arthritis effects by regulating the pharmacokinetics of aconitine and deoxyaconitine. Journal of Ethnopharmacology. 302, 115915 (2023).
  25. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nature Reviews.Disease Primers. 4, 18001 (2018).
  26. Wang, F., et al. C19-norditerpenoid alkaloids from Aconitum szechenyianum and their effects on LPS-activated NO production. Molecules. 21 (9), 1175 (2016).
  27. Wang, B., et al. Study on the alkaloids in Tibetan medicine Aconitum pendulum Busch by HPLC-MSn combined with column chromatography. Journal of Chromatographic Science. 54 (5), 752-758 (2016).
  28. Liu, S., et al. A review of traditional and current methods used to potentially reduce toxicity of Aconitum roots in Traditional Chinese Medicine. Journal of Ethnopharmacology. 207, 237-250 (2017).
  29. Qiu, Z. D., et al. Online discovery of the molecular mechanism for directionally detoxification of Fuzi using real-time extractive electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114216 (2021).
  30. El-Shazly, M., et al. Use, history, and liquid chromatography/mass spectrometry chemical analysis of Aconitum. Journal of Food and Drug Analysis. 24 (1), 29-45 (2016).
  31. Chan, T. Y. K. Aconitum alkaloid poisoning because of contamination of herbs by aconite roots. Phytotherapy Research. 30 (1), 3-8 (2016).
  32. Guo, L., et al. Exploring microbial dynamics associated with flavours production during highland barley wine fermentation. Food Research International. 130, 108971 (2020).
  33. Guo, T. L., Horvath, C., Chen, L., Chen, J., Zheng, B. Understanding the nutrient composition and nutritional functions of highland barley (Qingke): A review. Trends in Food Science & Technology. 103, 109-117 (2020).
  34. Wu, H., et al. Anti-myocardial infarction effects of Radix Aconiti Lateralis Preparata extracts and their influence on small molecules in the heart using matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry imaging. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4837 (2019).
  35. Huang, G., et al. Study on cardiotoxicity and mechanism of "Fuzi" extracts based on metabonomics. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3506 (2018).
  36. Li, S. L., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  37. Xie, Y., et al. Optimization of processing technology of braised Rehmanniae Raidx based on multiple indexes and response surface technology and correlation between components and color. Journal of Chinese Traditional Medicine. 47 (18), 4927-4937 (2022).
  38. Yang, X. Q., Xu, W., Xiao, C. P., Sun, J., Feng, Y. Z. Study on processing technology of Atractylodes chinensis with rice water and its pharmacodynamics of anti-diarrhea. Chinese Herbal Medicines. 53 (1), 78-86 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 195Aconitum sarka Buschi leme teknolojisiZanba kar t r k zart lm TiebangchuiCRITIC y ntemiyan t y zeyi y ntemi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır