İn Vitro Çinko Taşıma Testi Kullanılarak Memeli Çinko Taşıyıcılarının Karakterize Edilmesi

Özet

Çinko taşınmasının, protein fonksiyonuna zayıf nedensel bağlantılar ve düşük zamansal çözünürlük nedeniyle ölçülmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, Zn 2 + duyarlı bir floresan boya kullanarak canlı hücrelerden Zn^{2 +} ekstrüzyonunu yüksek zamansal çözünürlükle izlemek için bir yöntemi açıklar, böylece doğrudan bir Zn^{2 +} akışı ölçümü sağlar.

Özet

Zn²⁺ iyonları gibi geçiş metalleri, hücresel toksisiteleri nedeniyle sıkı bir şekilde düzenlenmelidir. Daha önce, Zn²⁺ taşıyıcılarının aktivitesi, farklı Zn²⁺ konsantrasyonları altında taşıyıcının ekspresyon seviyesi belirlenerek dolaylı olarak ölçülüyordu. Bu, immünohistokimya kullanılarak, dokudaki mRNA'yı ölçerek veya hücresel Zn²⁺ seviyelerini belirleyerek yapıldı. Hücre içi Zn²⁺ sensörlerinin geliştirilmesiyle, çinko taşıyıcıların aktiviteleri şu anda esas olarak, floresan problar kullanılarak tespit edilen hücre içi Zn 2 + 'daki değişikliklerin Zn^{2 +} taşıyıcılarının ekspresyonu ile ilişkilendirilmesiyle belirlenmektedir. Bununla birlikte, bugün bile, sadece birkaç laboratuvar hücre içi Zn^{2 +} 'daki dinamik değişiklikleri izlemekte ve bunu çinko taşıyıcılarının aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanmaktadır. Sorunun bir kısmı, ZnT ailesinin 10 çinko taşıyıcısından, ZnT10 (manganez taşır) hariç, plazma zarında sadece çinko taşıyıcı 1'in (ZnT1) lokalize olmasıdır. Bu nedenle, taşıma aktivitesini hücre içi^Zn2+ konsantrasyonundaki değişikliklere bağlamak zordur. Bu makale, çinkoya özgü bir floresan boya olan FluoZin-3'e dayalı bir tahlil kullanarak çinko taşıma kinetiğini belirlemenin doğrudan bir yolunu açıklamaktadır. Bu boya, ester formunda memeli hücrelerine yüklenir ve daha sonra hücresel diesteraz aktivitesi nedeniyle sitozolde tutulur. Hücreler, Zn²+ iyonofor pirityonu kullanılarak Zn²⁺ ile yüklenir. ZnT1 aktivitesi, hücre yıkamasını takiben floresanstaki azalmanın doğrusal kısmından değerlendirilir. 470 nm'lik bir uyarılmada ve 520 nm'lik bir emisyonda ölçülen floresan, serbest hücre içi Zn²⁺ ile orantılıdır. mCherry florofor ile etiketlenmiş ZnT1'i eksprese eden hücrelerin seçilmesi, yalnızca taşıyıcıyı eksprese eden hücrelerin izlenmesine izin verir. Bu test, ZnT1 proteininin farklı alanlarının, hücreden fazla çinko ekstrüde eden ökaryotik bir transmembran proteini olan insan ZnT1'in taşıma mekanizmasına katkısını araştırmak için kullanılır.

Giriş

Çinko, hücresel ortamda önemli bir eser elementtir. Tüm proteinlerin üçte birini içerir ve kataliz¹, transkripsiyon² ve yapısal motifler³ gibi çeşitli hücresel süreçlerde yer alır. Bununla birlikte, redoks-inert olmasına rağmen, yüksek çinko konsantrasyonları hücre için toksiktir, bu nedenle çinko homeostazını düzenleyen mekanizmaların varlığı olmadan hiçbir memeli organizması hayatta kalmamıştır. Memelilerde bu süreçten üç mekanizma sorumludur: (1) çinkoyu yüksek afinitede bağlayan sitozolik sistein açısından zengin proteinler olan metallotiyoninler, böylece aşırı serbest sitozolik çinko

Protokol

1. Hücre transfeksiyonu

1. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle besiortamındaki (DMEM) kültür HEK293T hücreleri, 37 ° C/% 5 CO 2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 10 cm'lik bir plaka (8.8 x 10^{6 toplam} hücre) üzerinde birleşene kadar% 10 fetal sığır serumu (FBS),₂ mM L-glutamin ve 1x penisilin / streptomisin (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. 12 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna bir adet 13 mm'lik lamel yerleştirin. 0.44 x 10⁶ tripsinizli hücreyi 1.1 adımından 12 mL tam DMEM'de seyreltin. Üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Her kuyucuğu 1 mL karışık çözelti ile d....

Tartışmalar

Yukarıda tarif edilen yöntem, hücre içi çinko konsantrasyonunun yüksek zamansal çözünürlükle doğrudan ölçülmesine izin verir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, hücre içi Zn²⁺'daki değişikliklerin izlenmesini içeren bu yöntem, arka plan gürültüsünü önemli ölçüde azaltabilir. Ek olarak, boyanın çinko için seçiciliği, diğer metal katyonlarla potansiyel çapraz etkileşimleri^{ortadan kaldırır 18,19}. Son .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm plate	greiner bio-one	664160
12-well cell culture plate	greiner bio-one	665180
13 mm coverslips	Superior Marienfeld	111530
22 mm cover slides	Superior Marienfeld	101050
6-well culture plate	greiner bio-one	657160
Bovine serum albumin	bioWorld	22070008
Calcium chloride anhydrous, granular	Sigma Aldrich	C1016	Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose	Glentham Life Science	GC6947	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope	Nikon	TI-DH	Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30088.03
Fine tweezers	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution	Cytiva	SV30010
LED illumination system	CoolLED	pE-4000
L-glutamine	Biological Industries	03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate	Merck	1.05833	Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software	Nikon	AR
Pluronic acid F-127	Millipore	540025
Pottasium chloride	Bio-Lab	163823	Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione	Sigma Aldrich	H3261	Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit	Warner Instruments	W4 64-0378
Sodium chloride	Bio-Lab	190305	Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate			Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
	Sigma Aldrich	31665