Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyona Dayalı İletimi Kullanılarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi

Özet

Klinik öncesi testler için yaygın hasta mutasyonları tarafından yönlendirilen immün yetmez, otokton bir tümör modelinin kullanılması, immünoterapötik testler için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, yaygın hasta mutasyonlarını temsil eden plazmit DNA'nın elektroporasyona dayalı dağıtımını kullanarak beyin tümörü fare modelleri oluşturmak için bir yöntemi açıklar, böylece doğru, tekrarlanabilir ve tutarlı bir fare modeli sağlar.

Özet

Tümör modelleri, yeni ve daha etkili tedavilerin araştırılması açısından beyin tümörlerinin klinik öncesi testleri için kritik öneme sahiptir. İmmünoterapiye büyük ilgi duyulduğundan, beyindeki tümör ve bağışıklık hücresi popülasyonlarını ve tedaviye yanıtlarını incelemek için tutarlı, klinik olarak uygun, immün yetmezliği olan bir fare modeline sahip olmak daha da kritiktir. Klinik öncesi modellerin çoğu, yerleşik tümör hücre hatlarının ortotopik transplantasyonunu kullanırken, burada sunulan modelleme sistemi, bölünen nöral öncü hücrelere (NPC'ler ) eklenen DNA yapılarından kademeli ancak etkili bir gelişimde hastaya özgü tümör mutasyonlarının "kişiselleştirilmiş" bir temsiline izin verir. DNA yapıları, sürücü mutasyonlarının tek kopyalı, somatik mutajenezine izin veren çift rekombinaz aracılı kaset değişimi (MADR) yöntemiyle mozaik analizine sahiptir. Doğum ile 3 günlük arasındaki yeni doğan fare yavruları kullanılarak, NPC'ler lateral ventrikülleri kaplayan bu bölünen hücrelerden yararlanılarak hedeflenir. DNA plazmitlerinin (örneğin, MADR türevi, transpozonlar, CRISPR'ye yönelik sgRNA) ventriküllere mikroenjeksiyonunu, başın rostral bölgesini çevreleyen kürekler kullanılarak elektroporasyon takip eder. Elektriksel stimülasyon üzerine DNA, genoma entegre olma potansiyeli ile bölünen hücrelere alınır. Bu yöntemin kullanımı, en yaygın malign beyin tümörü olan glioblastoma dahil olmak üzere hem pediatrik hem de yetişkin beyin tümörlerinin geliştirilmesinde başarıyla gösterilmiştir. Bu makale, genç fare yavrularının uyuşturulması, plazmit karışımının mikroenjeksiyonu ve ardından elektroporasyon dahil olmak üzere bu tekniği kullanarak bir beyin tümörü modeli geliştirmenin farklı adımlarını tartışmakta ve göstermektedir. Bu otokton, bağışıklığı yeterli fare modeli ile araştırmacılar, etkili kanser tedavisini iyileştirme ve inceleme çabalarında klinik öncesi modelleme yaklaşımlarını genişletme yeteneğine sahip olacaklar.

Giriş

Murin beyin tümörü modelleri, beyin tümörü oluşum ve tedavi mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Mevcut modeller tipik olarak, uygun immünoterapi çalışmalarını engelleyen immün yetmezliği olan fareler kullanılarak, sınırlı sayıda sürücü mutasyonuna veya hastadan türetilen ksenogreft modellerine dayalı olarak, yaygın olarak kullanılan tümör hücre hatlarının hızla üretilen deri altı veya ortotopik transplantasyonlarını içerir 1,2,3,4. Ek olarak, bu klinik öncesi sonuçlar yanlış pozitiflere yol açabilir, çünkü bu tür modeller tedaviye yanıt olarak dramatik, çoğu zaman iyileştirici etkiler gösterebilir, ancak bu klinik 2,5,6,7'ye dönüşmez. Hasta mutasyon imzalarını daha fazla yansıtan, genetiği değiştirilmiş klinik öncesi fare modellerini hızlı bir şekilde üretme yeteneğine sahip olmak, klinik öncesi sonuçların geçerliliğini artırmak için zorunludur.

Hem fonksiyon kaybı (LOF) hem de fonksiyon kazancı (GOF) mutasyonlarını indüklemek için DNA plazmitlerinin elektroporasyon (EP) tabanlı iletimi, bu tür modellerin üretilmesine izin verir. Çift rekombinaz aracılı kaset değişimi veya MADR⁸ ile mozaik analizi adı verilen GOF sürücü mutasyonlarının daha kesin bir temsili için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, ilgilenilen bir genin (veya genlerin) somatik hücrelerde kontrollü, lokusa özgü bir şekilde ekspresyonuna izin verir⁸. Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gibi diğer moleküler araçlarla kombinasyon halinde, fare beyin tümörü modelleri geliştirmek için farklı hasta mutasyonları birleştirilebilir. Bu yöntem, gliomlar ve ependimomlar⁸ dahil olmak üzere farklı pediatrik beyin tümörlerinin yanı sıra glioblastoma (GBM) gibi yetişkin beyin tümörü modelleri için kullanılmıştır.

EP tümör modelleme yöntemi bir nakil kadar yaygın olmasa da, aşağıdakiler şimdiye kadar bu modelleme sisteminin kolaylığını ve yüksek tekrarlanabilirliğini göstermektedir. mTmG fareleri, MADR-plazmid DNA ^8,9'un eklenmesi için kullanılır. Bu sistem, donör DNA plazmidinin (yani, ilgilenilen GOF geni) daha sonra eklenmesi için Rosa26 lokusunda bulunan loxP ve Flp rekombinaz hedef (FRT) bölgelerinin rekombinasyonuna izin ^verir8,9. Aşağıdaki protokol, gayretli bir uygulamadan sonra bu yöntemin basitliğini ve fare beyin tümörü modellerini otokton, tutarlı bir şekilde geliştirme yeteneğini göstermektedir.

Protokol

Bu protokoldeki tüm prosedürler Cedars Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Homozigot mTmG fareleri, aşağıdaki protokolde kullanılmak üzere karışık cinsiyetli, heterozigot mTmG farelerinin yavrularını elde etmek için C57BL / 6J farelerle yetiştirildi. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Fare yavruları doğum sonrası 0. ve 3. günler arasında elektroporasyona tabi tutuldu (P0-P3).

1. Cerrahi kurulum

1. Ameliyat masasına kimyasal dezenfektan (örneğin Vimoba) püskürtün ve silin, ardından %70 etanol ekleyin ve tekrar silin.
2. Aşağıdaki aletleri/malzemeleri ameliyat masasına yerleştirin: çekilmiş cam kılcal pipetler (pipetlerin nasıl çekileceği ile ilgili referans^10'a bakın), küçük makaslar, küçük biyolojik tehlike kesici alet atık kabı, mikrolitrelik pipetleyici ve pipet uçları, 2x kesilmiş kare parafin film parçaları, elektrot jeli, elektrotlar, mikroenjektör tutucu ve DNA plazmit karışımı (bkz.
3. Aşağıdaki ataşmanları, belirtildiğinde ameliyat masasındaki veya zemindeki ekipmanın üzerine yerleştirin: mikroenjektör kontrol paneli, makineye takılı tutucu ve fiş, mikroenjektör tutucuyu yana tutmak için stand (lehimleme yardımcısı), mikroenjektör ayak pedalı (yerde), makineye bağlı elektrotlar ve elektrot ayak pedalı (zeminde) (bkz.
   NOT: Elektrot ayak pedalı, kullanım sırasını hatırlatmak için mikroenjektör ayak pedalının sağına yerleştirilmiştir.
4. Mikroenjektör ve elektrot kontrol panellerini açın.
   1. Mikroenjektör üzerindeki ayarların deney için doğru olup olmadığını kontrol edin: plazmit karışımının nasıl alındığına bağlı olarak basınç 220-450 hPa arasında olmalıdır.
   2. Elektrot panelindeki ayarların deney için doğru olup olmadığını kontrol edin.
      NOT: Mevcut deney (ve beyin tümörü modellerimizin çoğu) için, 120 V'luk (50 ms; 950 ms ile ayrılmış) beş darbe kullanılmıştır.

2. Ameliyat öncesi hazırlık

1. Plazmid karışımını mikroenjektörde hazırlayın.
   1. Çekilmiş bir cam kılcal pipeti alın ve mikroenjektör tutucusuna yerleştirin. Yerinde tutmak için ucun vidalandığından emin olun.
   2. Mikroenjektör tutucuyu bir elinizle, küçük makası diğer elinizle tutun; Pipetin ucunu küçük bir keskin biyolojik tehlike kabının üzerine koyun. Makas kapalıyken, uzatılmış cam kılcal pipete hafifçe bastırın. Bükümün görüldüğü yerde, açıklıktan yaklaşık 2 mm uzakta kesin. Kesim başarılı görünüyorsa, dikkatlice yana yerleştirin.
   3. Piyasada bulunan plazmid karışım tüpünü ameliyat masasına düz bir şekilde yerleştirin ve açın. Plazmid karışımını hazırlarken sabit tutmak için pipet ucu kutusunu veya başka bir öğeyi tüpün tabanının arkasına yerleştirin. Mikroenjektör hattına bağlı cam pipeti masanın üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve ucun tüpün dibine yakın karışımda iyice olduğundan emin olarak plazmit karışımının tüpüne yavaşça yerleştirin.
      NOT: Doğal yerçekimi emişi nedeniyle, plazmit karışımı emişi, aktif olarak çekilmeden önce cam pipette başlayacaktır.
   4. Plazmit karışımındaki cam pipetin ucuyla, çekilen miktarı artırmak için mikroenjektör panelini kullanın. 0'dan başlayarak, sağ düğmeyi çevirin ve -60'a doğru negatif yönde çevirin - bu, plazmit karışımını cam pipete getirecektir. Sadece ~ 1 inç plazmit karışımı getirin. Düğmeyi tekrar 0'a çevirin ve ardından pipet ucunu karışımdan çıkarın.
      NOT: Negatif yöndeyken pipet ucunu karışımdan çıkarmayın, çünkü bu, karışımı mikro enjektöre ve muhtemelen boruya fırlatacaktır.
   5. Karışımı bir parafin film şeridine enjekte ederek bir enjeksiyondaki karışım miktarını test edin. Karışımı parafin filmine enjekte etmek için ayak pedalını kullanın ve bir kez basın. Tam olarak 1 μL olup olmadığını görmek için karışımı parafin filmine almak için 1 μL'ye ayarlanmış pipetleyiciyi kullanın.
      NOT: 1 μL'den biraz daha azsa, mikroenjektörün basıncı artırılabilir. Basınç 450 hPa'ya yaklaşıyorsa ve hala 1 μL'den azsa, cam pipet açıklığı çok küçüktür ve daha fazla kesilmesi gerekecektir. Kırpmadan önce plazmit karışımının tekrar tüpe yerleştirilmesi önerilir. Buna rağmen, makas üzerinde hala bir kalıntı karışım olacaktır, bu nedenle kalan karışımı çıkarmak için makası daha sonra DNase ile iyice temizlemek zorunludur. Enjeksiyon 1 μL'den fazlaysa, yeni bir çekilmiş cam pipetin kullanılması ve kesilmesi gerekecektir. Test miktarı tam olarak 1 μL olduğunda, cam pipet ucu doğru boyuttadır.
   6. Prosedür için ek plazmit karışımı veya çekilen cam pipete yaklaşık 2-3 inç çekmek için 2.1.4 adımını tekrarlayın. Karışımın, ucunun görülemeyeceği, mikroenjektörün içine çok fazla girmediğinden emin olun.
      NOT: Plazmid karışımını çizerken hava kabarcıklarından kaçınmak çok önemlidir. Kabarcıklar varsa, plazmit karışımını çekilen cam pipetten çıkararak ve yeniden başlayarak bu adımı yeniden yapmak gerekir. Mevcut hava kabarcıkları, yavrunun ventrikülüne enjekte edilirken aşağıdaki adımlara zarar verecektir.
   7. Plazmid karışımı çekilmiş cam pipette hazırken, hazırlanan pipeti yanlışlıkla dokunmamak/çarpmamak için lehimleme yardımı standının yan tarafına ve yoldan uzağa yerleştirin.
2. Hayvanları deney için hazırlayın.
   1. Anestezi uygulayan yavrular için bir buz kovası hazırlayın. Eritmek için buz kovasına su ekleyin ve anestezi tutucuyu (örn. pipet kutusu üstü) soğutmaya yardımcı olun.
   2. Soğuması için kutunun üstünü erimiş buzun üzerine yerleştirin.
   3. Yavruları kafesten dikkatlice çıkarın ve buzun üzerinde kalan soğutulmuş kutunun üstüne yerleştirin. Soğutma işlemine yardımcı olmak için alt kısma gevşek bir şekilde başka bir üst kısım yerleştirin.
   4. 2-3 dakika sonra yavruları kontrol edin. Yüzüstü pozisyonda kalarak yavruları birbirinden ayırın.
      NOT: Yavrular kıvranacak, ancak soğuk anestezi devreye girdiğinde bu yavaşlayacaktır. Yavruların kolay görüntülenmesi için kutunun üst kısmı kapalı bırakılabilir.
   5. Uygun anestezi olup olmadığını kontrol etmek için yavrunun kuyruğunu sıkıştırın ve bir reaksiyon arayın. Bir reaksiyon varsa, 2.2.4 adımını tekrarlayın. Gıcırtı yoksa veya çok az hareket yapılırsa, yavru prosedür için hazırdır.
      NOT: Fareler, işlemden sonra iyileşme yeteneklerini etkileyeceğinden uzun süre buz üzerinde tutulmamalıdır. Bir seferde sadece anestezi altındayken hem enjekte edilebilen hem de elektropore edilebilen yavru sayısı buza konulmalıdır; Tecrübe ile daha büyük sayılar yapılabilir.

