Fare Dorsal Kök Ganglion Kriyoseksiyonu için Bir Prosedür

Özet

Burada sunulan, sürekli olarak yüksek kaliteli dorsal kök ganglion kriyostat kesitleri elde etmek için yapılan geliştirmedir.

Özet

Yüksek kaliteli fare dorsal kök ganglionu (DRG) kriyostat kesitleri, enflamatuar ve nöropatik ağrı, kaşıntı ve diğer periferik nörolojik durumların araştırılmasında uygun immünokimya boyama ve RNAscope çalışmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte, DRG dokusunun küçük numune boyutu nedeniyle cam slaytlar üzerinde tutarlı bir şekilde yüksek kaliteli, sağlam ve düz kriyostat bölümleri elde etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Şimdiye kadar, DRG kriyoseksiyonu için en uygun protokolü açıklayan bir makale bulunmamaktadır. Bu protokol, DRG kriyoseksiyonu ile ilgili sık karşılaşılan zorlukları çözmek için adım adım bir yöntem sunar. Sunulan makale, DRG doku örneklerinden çevreleyen sıvının nasıl çıkarılacağını, DRG bölümlerinin aynı yöne bakacak şekilde slayt üzerine nasıl yerleştirileceğini ve cam slayt üzerindeki bölümlerin yukarı kıvrılmadan nasıl düzleştirileceğini açıklamaktadır. Bu protokol DRG örneklerinin kriyoseksiyonu için geliştirilmiş olmasına rağmen, küçük bir örnek boyutuna sahip diğer birçok dokunun kriyokesiti için uygulanabilir.

Giriş

Dorsal kök ganglionu (DRG), birincil duyusal nöronları, doku makrofajlarını ve birincil duyusal nöronları çevreleyen uydu hücrelerini^içerir 1,2,3,4. Zararsız ve zararlı sinyallerin işlenmesinde önemli bir anatomik yapıdır ve ağrı, kaşıntı ve çeşitli periferik sinir bozukluklarında kritik rol oynar 5,6,7,8,9,10,11,12,13.

Protokol

Bu çalışma için, hayvan deneyleri UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütüldü. Burada yetişkin, 8-12 haftalık C57BL / 6 erkek ve dişi fareler (evde yetiştirilmiş) kullanıldı.

1. DRG numune hazırlama

1. Fareleri% 2.5 Avertin ile uyuşturun (Malzeme Tablosuna bakınız). Ağrılı stimülasyona yanıt verilmemesi nedeniyle yeterli anestezi sağlayın. Hayvanları transkardiyal olarak 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından daha önce tarif edildiği gibi %4 formaldehit ile perfüze edin

Tartışmalar

Bu protokol, slaytlar üzerinde güvenilir bir şekilde yüksek kaliteli DRG kesitleri elde etmek için fare DRG'sinin kriyostat kesitleri için adım adım kolay bir prosedür sağlar. Bu protokolde dört kritik adım vardır. İlk olarak, DRG numunesini OCT tabanına koymadan önce DRG numunesi ve cımbız kuru olmalıdır. DRG örneğini çevreleyen herhangi bir sıvı, etrafında bir buz kabuğu oluşturacak ve DRG bölümlerinin OCT'den ayrılmasına ve yukarı doğru kıvrılmasına neden olacaktır. İkincisi, al?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anesthetize animal
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched	Fisherbrand	1910	Hold the OCT section at the bottom
Ergo Tweezers	Fisherbrand	S95310	Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	To collect the DRG section
Marking pens	Fisherbrand	133794	Mark the orientation of base OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.).