Mitokondriyal DNA Sentezi ve Dağılımının Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Nicelleştirilmesi

Özet

mtDNA sentezini ve dağılımını tespit etmek ve ölçmek için çok kuyucuklu bir plaka formatı ve otomatik immünofloresan görüntüleme kullanarak hücrelerdeki mitokondriyal DNA (mtDNA) metabolizmasının dinamiklerini incelemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu, çeşitli inhibitörlerin, hücresel streslerin ve gen susturmanın mtDNA metabolizması üzerindeki etkilerini araştırmak için de kullanılabilir.

Özet

Hücresel süreçlerin büyük çoğunluğu, en yaygın taşıyıcısı ATP molekülü olan sürekli bir enerji kaynağı gerektirir. Ökaryotik hücreler ATP'lerinin çoğunu mitokondride oksidatif fosforilasyon ile üretirler. Mitokondri eşsiz organellerdir, çünkü kopyalanan ve yeni nesil hücrelere aktarılan kendi genomlarına sahiptirler. Nükleer genomun aksine, hücrede mitokondriyal genomun birden fazla kopyası vardır. Mitokondriyal genomun replikasyonu, onarımı ve bakımından sorumlu mekanizmaların ayrıntılı olarak incelenmesi, mitokondri ve tüm hücrelerin hem normal hem de hastalık koşulları altında düzgün çalışmasını anlamak için gereklidir. Burada, in vitro kültürlenmiş insan hücrelerinde mitokondriyal DNA'nın (mtDNA) sentezinin ve dağılımının yüksek verimli nicelleştirilmesine izin veren bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) katılımı ile etiketlenmiş aktif olarak sentezlenmiş DNA moleküllerinin immünofloresan tespitine ve tüm mtDNA moleküllerinin anti-DNA antikorları ile eşzamanlı olarak tespit edilmesine dayanmaktadır. Ek olarak, mitokondri spesifik boyalar veya antikorlarla görselleştirilir. Hücrelerin çok kuyucuklu bir formatta kültürlenmesi ve otomatik bir floresan mikroskobunun kullanılması, mtDNA'nın dinamiklerini ve mitokondrinin morfolojisini nispeten kısa sürede çeşitli deneysel koşullar altında incelemeyi kolaylaştırır.

Giriş

Çoğu ökaryotik hücre için mitokondri, çok sayıda hücresel süreçte çok önemli bir rol oynadıkları için temel organellerdir. Her şeyden önce, mitokondri, hücre^1'in kilit enerji tedarikçileridir. Mitokondri ayrıca hücresel homeostazın (örneğin, hücre içi redoks² ve kalsiyum dengesi³), hücre sinyalizasyonu ^4,5, apoptoz⁶, farklı biyokimyasal bileşiklerin sentezi ^7,8 ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisi^9'un düzenlenmesinde rol oynar. Mitoko....

Protokol

1. SiRNA karışımının hazırlanması

1. Deneyin başlamasından bir gün önce, tohum hücreleri (örneğin, HeLa) 100 mm'lik bir tabakta ertesi gün% 70 -% 90 birleşime ulaşacak şekilde toplanır.
   NOT: Tüm işlemler laminer akış odasında steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
2. Opti-MEM ortamında 140 nM'lik bir konsantrasyona seyreltilmiş uygun miktarda siRNA hazırlayın ( bkz. 96 delikli bir plaka rezervuar olarak kullanılabilir.
3. Siyah 384 delikli hücre kültürü mikroplakasının her bir kuyucuğuna 5 μL siRNA çözeltisi (veya kontrol numuneleri için Opti-MEM ortamı) ekleyin.
   NOT: Test edilen siRNA numunelerinin ....

Tartışmalar

Tarihsel olarak, BrdU birleştirme ve antikor tespiti ile DNA etiketleme, nükleer DNA replikasyonu ve hücre döngüsü araştırmalarında kullanılmıştır 14,27,28. Şimdiye kadar, BrdU etiketli DNA'yı tespit etmek için tüm protokoller, epitop maruziyetini sağlamak ve antikor penetrasyonunu kolaylaştırmak için bir DNA denatürasyon adımı (asidik veya termal) veya enzim sindirimi (DNaz veya proteinaz) içermektedir........

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplate washer	Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (reference gene)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device for cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective	Olympus