3. DNA plazmit karışımının beyin ventrikülüne mikroenjeksiyonu

1. Ventral pozisyonda masanın üzerine bir yavru yerleştirin.
2. Kafatası dikişlerini deriden görselleştirmek için başın arkasını hafifçe geriye doğru çekin. Kafatasında lambda bulun. Ventrikül/enjeksiyon bölgesi lambda ve gözün ortasında olacaktır.
   NOT: Lambda, sagital ve lambdoid sütürlerin kesiştiği yerdir. Fare kafatasındaki lambdanın tanımlanması için referans^11'e bakın.
3. Cam pipet ucuyla cildi dik bir açıyla delin (pipet tavana doğru dümdüzdür). Kafatasına bastırırken hafif bir içbükey girinti ve ilk direnç gözlemleyin. Delindikten ve cam pipet ucu içbükey girintiden geçtikten sonra uygun enjeksiyon seviyesine ulaşılır.
4. Cam pipet ucunu yerinde tutun ve 1 μL plazmit karışımı enjekte etmek için mikroenjektör ayak pedalına bir kez basın.
   NOT: Enjeksiyonun başarılı olduğunu net bir şekilde görmenin iki yolu vardır. İlk olarak, başka bir laboratuvar üyesinin plazmit karışımının enjekte edilirken cam pipete inmesini izlemesini sağlayın. Ayrıca, plazmit karışımında hızlı yeşil veya başka bir boya kullanılıyorsa, boya enjekte edildikten sonra derinin altındaki ventrikülde gözle görülür şekilde yayılır ve bir cerrahi lambaya tutulduğunda kolayca görülebilir.

4. Elektroporasyon

1. Masanın üzerine bir parça parafin filmi (bir kare) yerleştirin ve filmin üstündeki elektrot jelini sıkın. Her bir kürek üzerine bol miktarda fırçalayarak elektrot kanatçıklarını elektrot jeli ile kaplayın. Damlayan fazla jel bir kağıt havlu üzerinde kaydırılabilir.
   NOT: İlk EP'den sonra, her bir kürekten gelen jelin diğer tarafa temas etmesine izin vermeyin. Bu, yükü aktarır ve yavrunun kafasına uygulanırken cızırtılı bir ses duyulabilir. Bu, bir elektrottan yavrunun kafasındaki jel, diğerinden gelen jel ile temas ederse de olur.
   DİKKAT: Elektroporasyon sırasında parmakları küreklerden uzak tutmaya özen gösterilmelidir.
2. Yavrunun vücudunu bir elinizle (tipik olarak baskın olmayan el) tutun ve parmakları başın arkasında tutun.
   NOT: Sağ elini kullanıyorsa, yavruyu sol elinizle, elektrotları sağ elinizle tutmak en kolay yoldur. Solaksanız, tam tersini yapın.
3. Pozitif elektrot başın dışında ventrikülün hedeflendiği yerde olacak şekilde uygun pozisyonda olduklarından emin olmak için elektrotları yavrunun kafasına yaklaştırın (örneğin, sol ventrikülü hedefliyorsanız, pozitifi yavrunun sol tarafına ve negatifi yavrunun sağ tarafına yerleştirin). Elektrotları yerleştirirken, başın yerine kaldırılmasına yardımcı olmak için bir parmağınızı (tipik olarak başparmağınızı) vücudun dorsal tarafında/boynun arkasında, başın arkasına hafifçe kaydırın.
4. Kuyruğu sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin ve sadece yavru uygun anestezi düzlemindeyse elektroporasyona devam edin. Elektrot küreklerini fare kafasının rostral kısmındaki hafifçe sıkın ve gözlerin üzerine yerleştirin. Elektroporasyonu başlatmak için elektrot ayak pedalına bir kez basın. Bu protokol, 120 V'luk beş darbe kullanır (50 ms, 950 ms ile ayrılmış); Her nabız duyulabilir.
   1. Her darbede, elektrot kanatlarını saat yönünün tersine hafifçe döndürün, böylece pozitif kanat başın tepesine doğru hareket eder.
      NOT: Uygun elektroporasyon ile, her nabızda fare yavrusunun vücudunun seğirdiğini hissedecek/görecektir.
5. Son darbeden sonra kürekleri çıkarın ve yana yerleştirin. Yavruyu temiz bir kağıt havluya taşıyın ve başka bir laboratuvar üyesinin jeli yavrunun kafasından temizlemesini ve bir kağıt havlu "teknesi" üzerindeki bir ısı lambasının altına yerleştirmesini sağlayın.
   NOT: Isı lambasının yavrulara çok yakın olmadığından emin olun. Bu adımda başka bir laboratuvar üyesinin yardım ettiğinden emin olun ve yavrulara sürekli göz kulak olun. Yavruların ısısını artırmak için genellikle yavruları ısı lambasının altında elinde tutmaya yardımcı olur. Yavrunun karnına hafifçe masaj yapmak da iyileşmeye yardımcı olabilir.
6. Vücutları sağlıklı pembemsi bir renge sahip olduğunda ve hafif bir kuyruk tutamına gıcırtılı bir tepki verdikten sonra yavruları ev kafesine geri koyun.
   NOT: Onları kafese geri koymadan önce, az miktarda ev kafesi yatak malzemesi alın ve kafes kokusu için yavruları hafifçe fırçalayın. Yavruları yatak malzemesinin altındaki kafese geri koyun ve bekleme odasına geri dönün.

5. Ameliyat sonrası adımlar

1. Kullanılmayan plazmid karışımını mikroenjektör cam pipetinden tüpe geri koyun. Yeterli karışım kaldıysa, bu gelecekteki prosedürlerde kullanılabilir. -20 °C'de saklayın.
2. Elektrot küreklerindeki jeli kağıt havluyla silin.
3. Tüm ekipman parçalarını orijinal yerlerine geri koyun.
   NOT: Plazmit karışımı alındıktan sonra cam pipet ucunu kesmek için makas kullanılmışsa, DNase çözeltisi ile iyice temizlemek için makası dışarıda bırakın.
4. Masaya kimyasal bir dezenfektan püskürtün, ardından silin, ardından %70 etanol püskürtün, ardından tekrar silin.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokol, hem pediatrik hem de yetişkin beyin tümörü fare modellerini başarılı bir şekilde geliştirmek için kullanılmıştır ve ilki Kim ve ^ark.8'de ayrıntılı olarak yayınlanmıştır. Uygun teknik ve plazmit tasarımının dikkatli bir şekilde planlanması ile tümörlerin EP gelişimindeki başarı tipik olarak %100'dür. Histoloji, bir raportör protein kullanıldığında başarılı DNA plazmit eklemesini kontrol etmenin en hızlı ve en kolay yoludur. B...

Tartışmalar

Plazmid DNA'nın elektroporasyona dayalı iletimi, genetiği değiştirilmiş fare modellerinde kullanılana benzer, ancak viral transdüksiyonun hızı, lokalizasyonu ve verimliliği ile moleküler biyolojinin in vivo kullanımına izin verir 8,13,14. Bununla birlikte, ikincisi ile birlikte, güvenlik endişeleri ve bağışıklık tepkileri gelir. Plazmid DNA'nın EP iletimini kullanan modelleme sistemimizde, cam kıl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH